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正北芪中一种免疫活性蛋白质提取工艺的优选
目的:优选正北芪中一种免疫活性蛋白AmPR10-16(16.0 kDa)的提取工艺.方法:以正北芪中AmPR10-16的可溶性蛋白二级结构的圆二色性考察提取温度,在单因素试验基础上,以AmPR10-16在SDS-PAGE胶图中的蛋白条带吸光度(峰面积)为指标,采用L9(34)正交试验考察提取温度、料液比、提取时间、提取溶剂、粒度、提取次数对AmPR10-16提取工艺的影响,辅以BCA法测定可溶性蛋白含量作为佐证.结果:AmPR10-16佳提取工艺为药材粉末过4号筛,加16倍量pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)于40℃常压水浴提取60 min,每10 min搅拌1次.AmPR10-16提取率0.063 g·g-1.结论:优化的提取工艺能正确反映AmPR10-16提取率的高相对量,为AmPR10-16的进一步研究提供了稳定、合理、可行的提取工艺.
关键词： 正北芪 蛋白质 蛋白质二级结构 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 二喹啉甲酸法 -
红外光谱法研究极低频电磁场暴露对大鼠肺组织二级结构的影响
为了探讨极低频电磁场长期暴露对大鼠肺组织结构改变机理,采用傅里叶变换红外(FTIR)光谱法研究暴露/假暴露于电场强度E=3.5～4 kV/m,磁场强度B=8～10 μT的极低频电磁场400 d后大鼠肺组织红外谱和二维相关红外光谱,根据大鼠肺组织傅立叶变换红外光谱酰胺I带的拟合分析,获得组织中蛋白质二级结构数目及其组成.结果表明:极低频电磁场暴露引起酰胺I带峰产生位移;暴露组蛋白质二级结构稳定性下降,说明极低频电磁场长期暴露引起了肺组织中蛋白质变性;二维相关红外谱的变化规律同红外谱结果一致,进一步证明暴露组大鼠肺组织发生的主要变化是蛋白质变性以及二级结构组成发生改变.本实验为在分子光谱水平上解释极低频电磁场生物效应提供了一种研究手段.
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应用红外光谱分析技术研究微波辐照对心肌细胞的损伤
目的:应用傅里叶变换红外光谱法分析大鼠乳鼠的原代培养心肌细胞受高功率微波辐照前后细胞结构的改变情况.方法:将培养的心肌细胞分为3组,分别用高功率微波辐照30,60,120 s,然后在傅里叶变换红外光谱仪的红外显微镜上测定每组细胞的红外光谱.结果与结论:发现大鼠乳鼠原代培养心肌细胞受高功率微波辐照后,细胞膜的结构发生了明显改变.傅里叶变换红外光谱分析技术可用于了解大鼠心肌细胞受微波辐照后细胞膜中蛋白质构象变化,尤其是测定细胞膜蛋白质二级结构的变化信息.
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CD和FT-IR法分析重组人钙调磷酸酶B亚基冻干前后与多批产品二级结构的一致性
目的 通过测定重组人钙调磷酸酶B亚基(rhCNB)的圆二色谱(CD)和傅立叶变换红外光谱(FT-IR),来研究rhCNB冻于前、后和rhCNB多批产品之间二级结构的一致性,从而确定生产工艺是否稳定,样品是否发生变性等,达到控制产品质量的目的.方法 采用CD和FT-IR光谱法分别对3批rhCNB进行蛋白质二级结构测定,并对rhCNB冻干前与冻干后样品进行了CD和FT-IR光谱法二级结构测定.结果与结论 CD和FT-IR光谱测得3批样品谱图均达到批间一致,说明样品二级结构稳定,工艺过程较稳定,产品未发生变性.rhCNB冻干前与冻干后2种图谱均无明显变化,说明冻干工艺对rhCNB的二级结构并无改变.
关键词： 重组人钙调磷酸酶B亚基 圆二色谱 傅立叶变换红外光谱 蛋白质二级结构 -
注射用重组人钙调磷酸酶B亚基稳定性的初步研究
目的:对注射用重组人钙调磷酸酶B亚基(rhCNB)的稳定性进行初步研究,以确定其贮藏条件和有效期.方法:采用毛细管区带电泳(CZE),反相高效液相色谱(RP-HPLC),十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)非还原电泳、蛋白质含量测定Bradford法、圆二色谱(CD)、pH值、生物学活性等检测方法,对rhCNB在贮藏温度条件下的稳定性进行了系统研究.结果及结论:3批注射用rhCNB于2℃～8℃贮藏24个月,各项指标:外观、pH值、蛋白含量、纯度、肽图谱、相对分子质量、CD光谱蛋白质二级结构及生物学活性均无明显变化,稳定性好,有效期可暂定为2年.
关键词： 重组人钙调磷酸酶B亚基(rhCNB) 稳定性 蛋白质二级结构 有效期 -
SARS冠状病毒推定结构蛋白序列分析
2003年4月16日WHO正式宣布,蔓延全球的严重急性呼吸综合征 (Severe Acute Respiratory Syndrome ,SARS)的病原体是一类新的未知冠状病毒.并命名为SARS冠状病毒(SARS coronav irus, SARS CoV).
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怀地黄3-酮酯酰CoA-硫解酶基因的克隆、序列特征和时空表达分析
目的 对怀地黄3-酮酯酰CoA-硫解酶(Rehmannia glutinosaf hueichingensis 3-ketoacyl CoA-thiolase,RghKAT)cDNA 全长基因进行克隆及分析,为怀地黄分子育种提供候选基因和理论依据.方法 根据其他植物ARGOS基因序列的保守结构域设计简并引物,采用RT-PCR和RACE技术,获得RghKAT cDNA全长序列;通过生物信息学技术对其核苷酸序列和氨基酸序列进行比对:利用实时荧光定量PCR技术检测了其在2个时期、10个组织的表达.结果 RghK AT基因全长1 713 bp,包含了1 395 bp的开放阅读框(ORF),编码464个氨基酸:同源比对和系统进化分析表明,RghKAT的核苷酸序列与葡萄、番茄、毛果杨、拟南芥和小麦的KAT核苷酸序列同源性分别达84％、82％、82％、79％、73％; RghKAT编码的氨基酸序列与矮牵牛、葡萄、黄瓜、拟南芥和小麦的KAT氨基酸同源性分别为88％、88％、86％、87％、78％:各物种KAT酶进化树符合物种进化规律;理化性质表明该蛋白为略成碱性的稳定蛋白质,蛋白质二级结构主要由α-螺旋、不规则卷曲、β-折叠和β-转角构成;在N端存在一个由70个氨基酸残基组成的信号肽;RghKAT蛋白三维结构具有硫解酶典型的特征序列;表达谱分析表明,RghKAT mRNA在各时期、各组织中均有表达,盛花期花瓣中表达强,而在幼苗期叶中表达量低.结论 成功克隆了RghKAT cDNA 全长序列,具有KAT基因的结构特性及其产物硫解酶典型的特征序列,其在盛花期花瓣中表达量高.
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蒙古黄芪中2种具有免疫活性的可溶性粗蛋白提取工艺优选
目的 优选蒙古黄芪Astragalus membranaceus mongholicus中2种免疫活性蛋白AmPR10-16kDa和HQGP-2的佳提取工艺.方法 以蒙古黄芪中所含可溶性蛋白AmPR10-16kDa和HQGP-2二级结构的圆二色性对提取温度和提取溶剂种类进行考察;对该2种蛋白提取条件进行单因素考察,并采用L9(34)正交试验设计法,采用Image凝胶图形分析软件以AmPR10-16kDa和HQGP-2在SDS-PAGE凝胶图中的蛋白条带灰度值(峰面积)为指标,考察提取温度、料液比、提取时间、提取溶剂(pH值)、药材粒度、提取次数对AmPR10-16kDa和HQGP-2蛋白条带灰度值的影响,从而确定AmPR10-16kDa和HQGP-2的佳提取工艺,辅以其免疫抑制率(CCK-8法)和可溶性蛋白定量测定(BCA法)作为佐证.结果 建立了蒙古黄芪中AmPR10-16kDa和HQGP-2的佳提取工艺:向药材粉末(过4号筛)5.0g中加入16倍量Tris-HC1,在温度40℃条件下恒温提取60 min,以100 r/min搅拌.蒙古黄芪蛋白质提取率为65 mg/g,且质量浓度为90 μg/mL粗蛋白的免疫抑制率为90.90％.结论优化的提取工艺能正确反映AmPR10-16kDa和HQGP-2收率的高相对量,为AmPR10-16kDa和HQGP-2的进一步研究提供了稳定、合理、可行的提取工艺.
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基于氨基酸疏水性与PSSM构建ANN预测蛋白质二级结构
目的 预测蛋白质二级结构是预测其空间结构的基础,提高蛋白质二级结构的预测率非常重要.方法在本研究中,结合氨基酸的疏水性与含有进化信息的位置特异性得分矩阵(PSSM),构建BP神经网络.本文的数据来源于蛋白质数据集合CB513,在此集合中去除氨基酸个数小于30及含有X、B的序列,共492条蛋白序列作为数据集.通过4-交互验证预测准确率.在本研究中,将蛋白质二级结构预测的结果与仅用PSSM作为输入的神经网络预测相比较.结果 采用疏水性与进化信息相结合作为输入所构建的神经网络对α螺旋的预测准确率有了较大的提高,达到近79%,敏感性及特异性分别达到79%及91%.同时对二级结构总体预测准确率达到75.96%.结论 此种方法构建的BP网络能提高蛋白质二级结构,尤其是α螺旋的预测准确率.
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生物信息分析细粒棘球绦虫EgA31蛋白T细胞及B细胞的优势抗原表位
背景:EgA31蛋白是参与成虫吸盘肌收缩的一类蛋白,是细粒棘球蚴绦虫保护性免疫中重要的候选疫苗分子.目的:应用生物信息学方法对细粒棘球绦虫EgA31蛋白进行分析,预测其可能的T细胞及B细胞优势抗原表位.方法:从GenBank中获取EgA31蛋白的氨基酸序列(GenBank登记号为AAC21558.1),利用ProtParam在线程序分析EgA31蛋白的分子质量、理论等电点、氨基酸组成、原子组成、消光系数、不稳定系数和总平均疏水性,DNAstar Protein模块、SOPMA在线服务器分析蛋白二级结构,Phyre的同源建模服务器预测其蛋白质三级结构,后通过ABCpred、BepiPred、SYFPEITHI、IDBE等软件联合预测细粒棘球绦虫EGA31蛋白的T细胞及B细胞的优势抗原表位.结果与结论:①EgA31蛋白由601个氨基酸组成,其中含有112个强碱性氨基酸,121个强酸性氨基酸,归类为不稳定且亲水性蛋白;②在线分析发现,EgA31蛋白的二级结构中α-螺旋约占82.36％,延长链约占4.16％,β-转角约占3.16％,无规则卷曲约占10.32％;③通过ABCpred、BepiPred、SYFPEITHI、IDBE等软件联合分析后预测了4段优势T细胞抗原、6段优势B细胞抗原以及1段T-B细胞联合表位;④生物学信息方法能较为全面地预测细粒棘球绦虫EgA31蛋白的优势T细胞及B细胞抗原表位,为进一步研制疫苗和检测试剂奠定了基础.
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埃博拉病毒包膜糖蛋白二级结构及B细胞表位的预测
目的 预测并分析从2014年西非埃博拉出血热暴发地区感染患者分离的扎伊尔型病毒株包膜糖蛋白(glycoprotein,GP)的二级结构及B细胞表位.方法 通过GenBank搜索近期公布的分离自西非地区的扎伊尔型埃博拉病毒株基因组,获得GP1、GP2和sGP 3种包膜糖蛋白的基因及氨基酸序列,采用互联网服务器在线预测其二级结构及B细胞表位,并分析蛋白的各种氨基酸组成比例及可能的蛋白结合位点,通过亲/疏水性等参数判断氨基酸序列中可能暴露在蛋白结构表面或隐藏在内部的区段.结果 在编码GP1、GP2和sGP的氨基酸中,占组成比例多的均为苏氨酸.GP1和sGP可能的蛋白结合位点较多,且整个蛋白暴露于表面的区域和隐藏区域呈均匀相间分布;GP2结构较前二者特殊,存在一个暴露在蛋白结构表面的大片段的无序结构区域.GP1 N-末端第20～ 37和166～186区段,GP2 N-末端第361 ～ 379区段,sGP N-末端第20～37和166～185区段,可能为跨膜螺旋结构.sGP可能存在4个含有二硫键的区域.B细胞表位分析结果显示,GP1和GP2中疏水区域主要集中在N-末端第1～ 325位氨基酸之间;亲水区域主要集中在N-末端第326～676位氨基酸之间;亲水与疏水区域分界明显,几乎无交叉;可能存在2个线性表位,分别位于N-末端第324～450、461～676区段;预测共存在25个可能形成构象表位的氨基酸位点或序列,其中可能性在90％以上的位点或序列有6个.结论 通过对此次流行于西非的埃博拉病毒包膜糖蛋白的二级结构及可能性B细胞表位的预测,为实验确定埃博拉病毒包膜糖蛋白的结构与功能、B细胞表位免疫识别以及埃博拉病毒预防、治疗和诊断制品的研发提供了参考.
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肿瘤细胞对不同分化阶段树突状细胞脂含量和蛋白质二级结构的影响
目的:利用傅里叶变换红外光谱(Fourier transformed infrared spectrum,FT-IR)技术探讨肿瘤细胞共培养对不同分化阶段树突状细胞(dendritic cells,DCs)的脂含量和蛋白质二级结构的影响,为深入理解肿瘤的免疫逃逸机制寻找线索.方法:免疫磁珠法分离人CD14+单核细胞,以经典方法将其诱导为未成熟DCs(immature DCs,imDCs)和成熟DCs(mature DCs,mDCs),分别将imDCs和mDCs与肝癌细胞株BEL7402、红白血病细胞株K562以及人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)共培养48 h,正常培养的DCs作为对照.采用FT-IR技术研究不同肿瘤细胞对不同分化阶段DCs的脂含量和蛋白质二级结构的影响.结果:与正常培养的DCs相比,与肿瘤细胞BEL7402和K562共培养后imDCs和mDCs的膜磷脂成分减少(2.718±0.296,3.124±0.361 vs 4.855±0.324,P＜0.05;2.964±0.136,3.522±0.173 vs 4.217±0.206,P＜0.05),而总的脂含量增加(3.768±0.185,3.591±0.197 vs 2.487±0.212,P＜0.05;4.288±0.156,4.155±0.167 vs 3.233±0.206,P＜0.05);蛋白质α-螺旋含量减少(1.863±0.192,1.754±0.169 vs 2.364±0.188,P＜0.05;1.124±0.133,1.016±0.107 vs 1.392±0.113,P＜0.05),β-折叠(3.397±0.225,3.433±0.236 vs 2.486±0.198,P＜0.05;2.646±0.209,2.591±0.216 vs 1.558±0.159,P＜0.05)阳转角含量(4.366±0.284,4.322±0.266 vs 3.127±0.272,P＜0.05;2.675±0.221,2.627±0.235 vs 1.773±0.181,P＜0.05)增加;并且mDCs比imDCs更容易受到肿瘤来源因素的影响.结论:与肿瘤细胞共培养能够导致mDCs和imDCs的脂含量和蛋白质二级结构发生改变,可能是肿瘤导致DCs功能损伤的结构基础.
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肠道病毒71型VP1蛋白二级结构及B细胞表位的预测
目的 预测C4基因亚型肠道病毒71型的VP1蛋白二级结构及B细胞表位,为EV71疫苗研制提供理论基础.方法 本研究将宁波地区EV71分离株与国内外EV71代表株进行同源性分析和并构建亲缘进化树.以VP1基因序列为材料,应用EX-PASY服务器上的GOR4、SOPMA两种方法分析预测蛋白质二级结构,并结合蛋白质的亲水性、柔韧性、表面可能性等指标综合评价VP1蛋白的B细胞抗原表位.结果 同源性分析和亲缘进化分析得出,2010年宁波EV71分离株属于C4a基因亚型,与基因库检索到的C4a基因亚型代表株核苷酸和氨基酸同源性较高,分别为93.6％～99.3％和98.3％～100％.VP1蛋白二级结构以无规则卷曲和β-片层为主,有多处抗原指数较高的区段,结合亲水性、柔韧性、表面可能性等指标,综合预测VP1蛋白的B细胞抗原表位在第39～40、159～167、212～220、287～290位氨基酸残基的可能性较大.结论 EV71 VP1蛋白多个区段具有抗原潜力通过生物信息学方法预测VP1蛋白二级结构及B细胞表位为EV71疫苗研制提供理论基础.
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极低频电磁场对实验大鼠睾丸组织红外谱影响的研究
研究表明极低频电磁场可能影响动物生殖功能,本文应用傅立叶变换红外(Fourier transform infrared, FTIR)光谱法分析雄性大鼠睾丸组织受高场强极低频电磁场暴露后组织结构改变情况.将雄性Wistar大鼠分为2组,其中1组暴露于电场强度E为3 500～4 000V/m,磁场强度B为8～10 μT的极低频电磁场400 d,然后观察其组织病理切片及其红外光谱的变化情况.结果发现,雄性大鼠睾丸组织受高场强极低频电磁场辐照后,其红外谱有显著变化,说明长期暴露于高场强极低频电磁场环境可能导致雄性实验动物睾丸组织中蛋白质二级结构稳定性下降,从而导致生物效应.
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基于对偶四元数配准的蛋白质局部螺旋参数拟合方法
本文提出了一种基于对偶四元数配准的蛋白质局部螺旋结构参数拟合(DQRFit)方法.该方法首先提取蛋白质结构数据中各残基的C、N原子坐标,然后用滑动窗口分别构造各段的待配准数据和参考数据.接着以配准前后数据点的距离平方和小为寻优目标,利用对偶四元数配准算法求解出优的旋转矩阵和平移向量并计算出该段二级结构的螺旋参数:每周残基数(τ)、螺旋半径(ρ)和螺距(p).本文通过对偶四元数配准可实现τ、ρ,p三个螺旋参数的同时拟合,并且滑动窗口宽度可调以适应不同的误差等级.与传统螺旋拟合方法相比,具有计算复杂度低、抗干扰性好、拟合精度高的优点.将本文算法应用于蛋白质α螺旋结构检测,结果表明检测精度与蛋白质二级结构词典(DSSP)相当,而明显优于其它几种传统方法.本文研究结果或可在今后的蛋白质结构分类和功能预测、药物设计、蛋白质结构可视化等领域具有重大意义.
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人B组轮状病毒WH-1株 NSP5基因序列和蛋白质结构分析
[目的]克隆人B组轮状病毒WH-1株NSP5基因并测定其核苷酸序列,分析其基因和蛋白质结构.[方法] 利用RT-PCR技术扩增人B组轮状病毒WH-1株NSP5基因,克隆到载体pUCm-T,测定其基因序列;利用基因序列和氨基酸序列同源性比较软件GeneBee,比较与其B组轮状病毒基因及氨基酸序列同源性,绘制了NSP5基因的种系进化树; RNAstructure 3.7 和RNAviz 2.0绘制NSP5基因的二级结构;Predict Protein分析了NSP5蛋白结构.[结果] WH-1NSP5基因全长631 bp,与ADRV核苷酸序列的同源性达98%,与印度加尔各达分离株CAL-1达82%,与IDIR(鼠B组轮状病毒)同源性仅为64%.NSP5基因的mRNA折叠形成多达17个发卡环状结构.蛋白质结构为170个氨基酸组成的多肽,含有4个潜在的N-糖基化位点和多个磷酰化位点.WH-1与ADRV的氨基酸序列同源性达99%,与CAL-1达91%,而IDIR仅为68%.[结论] 人B组轮状病毒WH-1株NSP5基因与ADRV的起源相同.
