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刚地弓形虫ROP16基因的克隆及生物信息学分析
目的 构建刚地弓形虫棒状体蛋白16(TgROP16)真核重组表达载体,对TgROP16基因编码蛋白进行生物信息学分析. 方法 提取刚地弓形虫总RNA,根据TgROP16基因的开放阅读框架设计引物,采用逆转录PCR(RT-PCR)扩增ROP16基因,经EcoR I、Not I酶切后连接入真核表达载体pVAX1中,连接产物转化大肠埃希菌(E.coli)XL1-Blue.提取阳性菌落质粒,进行PCR、双酶切鉴定及基因测序,对所获序列进行生物信息学分析. 结果 TgROP基因RT-PCR扩增产物与预期一致,大小约为2 100 bp.重组质粒经PCR及双酶切鉴定构建正确.测序显示获得的TgROP16基因片段为2 124 bp,与GenBank已收录的弓形虫ROP16基因序列(登录号为GQ249093.1)比对,一致性为99.8％.预测其编码蛋白TgROP16为非跨膜分泌蛋白,含707个氨基酸,分子式为C3343H5339N967O1024S2,分子质量单位为76.1352 ku,理论等电点为9.18;在TgROP16蛋白的二级结构中α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲分别占比35.79％、14.29％、7.07％和42.86％;含多个可形成卷曲螺旋构象的区域与可成为磷酸化位点的氨基酸残基,存在信号肽序列,含39个B细胞抗原表位、24个CTL细胞抗原表位及33个Th细胞抗原表位. 结论 成功构建了pVAX1ROP16真核表达重组质粒,生物信息学分析表明其编码蛋白TgROP16具有良好的抗原性及免疫原性,有望作为弓形虫疫苗候选分子.
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弓形虫Ⅰ、Ⅱ型虫株ROP16基因重组表达载体的构建及其对A549细胞STAT3/6磷酸化水平的影响
目的 探索弓形虫Ⅰ、Ⅱ型虫株ROP16在A549细胞中的功能. 方法 提取弓形虫Ⅰ(RH)、Ⅱ(ME49)型虫株总RNA,PCR扩增ROP16基因全长序列后克隆至真核表达载体pEGFP-N1,转染A549细胞,采用Western blot方法检测细胞中STAT3/6磷酸水平,采用实时荧光定量PCR检测IL-12、iNOS、ARG1mRNA表达水平. 结果 PCR扩增Ⅰ、Ⅱ型虫株ROP16基因全长为2148bp.双酶切和测序验证重组载体构建正确,pEGFP-N1-RH ROP16和pEGFP- N1-ME49ROP16过表达载体转染A549细胞后ROP16mRNA表达水平较未转染组上调(P＜0.05,F=824.184, 270.904),pEGFP-N1-ME49ROP16转染A549细胞p-STAT3/6表达水平与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05,F =1.051,1.203),IL-12 、iNOS mRNA 与对照组表比呈高表达(P＜0.01,F=157.705,173.623).pEGFP-N1-RH ROP16转染组相比A549细胞对照组p-STAT3/6表达水平上调(P＜0.05,F=121.227,68.324),IL-12mRNA表达下调(P＜0.01,F=186.397),ARG1mRNA表达上调(P＜0.01,F=126.236). 结论 弓形虫Ⅰ型RH 株ROP16蛋白具有激活p-STAT3/6作用,且能使ARG1mRNA 的表达上调,IL-12mRNA的表达下调,而弓形虫Ⅱ型ME49虫株 ROP16蛋白则无激活p-STAT3/6作用,但能使IL-12mRNA和iNOS mRNA的表达上调.
关键词： 弓形虫 ROP16 A549人肺腺癌细胞 重组质粒 -
刚地弓形虫棒状体蛋白ROP16对小鼠脑神经细胞凋亡的影响
目的 构建带有Flag标签的刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)棒状体蛋白16 (ROP16)的重组慢病毒表达质粒,并检测ROP16蛋白在神经细胞中的表达及其对小鼠脑神经细胞凋亡的影响. 方法 PCR扩增带Flag标签的ROP16基因,克隆至慢病毒载体,构建重组质粒pCDH-copGFP-ROP16-Flag,转化至大肠埃希菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞,采用PCR、双酶切及测序验证.将重组质粒转染至人胚胎肾上皮细胞(293T细胞)中进行慢病毒包装,以pCDH-CMV-copGFP空质粒对照组,荧光显微镜下观察绿色荧光表达情况,并计算慢病毒滴度.将包装后的慢病毒感染人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y),采用蛋白质印迹(Western blot-ting)检测ROP16蛋白的表达情况.应用立体定位注射技术将慢病毒浓缩液注射至小鼠前额叶皮层M1区.2周后取小鼠脑组织,制备冰冻切片,TUNEL染色后,荧光显微镜下观察小鼠脑神经细胞凋亡情况. 结果 重组慢病毒表达质粒pCDH-copGFP-ROP16-Flag经PCR和双酶切后均获得大小为2 200 bp的条带,与预期值相符;测序结果与刚地弓形虫RH株ROP16基因(GenBank登录号为GQ249093.1)序列比对完全一致.包装后的慢病毒在荧光显微镜下可见绿色荧光,滴度约为2E+8 TU/ml.Western blotting分析结果显示,在相对分子质量(Mr)120 000处有特异条带,重组慢病毒表达质粒能够在SH-SY5Y细胞内表达ROP16蛋白.感染慢病毒的小鼠脑组织冰冻切片经TUNEL染色后,荧光显微镜下可见实验组凋亡的细胞明显多于空质粒对照组. 结论 构建的慢病毒表达质粒pCDH-copGFP-ROP16-Flag可在神经细胞内表达ROP16蛋白,并可导致小鼠脑神经细胞凋亡.
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弓形虫棒状体蛋白ROP16的研究进展
棒状体蛋白16(ROP16)是弓形虫棒状体蛋白家族成员,其蛋白结构存在丝氨酸、苏氨酸激酶区,是弓形虫入侵过程中的重要毒力因子.ROP16可分泌到宿主细胞核,能磷酸化宿主细胞的转录活化因子STAT3/6,干扰宿主细胞信号通路传导,在弓形虫入侵宿主细胞过程中发挥着重要作用.本文对弓形虫ROP16的发现、功能、免疫保护性等方面进行综述.
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徐州猫源弓形虫株基因型及其毒力研究
目的 了解猫源弓形虫株基因型和毒力,为研究其致病机制奠定基础.方法 自江苏徐州诱捕采集40只流浪家猫,昆明小鼠腹腔接种分离弓形虫;采用PCR-RFLP法对10个基因分型位点(SAG1、SAG2、SAG3、BTUB、GRA6、c22-8、c29-2、L358、PK1及Apico)进行PCR扩增,扩增产物用相应的限制性核酸内切酶水解后观察分析电泳图谱;将分离的虫株分别感染SPF级BALB/c小鼠和昆明鼠,观察其存活时间和存活率,分析毒力强弱.选取弓形虫的毒力相关效应分子ROP16和GRA15,PCR扩增出基因序列,比较其多态性.结果 共获得6株猫源弓形虫虫株,基因分型结果显示,两株为Chinese 1型(即ToxoDB#9型),4株为ToxoDB#205型;此6株弓形虫虫株对BALB/c小鼠和昆明鼠均有较强的毒性,两种小鼠分别在感染后5～7d和9～12d均100％死亡.毒力相关基因GRA15和ROP16的分析显示,Chinese 1型虫株为GRA15Ⅱ和ROP16 Ⅰ/Ⅲ型,ToxoDB#205型虫株为GRA15Ⅱ和ROP16Ⅱ型.结论 徐州地区猫源弓形虫虫株具有有限遗传多态性,且均为强毒的虫株.ToxoDB#205型虫株的主要毒力效应分子ROP16Ⅱ不同于Chinese 1型虫株,这一毒力相关基因的多态性与其毒力的关系尚待深入研究.
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弓形虫ROP16Ⅱ效应分子对宿主A549细胞基因表达谱的影响
目的 ROPl6在弓形虫入侵宿主细胞的过程中发挥着关键作用.为了提高ROP16对宿主细胞的分子功能的认识,本研究分析了ROP16 Ⅱ基因转染的A549细胞株的表达谱,筛选了新的候选基因,为揭示Ⅱ型弓形虫病的发病机制提供了依据.方法 通过表达谱芯片技术对过表达ROP16 Ⅱ的A549细胞株的表达谱进行研究,并从中筛选差异表达基因.利用ToppGene从差异表达基因中筛选候选基因,并通过RT-qPCR对获得的基因进行验证.结果 共获得了9 994个差异表达基因,其中上调的基因有4 293个,下调的基因有5 701个.将这些差异表达基因进行GO功能富集分类,主要涉及多种生物学过程,包括发育过程、生物调控、免疫应答和信号传导等过程.采用ToppGene筛选得到4个疾病候选基因,其中上调表达的有IL4R和STAT1;下调表达的有IL12RB1和IL2RG.RT-qPCR结果与表达谱芯片数据一致.结论 ROP16 Ⅱ入侵宿主细胞后影响宿主细胞基因表达谱,了解ROP16Ⅱ的作用机制,对于更加全面地揭示Ⅱ型弓形虫病的发病机制具有重要意义.
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弓形虫多态性ROP16效应分子诱导宿主A549细胞基因表达谱的差异研究
目的 探讨弓形虫Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型 ROP16对宿主基因表达谱的影响及其意义.方法 以 A549细胞株为研究模型,建立弓形虫Ι、Ⅱ和Ⅲ型ROP16稳定转染的A549细胞株,通过表达谱芯片技术筛选差异表达基因,并对差异基因进行GO分析和Pathway通路分析.结果 对差异基因进行聚类,发现 ROP16Ⅰ转染组776个基因表达上调,494个基因表达下调;ROP16Ⅲ转染组842个基因表达上调,520个基因表达下调;而ROP16Ⅱ转染组5063个基因表达上调,5989个基因表达下调.另外,ROP16Ⅰ/Ⅲ转染组基因表达谱相似.而 ROP16Ⅱ转染组则不同,表达谱差异显著.对 ROP16Ⅱ转染组差异基因进行 Path-way通路分析发现,显著改变的通路共有74条,其中 ROP16Ⅱ单独调控的信号通路有19条,主要与 NF-κB、Toll 样受体,趋化因子等信号通路、炎症反应及免疫调节和代谢等相关.结论 ROP16入侵宿主细胞核后影响宿主细胞基因表达谱.同Ι、Ⅲ型弓形虫相比,Ⅱ型弓形虫在基因组上的差异导致其具有独特的差异基因表达谱和信号通路,了解其单独调控的信号通路对于Ⅱ型弓形虫的防治具有重要意义.
