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独行菜C4H基因克隆与表达分析
以独行菜(Lepidium apetalum)为材料,通过分析独行菜转录组数据,设计特异性引物,克隆了独行菜肉桂酸-4-羟化酶(cinnamate-4-hydroxylase,C4H)基因的cDNA序列,命名为LaC4H,GenBank登录号为KX064050,并进行生物信息学分析,原核表达、纯化,组织特异性分析和诱导表达分析.结果表明:①LaC4H基因开放阅读框(ORF)长1518 bp,编码505个氨基酸,其蛋白质分子质量为57.73kD.②生物信息学分析显示LaC4H蛋白包含细胞色素P450的保守基序和5个特征性底物结合位点,是细胞色素P450超家族成员,系统进化分析显示LaC4H蛋白与拟南芥等十字花科植物C4H蛋白同源性较高.③通过构建原核表达载体pET-32a-LaC4H在大肠杆菌BL21 (DE3)菌株中成功表达LaC4H重组蛋白,利用Ni2+亲和色谱得到了纯化的LaC4H重组蛋白.④荧光定量PCR结果表明LaC4H基因在茎中表达量高,叶和花中次之,根中表达量低.经茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)诱导后,叶中LaC4H表达量明显上升,诱导后48 h达到高值,叶中LaC4H的表达量与黄酮含量之间呈正相关.这为进一步研究LaC4H基因在独行菜黄酮类化合物生物合成途径中的功能奠定基础.
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金银花DNA去甲基化酶基因的生物信息学分析
DNA去甲基化酶基因广泛存在于植物中,本文主要通过生物信息学的方法从金银花转录组中获得4个DNA去甲基化酶基因,分别为LJD ME1、LJDME2、LJD ME3和LJDME4,并预测其编码蛋白的理化性质和表达模式.系统进化树结果表明LJD ME1、LJDME2聚为一类,LJD ME、LJD ME聚为一类,与拟南芥中的DME关系更为密切.基因表达分析表明,4个DNA去甲基化酶基因在变种间差异表达明显,LJD ME1、LJDME2基因表达水平在红金银花中高于金银花,推测其可能参与调控金银花活性成分积累的过程,并且4个DNA去甲基化酶基因具有组织表达特异性.本研究为进一步解析金银花中DNA去甲基化酶的功能奠定了基础.
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雷公藤甾醇C-24甲基转移酶(TwSMT2)的cDNA克隆及表达分析
24-烷基甾醇具有构成膜结构和调节植物生长发育的作用,本研究根据雷公藤悬浮细胞转录组数据,克隆得到雷公藤甾醇生物合成途径上的一个重要限速酶:甾醇C-24甲基转移酶(SMT),其cDNA全长1631 bp,开放阅读框1 080 bp,编码359个氨基酸.在线预测所编码蛋白的理论等电点为6.43,分子质量为40.0 kDa.生物信息学分析结果将此SMT基因归为SMT2家族.进一步构建pMAL-c2X-TwSMT2重组质粒并转化大肠杆菌BL21(DE3),茉莉酸甲酯诱导表达分析结果显示:相比于对照组,经诱导后的TwSMT2基因在24 h处有显著提高.SDS-PAGE及Western blot检测蛋白表达结果显示,IPTG可诱导表达出TwSMT2蛋白.本研究首次克隆得到TwSMT2基因,并获得重组蛋白,为进一步阐述雷公藤甾醇生物合成途径奠定基础.
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三七病程相关蛋白1基因的克隆与表达分析
在生物信息学分析基础上,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法从三七中获得病程相关蛋白1(pathogensis-related protein 1,PRI)基因的开放阅读框,命名为PnPR1,测序结果显示该序列长501 bp,编码166个氨基酸,其蛋白质分子质量为18.1 kD.利用NCBI/Blastp和BioEdit软件进行同源性比对显示,PnPR1基因编码蛋白与葡萄、烟草、番茄等高等植物中的PR1蛋白同源性较高,且具有相同的富含半胱氨酸蛋白的保守结构域.将构建的重组载体pET28a(+)-PnPR1在宿主菌Escherichia coli BL21中经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白,在不同诱导时间、诱导温度、IPTG诱导浓度和IPTG添加时间下对诱导条件进行优化.十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析结果表明,PnPR1基因编码蛋白的佳诱导条件为:IPTG终浓度0.4 mmol·L-1、IPTG添加时间为转接后4h、诱导温度28℃、诱导时间20 h.这为蛋白纯化及单克隆抗体的制备奠定了一定的基础.
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日本蟾蜍TAGLN2 cDNA的克隆与生物信息学分析
为研究蟾蜍皮肤中多肽类有效成分,通过菌落PCR (polymerase chain reaction)对日本蟾蜍(Bufojaponicus formosus)皮肤cDNA质粒文库进行筛选,对测序结果进行分析及同源性比较,获得转胶蛋白-2(transgelin-2,TAGLN2)的5'端缺失的部分cDNA序列(GenBank登录号为JX197456),长为997bp,包括348 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF)、5’端31 bp及3’端618bp的非翻译区(untranslated region,UTR),编码由115个氨基酸残基组成的蛋白质.推导的氨基酸序列含有一个调宁蛋白同源性结构域(calponin homology,CH)、两个可形成二硫键的半胱氨酸残基、3个α螺旋区域和5个潜在的磷酸化位点.氨基酸序列同源性分析显示,本文获得的日本蟾蜍N-端截短型TAGLN2与热带爪蟾(Xenopus (Silurana) tropicalis)和非洲爪蟾(Xenopus laevis)相对应部分的同源性分别为90％和89％,与其他7种动物的同源性介于71％～85％之间.
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子宫内膜异位症相关基因和microRNA的挖掘及生物信息学分析
目的 应用生物信息学方法分析和预测子宫内膜异位症(EMs)患者相关基因的表达,为进一步在基因水平上揭示EMs的本质和发现药物治疗靶点、开发新型的治疗药物提供新的依据.方法 在公共基因芯片数据库(GEO)中下载EMs相关基因数据,应用protparam、MotiScan、SignalP 4.0、NetPhos 2.0、TMHMM、GO、KEGG、STRING、BRB-Array Tools软件等生物信息学技术进行数据挖掘和生物信息学分析研究.结果 共筛选出91个EMs相关基因以及54个microRNA.这些EMs基因主要与细胞增殖调控、细胞凋亡调控、趋化作用等过程有关.蛋白质网络互作预测得到了19个重要的EMs相关蛋白质靶标,联合靶基因的数据挖掘,发现了134个EMs相关的靶基因.结论 用生物信息学方法分析基因芯片数据可以获取生物的内在信息,为子EMs的早期诊断提供了新的诊断标志物和思路.
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黄花蒿HDS基因的克隆与功能分析
目的 克隆获得黄花蒿MEP途径中必需关键酶——羟甲基丁烯基-4-磷酸合成酶基因(HDS),并进行生物信息学分析和功能互补分析研究.方法 对已知的其他种子植物HDS基因的核苷酸序列进行多重序列比对,选取保守区域设计简并引物,利用同源扩增和cDNA末端快速扩增技术从黄花蒿中获得目的基因；利用BLAST进行序列比对,ORF Finder寻找开放阅读框,并用MEGA3.0中的临位相联法构建进化树.结果 得到1条长2324 bp的HDS cDNA序列,其ORF 框长1854 bp,编码617个氨基酸残基的蛋白；生物信息学分析显示,黄花蒿HDS基因AaHDS与其他种子植物来源的HDS高度同源;功能互补分析表明,AaHDS能互补突变菌株Escherichia coli MG1655 ara＜＞ HDS中缺失的HDS功能,使突变菌株恢复生长,证明AaHDS具有典型的HDS基因功能.结论 首次克隆获得黄花蒿HDS基因,为青蒿素的代谢工程研究提供相应的基础.
关键词： 黄花蒿 羟甲基丁烯基-4-磷酸合成酶基因 基因克隆 生物信息学分析 青蒿素 -
建泽泻鲨烯合酶基因克隆及其生物信息学分析
目的 对建泽泻原萜烷型三萜类成分生物合成关键酶鲨烯合酶(squalene synthase,SS)进行基因全长的克隆和生物信息学分析.方法 以建泽泻总RNA为模板,运用同源克隆法和RACE技术克隆建泽泻SS基因的cDNA全长,并通过DNAMAN软件及ExPASy在线分析等方法对其进行生物信息学研究.结果 获得建泽泻SS基因全长cDNA,GenBank注册号为JX866770,序列分析表明,所克隆的cDNA序列全长为1577bp,包含一个长1230bp的开放阅读框架,编码409个氨基酸的蛋白,与其他药用植物具有较高的同源性.预测该蛋白的相对分子质量为4.68×104,等电点为5.97,无信号肽,包含2个富含天冬氨酸(DXXDD)的保守功能域.结论 首次克隆获得建泽泻SS基因的全长cDNA,为泽泻原萜烷型三萜类成分生物合成途径阐明与生物工程应用提供科学依据.
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川西獐牙菜牻牛儿基焦磷酸合成酶基因的克隆及表达分析
目的 从川西獐牙菜Swertia mussotii中克隆牻牛儿基焦磷酸合成酶(SmGPPS)编码基因,并进行生物信息分析及该基因的表达研究.方法 根据川西獐牙菜转录组SmGPPS基因序列,设计特异性引物,通过RT-PCR扩增得到cDNA序列,通过生物信息对该序列进行分析;构建原核表达载体pET-28a-SmGPPS,转入大肠杆菌BL-21 (DE3)中,在37℃、1mmol/L IPTG诱导下进行表达.采用半定量RT-PCR方法检测SmGPPS基因在川西獐牙菜不同组织中的表达强度.结果 SmGPPS cDNA全长1119bp,编码372个氨基酸.并对其蛋白二级、三级结构进行了分析和预测.SmGPPS蛋白与其他植物中GPPS蛋白具有高度的相似性.SDS-PAGE结果表明所表达蛋白与预期蛋白大小一致.半定量RT-PCR结果表明SmGPPS在叶中表达量高.结论 为进一步研究该基因的功能和利用基因工程手段提高川西獐牙菜中环烯醚萜类化合物产量提供了基础.
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灰毡毛忍冬MADS-box基因家族AGL15基因的克隆、生物信息学和表达分析
目的 基于前期对灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides转录组测序结果,从灰毡毛忍冬RNA中克隆灰毡毛忍冬MADS-box基因家族蕾期延长相关基因AGL15,并对其进行生物信息学及表达分析.方法 对灰毡毛忍冬总RNA进行反转录酶链式反应(reverse transcription-PCR,RT-PCR)和cDNA末端快速扩增反应(rapid amplification of cDNA ends,RACE),获得完整的开放阅读框(ORF).运用生物信息学的方法对该序列进行同源性分析和相似性比较,预测编码蛋白,并对其进行各种理化性质分析.运用半定量PCR测得该基因在灰毡毛忍冬不同部位的表达情况.结果 获得AGL15基因,ORF长795 bp,编码264个氨基酸,与葡萄Vitis vinifera中MADS-box基因家族AGL15基因相似性高,且包含MADS和K-box的保守序列.AGL15蛋白无跨膜区域,定位于细胞质中,在灰毡毛忍冬各部位均有表达.结论 首次从灰毡毛忍冬中克隆得到可能控制蕾期延长的基因,分析了其在灰毡毛忍冬不同部位表达差异性,为灰毡毛忍冬蕾期延长研究提供参考.
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刺五加GAPDH基因组DNA的克隆与分析
目的 克隆刺五加GAPDH基因的DNA及启动子序列,并进行生物信息学分析.方法 以刺五加的基因组DNA为模板,采用PCR和TAIL-PCR技术克隆GAPDH基因的全长DNA序列及5'端上游启动子序列,并对其进行生物信息学分析.结果 克隆到长4 103 bp的刺五加GAPDH基因全长DNA及启动子序列.该基因共包含12个外显子和11个内含子,其剪切均符合GT-AG原则.刺五加GAPDH的启动子片段长1 304 bp,转录起始位点A位于起始密码子ATG上游61 bp处.启动子除含有TATA-box、CAAT-box等基本元件外,还有诸多与激素应答、光响应和胁迫信号等有关的顺式作用调控元件.结论 首次克隆到刺五加GAPDH基因的全长DNA及启动子序列,为深入研究GAPDH基因结构特征与功能奠定基础.
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椪柑柠檬苦素-UDP-葡萄糖基转移酶基因的克隆、分析及表达
目的 克隆中药橘核主要来源品种桠柑Citrus reticulata的柠檬苦素-UDP-葡萄糖基转移酶(limonoid-UDP-glucosyltransferase gene,LGT)基因,并进行生物信息学及表达分析为橘核有效成分合成及调控机制研究提供基础.方法 克隆获得LGT序列,通过生物信息学对该基因蛋白的特征进行分析,构建LGT与相关物种LGT的系统进化树,利用RT-PCR分析橘皮、橘肉以及橘核中LGT基因表达量,并进行分析和比较.结果 测序所得椪柑LGT序列全长为1 530 bp,具有1 509 bp的完整开放阅读框,编码502个氨基酸.并对其蛋白二级、三级结构进行了分析和预测.基因表达分析结果发现桠柑LGT基因在橘核中表达量低,其次为橘皮,表达量高为橘肉.结论 成功克隆、分析并表达了椪柑LGT基因,为橘核中柠檬苦素类物质合成及调控机制研究提供基础.
关键词： 椪柑 橘核 柠檬苦素-UDP-葡萄糖基转移酶基因 基因克隆 生物信息学分析 -
红花DHDPS基因全长cDNA的克隆及植物表达载体构建
目的 克隆红花赖氨酸生物合成途径关键酶二氢吡啶二羧酸合酶(dihydrodipicolinate synthase DHDPS)基因的全长cDNA序列,构建植物超表达载体.方法 根据红花转录组文库注释信息获得红花DHDPS (CtDHDPS)基因的中间序列,通过RT-PCR与RACE技术从红花种子中克隆CtDHDPS基因全长cDNA序列.采用DNA重组技术构建pBASTA-CtDHDPS植物超表达载体.结果 分离CtDHDPS基因全长1 309 bp,开放阅读框954 bp,编码317个氨基酸,编码蛋白理论等电点为5.93,相对分子质量约为34 750.79.通过DNA重组技术成功构建了植物超表达载体pBASTA-CtDHDPS.结论 获得CtDHDPS基因全长cDNA序列并成功构建植物超表达载体,为阐明CtDHDPS基因的生物学功能及其在红花赖氨酸生物合成途径中作用机制提供科学依据.
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黄芩查耳酮异构酶基因的克隆和生物信息学分析
目的 从黄芩愈伤组织中克隆查耳酮异构酶(CHI)基因,并对其进行生物信息学分析.方法 从黄芩愈伤组织中提取RNA,反转录为cDNA,设计特异性引物,克隆得到黄芩查耳酮异构酶(sbCHI)基因.通过生物信息学对该基因蛋白的特征进行分析,使用MEGA5.1构建sbCHI与相关物种查耳酮异构酶基因的系统进化树.结果 获得sbCHI基因(GeneBank 登录号KP064512)全长648 bp,含有1个完整的开放阅读框,编码215个氨基酸.为不稳定亲水性蛋白,sbCHI编码蛋白相对分子质量为22 980,等电点(pI)为5.09,不含信号肽,无跨膜区,具有1个查耳酮超级家族的保守结构域.二级结构中α-螺旋(alpha helix)占37.21％、β-延伸(β-extended)占23.25％、无规则卷曲(random coil)占39.54％.同源性分析显示,sbCHI基因与黄芩(ADQ13184.1)核苷酸序列相似性为99.69％、氨基酸序列相似性为99.07％,仅在第31、160位不同.结论 成功从黄芩愈伤组织中克隆得到sbCHI,为进一步鉴定sbCHI基因的功能及黄芩苷的合成生物学研究提供基础.
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白桦BpNOS基因的生物信息及表达模式分析
目的 克隆白桦Betula platyphylla—氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS),探讨其生物信息及表达模式,并考察非生物胁迫对其NOS基因表达的影响.方法 通过RACE技术克隆了白桦NOS基因,命名为BpNOS.初步对该基因进行了生物信息学分析、分子进化分析、非生物胁迫处理以及信号诱导.结果 该基因全长1 806 bp,含有完整的开放读码框,编码601个氨基酸(Genebank登录号:KJ197336).BpNOS基因为不稳定疏水性蛋白,可能存在信号肽,具有跨膜能力,α-螺旋、延伸链、无规则卷曲分布于整个蛋白.分子进化分析结果表明,BpNOS基因与葡萄等物种的遗传距离较近,说明有着较近的亲缘关系;与大豆、苜蓿的遗传距离较远,说明其亲缘关系较远.BpNOS基因的表达具有节律性,在15:00时达到大值,为0:00时的12倍.盐、低温、重金属镉胁迫均能抑制BpNOS基因的表达,但响应模式不同;水杨酸(SA)和外源一氧化氮可以促进BpNOS基因的表达.结论 非生物胁迫能够在一定时间范围内抑制NOS活性,SA和外源一氧化氮可以通过NOS途径调控内源一氧化氮的合成,为进一步研究白桦一氧化氮的代谢调控奠定了基础.
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茯苓细胞色素P450还原酶基因的克隆与生物信息学分析
目的 从茯苓Poria cocos中克隆出细胞色素P450还原酶(CPR)基因,并对其进行生物信息学分析.方法 利用茯苓转录组注释信息,通过RACE扩增得到茯苓CPR基因(PcCPR)全长,并PCR得到对应基因组DNA序列.通过生物信息学方法,对该基因编码蛋白的特征进行分析,I-TASSER模拟出蛋白三级结构,MEGA构建蛋白系统进化树.结果 获得含有完整开放阅读框(ORF)的cDNA全长2 514bp(GenBank号为KP768251),PcCPR的基因组DNA 5 292bp(GenBank号为KP896487),含4个外显子、3个内含子.基因编码732个氨基酸的蛋白,相对分子质量81 147,等电点(pI)为5.39,为不稳定性亲水蛋白,非分泌蛋白,且不具有信号识别功能.蛋白定位于内质网上,第7～22位氨基酸为跨膜区;具有2个黄素结合的保守结构域,FAD、NADP的结合位点各自在蛋白三级结构空间上相邻近.同源性分析显示,PcCPR与担子菌CPR的相似性明显高于子囊菌CPR.结论 成功从茯苓中克隆得到PcCPR基因,为进一步研究PcCPR及相关代谢提供基础.
关键词： 茯苓 细胞色素P450还原酶 基因克隆 生物信息学分析 RACE -
当归咖啡酸-O-甲基转移酶基因克隆和序列分析
目的 克隆当归Angelica sinensis咖啡酸-O-甲基转移酶(caffeic acid O-methyltransferases,COMT)编码基因全长cDNA,并对序列进行生物信息学分析.方法 提取当归叶片总RNA为cDNA合成模板,利用同源克隆结合cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆当归COMT全长cDNA,并利用NCBI、ExPASy网站上的Blast N、Blast P、ORF Finder、Compute PI/Mw、ProtScale、PROSITE、SWISS-MODEL等序列在线分析工具和MEGA、DNAMAN生物信息学软件对序列进行分析.结果 获得COMT全长cDNA序列,并在GenBank注册(登录号KP188587).序列分析表明,克隆的cDNA全长为1 436 bp,其中包括5'-UTR (76 bp)和3'-UTR (362 bp),含有1个1 098 bp的完整开放阅读框(opening reading frame,ORF),编码365个氨基酸的多肽链;预测蛋白质相对分子质量为40 230,理论等电点(pI)为5.43;无信号肽,具有典型的Ⅱ型氧甲基转移酶结构域SAM OMT Ⅱ.结论 首次克隆当归COMT基因全长cDNA,为当归COMT基因功能研究和当归阿魏酸生物合成与调控的机制研究奠定基础.
关键词： 当归 咖啡酸-O-甲基转移酶 基因克隆 生物信息学分析 信号肽 -
广藿香八氢番茄红素脱氢酶PcPDS1基因克隆和序列分析
目的 为阐明广藿香类胡萝卜素代谢途径,克隆了广藿香Pogostemon cablin八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase,PDS)基因,并对其进行相关生物信息学分析.方法 搜索本课题组建立的广藿香转录组数据库,获得PDS基因全长序列,并设计全长引物进行PCR验证；利用生物信息学软件对PDS基因进行生物信息学分析.结果 本研究获得的广藿香PDS基因命名为PcPDS1(GenBank登录号为KC854409),该基因全长1 960个碱基,编码569个氨基酸.基于生物信息软件分析了PcPDS1基因编码蛋白的理化特性.系统进化树分析结果表明,PcPDS1基因与黄龙胆Gentiana lutea的PDS序列同源性高,与烟草Nicotiana tabacum、番薯Ipomoea batatas次之,与自然进化关系保持一致.结论 成功克隆、分析了广藿香PcPDS1基因.
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怀地黄3-酮酯酰CoA-硫解酶基因的克隆、序列特征和时空表达分析
目的 对怀地黄3-酮酯酰CoA-硫解酶(Rehmannia glutinosaf hueichingensis 3-ketoacyl CoA-thiolase,RghKAT)cDNA 全长基因进行克隆及分析,为怀地黄分子育种提供候选基因和理论依据.方法 根据其他植物ARGOS基因序列的保守结构域设计简并引物,采用RT-PCR和RACE技术,获得RghKAT cDNA全长序列;通过生物信息学技术对其核苷酸序列和氨基酸序列进行比对:利用实时荧光定量PCR技术检测了其在2个时期、10个组织的表达.结果 RghK AT基因全长1 713 bp,包含了1 395 bp的开放阅读框(ORF),编码464个氨基酸:同源比对和系统进化分析表明,RghKAT的核苷酸序列与葡萄、番茄、毛果杨、拟南芥和小麦的KAT核苷酸序列同源性分别达84％、82％、82％、79％、73％; RghKAT编码的氨基酸序列与矮牵牛、葡萄、黄瓜、拟南芥和小麦的KAT氨基酸同源性分别为88％、88％、86％、87％、78％:各物种KAT酶进化树符合物种进化规律;理化性质表明该蛋白为略成碱性的稳定蛋白质,蛋白质二级结构主要由α-螺旋、不规则卷曲、β-折叠和β-转角构成;在N端存在一个由70个氨基酸残基组成的信号肽;RghKAT蛋白三维结构具有硫解酶典型的特征序列;表达谱分析表明,RghKAT mRNA在各时期、各组织中均有表达,盛花期花瓣中表达强,而在幼苗期叶中表达量低.结论 成功克隆了RghKAT cDNA 全长序列,具有KAT基因的结构特性及其产物硫解酶典型的特征序列,其在盛花期花瓣中表达量高.
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铁皮石斛DoSRK2E基因的克隆与表达分析
目的 克隆铁皮石斛蔗糖非酵解1型相关蛋白激酶2(SnRK2)家族基因,并进行生物信息学和表达分析.方法 通过RT-PCR、RACE克隆铁皮石斛SnRK2 (DoSRK2E)基因cDNA全长,利用生物信息学软件预测基因编码蛋白的相对分子质量、等电点、结构域、跨膜结构、信号肽及亚细胞定位等;利用DNASTAR和MEGA进行多序列比对和系统发育关系重建分析;利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术检测基因组织表达模式.结果 获得铁皮石斛DoSRK2E基因(GenBank登录号API65110),cDNA全长1 795 bp,包含1个1 086 bp的完整开放阅读框,编码蛋白相对分子质量40 850,等电点4.80,无信号肽和跨膜域,包含1个蛋白激酶结构域、1个ATP结合位点和1个Ser/Thr蛋白激酶活化位点,预测定位在内质网膜上;DoSRK2E蛋白与植物SnRK2蛋白序列高度一致,系统发育位置位于SnRK2亚家族的分支Ⅲ,与拟南芥AtSnRK2.6的亲缘关系近;DoSRK2E基因在铁皮石斛根中表达量高,茎中次之,叶中低.结论 首次从珍稀濒危药用植物铁皮石斛中克隆得到SnRK2家族基因DoSRK2E,对其分子特性与组织表达模式进行了分析研究,为进一步揭示该基因在铁皮石斛逆境胁迫中的作用机制提供基础.
