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三七病程相关蛋白PR10-2基因的克隆、表达及功能初步分析
在转录组测序的基础上,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从三七主根中分离到三七病程相关蛋白10 (pathogensis related protein 10,PR10)基因,命名为PnPR10-2,测序结果表明该序列长465 bp,编码154个氨基酸.氨基酸序列同源性及系统发育树分析发现,PnPR10-2与人参的PR10-2蛋白同源性高,具有典型的病程相关蛋白Bet v I 保守结构域.构建了重组载体pET32a(+)-PnPR10-2,在宿主菌Escherichia coli BL21中诱导表达融合蛋白,优化诱导条件,PnPR10-2融合蛋白在E.coli BL21中以可溶性和包涵体蛋白2种形式大量表达.纯化上清中的重组蛋白,运用纸片法分析纯化重组蛋白的体外抑菌活性,其对三七根腐病病菌腐皮镰刀菌Fusarium solani和坏损柱孢菌Cylindrocarpon destructans具有一定的抑制作用,猜测该基因可能参与了三七抗根腐病的防御反应.
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三七病程相关蛋白1基因的克隆与表达分析
在生物信息学分析基础上,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法从三七中获得病程相关蛋白1(pathogensis-related protein 1,PRI)基因的开放阅读框,命名为PnPR1,测序结果显示该序列长501 bp,编码166个氨基酸,其蛋白质分子质量为18.1 kD.利用NCBI/Blastp和BioEdit软件进行同源性比对显示,PnPR1基因编码蛋白与葡萄、烟草、番茄等高等植物中的PR1蛋白同源性较高,且具有相同的富含半胱氨酸蛋白的保守结构域.将构建的重组载体pET28a(+)-PnPR1在宿主菌Escherichia coli BL21中经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白,在不同诱导时间、诱导温度、IPTG诱导浓度和IPTG添加时间下对诱导条件进行优化.十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析结果表明,PnPR1基因编码蛋白的佳诱导条件为:IPTG终浓度0.4 mmol·L-1、IPTG添加时间为转接后4h、诱导温度28℃、诱导时间20 h.这为蛋白纯化及单克隆抗体的制备奠定了一定的基础.
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三七病程相关蛋白PR10-1基因克隆及功能初步分析
采用同源克隆法和RACE技术相结合,对三七根部蛋白质组差异进行研究,鉴定PR10-1蛋白相应的基因全长cDNA,初步分析该基因在三七中的功能.测序结果显示该基因序列全长863 bp,包含1个序列长465bp编码155个氨基酸的开放阅读框,命名为PnPR10-1,GenBank登录号KJ741402.氨基酸序列同源性及系统发育树分析发现,PnPR10-1与人参的PR10-1蛋白同源性高,含有Bet-v-Ⅰ家族等多个保守结构域.实时荧光定量PCR分析显示,PnPR10-1在1～3年生三七各组织中均有本底表达,暗示其参与生长发育、代谢调控等生物学过程;PnPR10-1生根部受根腐病原菌(Fusarium oxysporum)胁迫上调表达,推测PnPR10-1基因可能参与抗三七根腐病等广谱抗病防御反应.
