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TMPRSS4基因沉默对胰腺癌SW1990细胞生长及侵袭的影响
目的 观察TMPRSS4基因沉默对人胰腺癌SW1990细胞体外生长增殖和侵袭的影响.方法 体外合成4个靶向TMPRSS4基因和阴性对照的真核表达载体,瞬时转染到SW1990细胞,实时定量PCR法检测转染细胞的TMPRSS4 mRNA表达.以干扰效率高的真核表达载体转染SW1990细胞,G418筛选出稳定的TMPRSS4基因沉默的细胞株,蛋白质印迹法检测稳定细胞株TMPRSS4蛋白抑制效率,CCK-8法检测细胞生长抑制率,Transwell小室检测细胞侵袭能力.结果 成功构建了稳定下调TMPRSS4表达的细胞株SW1990/psi-TMPRSS4,细胞转染效率为82.9%.与亲本SW1990细胞比较,TMPRSS4 mRNA和蛋白水平分别下调了80.1%、60%.SW1990/psi-TMPRSS4组穿膜细胞数为(118.6±13.4)个,显著低于阴性对照组的(157.4±12.9)个和亲本细胞组的(157.0±9.5)个(P值均<0.01).SW1990/psi-TMPRSS4组细胞的侵袭抑制率为24.5%.但各组细胞增殖无明显变化.结论 成功筛选出稳定下调TMPRSS4表达的细胞株.下调TMPRSS4表达能有效抑制胰腺癌SW1990细胞的侵袭能力,但对细胞增殖无影响.
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沉默小鼠成纤维细胞活化蛋白表达对原代胰腺癌细胞增殖及凋亡的影响
目的 应用RNA干扰技术沉默小鼠胰腺癌相关成纤维细胞的成纤维活化蛋白(FAP)表达,观察其对小鼠原代胰腺癌细胞增殖及凋亡的影响.方法 构建靶向小鼠FAP基因的重组表达质粒siFAP及对照质粒siMOCK,分别转染小鼠原代胰腺癌相关成纤维细胞mPCa-FCs-1212,采用定量RT-PCR法及蛋白质印迹法检测转染细胞的FAP mRNA及蛋白表达.将该细胞与小鼠原代胰腺癌细胞mPCa-1212按1∶1的比例共培养,应用MTT比色法检测mPCa-1212细胞的增殖抑制率,应用Annexin V-FTTC/PI染色及流式细胞仪检测细胞凋亡.结果 转染重组质粒siFAP的mPCa-FCs-1212细胞的FAP mRNA及蛋白表达较转染对照质粒siMOCK的细胞的表达明显下调[0.584±0.029比1.052±0.281,P=0.0213;(27.18±3.23)％比(61.58±4.72)％,P=0.0317].转染siFAP和转染siMOCK的mPCa-FCs-1212分别与mPCa-1212细胞共培养3d后,mPCa-1212的增殖抑制率分别为(23.02±3.32)％和(1.11±0.23)％；细胞凋亡率分别为(42.31±5.34)％和(7.38±2.09)％,两组细胞的差异具有统计学意义(P=0.000).结论 沉默FAP基因的mPCa-FCs-1212在体外可有效抑制mPCa-1212细胞的增殖,诱导细胞凋亡,可能是一种潜在的基因治疗新方法.
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截短型 p63基因沉默对胰腺癌 PANC1细胞增殖的影响
目的：观察截短型p63（ΔNp63）基因沉默对胰腺癌PANC1细胞增殖的影响。方法采用实时PCR检测23例胰腺癌及其配对癌旁正常胰腺组织ΔNp63mRNA的表达；采用蛋白质印迹法检测人正常胰腺导管上皮细胞株HPDE6-C7及人胰腺癌细胞株PANC1、CFPAC-1、BxPC3的ΔNp63蛋白表达。采用脂质体法将靶向ΔNp63的siRNA（ΔNp63-siRNA ）及对照siRNA （ Con-siRNA ）转染PANC1细胞，以未转染的PANC1细胞作为对照组，检测转染细胞ΔNp63 mRNA及蛋白表达以验证ΔNp63基因沉默效应。采用MTT 法和BrdU法检测转染细胞的增殖及DNA合成能力的变化。结果23例胰腺癌及配对癌旁正常胰腺组织ΔNp63 mRNA表达量分别为0．99±0．07、0．70±0．07，癌组织的表达量显著高于正常胰腺组织，差异有统计学意义（P ＝0．0034）。 HPDE6-C7及PANC1、CFPAC-1、BxPC3细胞ΔNp63蛋白表达量分别为0．97±0．09、3．06±0．16、2．57±0．11、2．45±0．08，3株胰腺癌细胞的表达量较HPDE6-C7细胞升高，差异均有统计学意义（P值均＜0．01）。对照组、Con-siRNA组、ΔNp63-siRNA组PANC1细胞ΔNp63mRNA 表达量分别为0．97±0．07、0．97±0．07、0．28±0．03，蛋白表达量分别为0．97±0．06、1．00±0．10、0．26±0．03，ΔNp63-siRNA组均较Con-siRNA组显著下调，差异有统计学意义（P值均＜0．01）。ΔNp63-siRNA组细胞生长受到抑制，与Con-siRNA组及对照组差异均有统计学意义（P值均＜0．01）。3组培养24 h时DNA合成量（A490值）分别为0．55±0．04、0．56±0．01、0．55±0．00；培养48 h时分别为0．84±0．05、0．87±0．07、0．71±0．05。48 h时ΔN6p3-siRNA组细胞DNA合成能力较Con-siRNA组及对照组显著下降，差异均有统计学意义（P值均＜0．05），而Con-siRNA组与对照组间的差异无统计学意义。结论沉默ΔNp63基因可显著抑制胰腺癌PANC1细胞的增殖及DNA 合成。
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Gsh2基因沉默对胰腺癌SW1990细胞Hedgehog通路成员表达的影响
目的 探讨Gsh2基因沉默对胰腺癌SW1990细胞Hedgehog (Hh)通路关键成员Shh、Gli1基因表达的影响.方法 构建3个靶向Gsh2的shRNA(Gsh2-shRNA),应用双酶切法插入质粒pLKO.1puro,以未插入shRNA的空载质粒作为阴性对照.重组质粒经扩增后,抽提质粒DNA,通过双酶切后电泳分离和测序鉴定.然后转染胰腺癌SW1990细胞,应用实时RT-PCR法检测转染细胞Gsh2 mRNA表达,筛选沉默效果佳的插入Gsh2-shRNA重组质粒.选择佳重组质粒转染胰腺癌SW1990细胞,采用实时RT-PCR法和蛋白质印迹法检测转染细胞的Gsh2、Shh、Gli1 mRNA和蛋白表达量.结果 3个重组质粒经双酶切电泳及测序鉴定后证实插入的Gsh2-shRNA片段正确,符合预期.以转染空载质粒细胞的mRNA表达量为1,重组质粒Gsh2-shRNA-1、Gsh2-shRNA-2、Gsh2-shRNA-3转染细胞后Gsh2mRNA表达量分别为0.41 ±0.02、0.22 ±0.043、0.53 ±0.03,以Gsh2-shRNA-2的沉默效应佳.以转染空载质粒细胞的mRNA或蛋白表达量为1,转染Gsh2-shRNA-2细胞的Gsh2、Shh、Gli1 mRNA相对表达量分别为0.12 ±0.02、0.97 ±0.13、0.19 ±0.03;蛋白表达量为0.55±0.12、0.74 ±0.06、0.53 ±0.09.转染Gsh2-shRNA-2细胞的Gsh2、Gli1 mRNA及蛋白表达量较转染空载质粒细胞显著下调,差异均有统计学意义(P值均＜0.01),而Shh mRNA及蛋白表达量的差异无统计学意义.结论 Gsh2基因沉默可抑制胰腺癌SW1990细胞Hh通路成员Gli1的表达,而不影响Shh基因的表达.
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吉西他滨对Beclinl基因沉默的人胰腺癌MiaPaCa-2细胞的周期及凋亡的影响
目的 探讨吉西他滨对Beclinl基因沉默的人胰腺癌MiaPaCa-2细胞周期及凋亡的影响.方法 构建靶向Beclinl的siRNA,插入表达质粒,转染MiaPaCa-2细胞.采用RT-PCR法和蛋白质印迹法检测细胞Beclinl mRNA及蛋白的表达,应用吉西他滨处理Beclinl基因沉默的MiaPaCa-2细胞,应用流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡状况.结果 成功获得Beclin1基因沉默的MiaPaCa-2细胞,转染后细胞的Beclin1 mRNA表达量从对照组的1.0下降到0.295;S、G2期细胞数减少,而G1期细胞增多;细胞凋亡未受影响.应用吉西他滨处理后,Beclin1基因沉默的MiaPaCa-2细胞的S期细胞数进一步减少,而G1、G2期细胞增多,细胞凋亡被抑制.结论 Beclinl表达沉默使人胰腺癌细胞系MiaPaCa-2细胞周期发生改变,并影响吉西他滨对细胞周期及凋亡的作用.
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MAT1基因沉默对胰腺癌细胞生长的影响
我们既往的研究证实,作为调控细胞周期循环的关键基因之一,人类MAT1( ménage à trios 1)基因在胰腺癌组织中表达增强,它参与胰腺癌的发生[1-2]引.转染反义MAT1基因可使胰腺癌细胞出现明显的G1期阻滞[3].为此,本研究应用体外转录法合成靶向MAT1基因的小干扰RNA( small interference RNA,siRNA),转染胰腺癌Capan-2细胞,观察其对细胞的生长抑制效应,探讨siRNA沉默MAT1基因用于胰腺癌基因治疗的可行性.
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5-脂氧合酶基因沉默后裸鼠胰腺癌移植瘤相关基因的变化
目前认为,5-脂氧合酶(5-lipoxygenase,5-LOX)代谢途径异常是促进多种肿瘤发生、发展的重要原因之一.其机制为促进细胞过度增殖、抑制凋亡;促进恶性肿瘤血管生成;提高恶性肿瘤发生及转移的潜能、增加肿瘤细胞的侵袭力;抑制5-LOX能使多种恶性肿瘤细胞增殖减低并诱导细胞凋亡[1].本实验利用基因芯片检测靶向5-LOX的shRNA真核表达载体导入SW1990细胞形成的裸鼠皮下移植瘤内并联合雷公藤内酯醇(TL)治疗后移植瘤组织基因表达谱的变化,探讨沉默5-LOX基因表达治疗胰腺癌的应用价值.
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microRNAs与胰腺癌
microRNAs是近期新发现的一类18～24个核苷酸、非蛋白质编码的小RNA家族.在基因转录后水平,通过与靶mRNA结合,对基因的表达起负性调节或基因沉默作用.microRNAs广泛存在于真核生物中,在物种间具有高度的保守性、时序性和组织特异性.在生命活动中对生长、发育、疾病等具有十分广泛和重要的作用[1].近研究显示,microRNAs在肿瘤的形成及进展过程中发挥癌基因或抑癌基因的作用.
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RNA干扰技术在高脂血症实验动物基因治疗中的研究进展
高脂血症是心血管疾病(CVD)的主要危险因素,占人群归因危险度的50％以上[1].降低血脂水平除了调整饮食结构、加强体力活动、改善生活方式外,药物治疗也是非常重要的手段.目前使用的调脂药物包括他汀类、贝特类和烟酸,这些药物的应用为人类心血管疾病的防治作出了巨大的贡献.但是,传统降脂药物存在种类少、价格高、存在毒副作用等不足[2].
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MEF 2A基因沉默对小鼠主动脉内皮细胞ICAM-1、VCAM-1表达的影响
目的 探讨肌细胞增强因子2A(MEF 2A)基因沉默对小鼠主动脉内皮细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)及纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)表达的影响.方法 建立MEF 2A基因沉默慢病毒转染体系,另外体外培养ApoE-/-小鼠主动脉内皮细胞.分为MACE细胞空白对照组、MACE细胞慢病毒阴性对照组、MACE细胞MEF 2A RNAi A、B、C、D组(选择沉默率高的靶点),ApoE-/-小鼠主动脉内皮细胞组.采用RT-PCR、ELISA和Western blot方法检测各组细胞MEF 2A、ICAM-1、VCAM-1和PAI-1表达情况.结果 ApoE-/-小鼠主动脉内皮细胞MEF 2A mRNA表达水平明显高于MACE空白对照组细胞(P<0.05).MEF 2A基因B位点沉默率高,MEF 2A mRNA表达水平明显低于其他各组细胞,与MACE空白对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05).经ELISA、RT-PCR和western blot检测结果显示,MEF 2A RNAi的MACE细胞组细胞和ApoE-/-小鼠主动脉内皮细胞中ICAM-1、VCAM-1、PAI-1蛋白和mRNA表达水平分别较空白对照组和阴性对照组明显上调(P<0.05).MEF 2A表达量与ICAM-l、VCAM-1和PAI-1的表达量呈现负相关性(r=-0.985,-0.805,-0.959,P均<0.05).结论 MEF 2A在动脉粥样硬化小鼠主动脉内皮细胞中表达降低,MEF 2A基因沉默可明显上调ICAM-1、VCAM-1、PAI-1的表达.
关键词： 动脉粥样硬化 MEF2A 细胞间黏附分子-1 血管细胞黏附分子-1 基因沉默 -
CD147基因沉默对兔外周血单核巨噬细胞基质金属蛋白酶表达的影响
目的 筛选出高效抑制兔外周血单核巨噬细胞中CD147表达的短链RNA(shRNA)慢病毒载体,观察CD147基因沉默后对基质金属蛋白酶(MMP)的影响.方法 兔源CD147 mRNA序列,设计并构建shRNA慢病毒载体,实验分为空白组,阴性组,加CD147 shRNA慢病毒干扰依次为A组、B组、C组、D组,将其分别转染兔外周血单核巨噬细胞,72 h后观察转染效果,用RT-PCR测CD147 mRNA表达,ELISA法测CD147 MMP-2及MMP-9蛋白表达.结果 A、B、C、D组CD147 mRNA及CD147、MMP-2和MMP-9蛋白较空白组显著减少(P＜0.01),A组CD147 mRNA和蛋白降低显著,较空白组分别减少57.7％和50.9％(P＜0.01),MMP-2、MMP-9蛋白表达分别减少95.9％和45.4％.结论 成功构建并筛选出能高效、且特异阻断CD147基因表达的shRNA慢病毒载体.CD147基因沉默后,MMP-2和MMP-9表达明显减少,可能成为防治动脉粥样硬化新的治疗靶点.
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前蛋白转化酶枯草溶菌素9小分子干扰RNA对血管平滑肌细胞增殖的影响
目的 研究前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PC SK9)基因沉默后对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响,初步探讨低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP-1)蛋白表达在其中的作用.方法 建立PCSK9小分子干扰RNA(siRNA)模型,培养VSMC,分为空白对照组、阴性转染组和阳性转染组,选取转染效率高的PCSK9 siRNA对VSMC进行干预,分别于12、24、36、48、60 h用MTT法测定吸光度(A)值,绘制增殖曲线,观察其对VSMC增殖的影响,转染48 h后用Western blot印迹法检测细胞内LRP-1蛋白表达情况.结果 与阴性转染组比较,阳性转染组24、36、48和60 h的A值明显下降(P＜0.05),PCSK9 siRNA抑制VSMC的增殖(P＜0.05).与空白对照组和阴性转染组比较,阳性转染组LRP-1蛋白表达明显上调(P＜0.05).结论 PCSK9 siRNA能有效抑制VSMC的增殖作用,且这种作用可能与LRP-1蛋白表达上调有一定的关系.
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富含亮氨酸重复蛋白8A膜蛋白对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响
目的 探讨干扰富含亮氨酸重复蛋白8A(LRRC8A)膜蛋白对心肌缺血再灌注(IR)损伤心脏功能的影响及可能机制.方法 选择SPF级健康雄性SD大鼠48只随机分为假手术组、模型组、基因沉默(LRRC8A-siRNA)组和空载体(Scrambled-siRNA)组,每组12只.模型组、基因沉默组和空载体组建立心肌IR损伤大鼠模型;假手术组不进行结扎.假手术组和模型组于术前24 h注射PBS,基因沉默组和空载体组则分别注射LRRC8A-siRNA、Scrambled-siRNA混合液;再灌注2h后检测左心室舒张期末内径(LVEDD)、左心室收缩期末内径(LVESD)、LVEF和左心室短轴缩短率(LVFS)及心肌活性氧、自噬相关蛋白LC3Ⅱ、溶酶体相关蛋白(LAMP2)、ATP、血清NF-κB、TNF-α和白细胞介素6(IL-6)、肌酸激酶(CK)、CK同工酶(CK-MB)和乳酸脱氢酶(LDH)水平;观察心肌组织病理形态学变化;免疫组织化学法检测心肌LC3Ⅱ和LAMP2表达.结果 模型组LVEDD、LVESD、血清CK、CK-MB、LDH、活性氧、NF-κB、TNF-a、IL-6水平及LC3Ⅱ表达明显高于假手术组,而LVEF、LVFS、ATP水平及LAMP2表达明显低于假手术组,差异有统计学意义(P＜0.01);与模型组比较,基因沉默组LVEDD、LVESD、血清CK、CK-MB、LDH、活性氧、NF-κB、TNF-a和IL-6水平及LC3Ⅱ表达明显降低(P＜0.01),而LVEF[(0.65±0.04)％vs (0.42±0.08)％]、LVFS[(48.91±3.01)％vs(28.63±8.17)％]、ATP水平[(11.1±0.2) ng/g vs(0.9±0.1) ng/g]及LAMP2表达(5.23±0.50 vs 0.41±0.03)明显升高(P＜o.01);空载体组各指标与模型组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).光学显微镜下可见,基因沉默组心肌细胞形态基本正常,较少发生炎性细胞浸润.结论 干扰LRRC8A膜蛋白能够通过抑制活性氧过量产生、炎症及过度自噬,保护心肌线粒体功能,达到预防心肌IR损伤及保护心脏功能的作用.
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沉默Talin-1基因对前列腺癌PC-3细胞株上皮间质转化及侵袭能力的影响
目的：探讨沉默Talin-1基因对前列腺癌PC-3细胞上皮间质转化及侵袭能力的影响。方法 RNAi法靶向沉默前列腺癌PC-3细胞Talin-1基因，选取PC-3空白对照组，PC-3加入空质粒（plsmid）组、基因沉默组、基因沉默后加入转化生长因子β1（TGF-β1）组，PC-3加入TGF-β1组体外培养。MTT法检测各组细胞增殖能力，Transwell 小室侵袭和迁移实验检测侵袭及迁移能力， Western-blot技术检测E-cadherin以及Vimentin蛋白表达情况。结果 PC-3与PC-3＋plsmid 两组增殖、侵袭和迁移能力以及 E-cadherin 和 Vimentin 蛋白表达水平未见明显差异（P＞0．05）；沉默Talin-1基因后，PC-3＋TGF-β1、PC-3、PC-3＋TGF-β1＋RNAi、PC-3＋RNAi 中增殖、侵袭和迁移能力以及Vimentin蛋白表达水平依次递减，而 E-cadherin 蛋白表达水平依次递增（F＝58．683、28．972、20．314、37．541、145．925，均P＜0．05）。结论沉默Talin-1基因后前列腺癌PC-3细胞生长受抑制，并且侵袭和迁移能力下降。Talin-1在前列腺癌侵袭和转移中发挥重要作用，其机制可能是通过升高Vimentin蛋白表达及降低E-cadherin蛋白表达从而诱发上皮间质表型转化而实现。
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微小RNA介导的基因沉默与神经退行性疾病
微小RNA(microRNA,miRNA) 是一类内源性的22个核苷酸左右的非蛋白编码单链短序列RNA,介导同源序列依赖的基因沉默.目前,miRNA数据库miRBase(16.0版)已收录了人类miRNA 1048个.miRNA及其靶基因构建了细胞内全方位多层次的基因表达调控网络系统,参与众多生命活动的调节并与人类疾病密切相关.miRNA的功能失常在多种神经退行性疾病的发生发展中均具有重要作用.
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半巢式MSP在急性白血病患者p15基因甲基化检测中的应用
传统的观点认为,基因的缺失和突变是基因失活的主要方式,近研究显示,基因异常甲基化所导致的基因沉默亦是基因失活的方式之一.在多种恶性血液病中,p15基因发生异常的主要途径是基因异常甲基化和缺失.目前国内文献上p15基因甲基化的检测方法主要集中在甲基化敏感限制性酶切和Herman等[1]总结的甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)方法.我们通过优化MSP方法,设计了p15基因的半巢式-MSP(Hn-MSP)引物对85例急性白血病(AL)患者进行了p15甲基化状态的检测.
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核糖体蛋白S6激酶1基因沉默对小鼠非酒精性脂肪性肝病的影响
目的 探讨核糖体蛋白S6激酶1基因沉默对db/db小鼠非酒精性脂肪性肝病的影响及其作用机制.方法 根据随机数字表将12只体质量44.5～48.2 g的9周龄雄性db/db小鼠随机分至对照组(n=6)和实验组(n=6).实验组db/db小鼠尾静脉注射制备的核糖体蛋白S6激酶1短发夹RNA重组基因腺病毒,对照组db/db小鼠尾静脉注射含U6启动子空载体腺病毒.在注射病毒后第6天处死小鼠获取肝脏,提取肝脏蛋白,利用Western blot法观察其中胰岛素受体底物1、胰岛素受体底物2、蛋白激酶B及其丝氨酸473蛋白的表达;提取肝脏总RNA用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应法检测比较2组参与肝脏脂肪酸合成基因mRNA的表达.处死2组小鼠前1 d禁食16 h后经尾静脉取血,采用比色法检测游离脂肪酸、甘油三酯、总胆固醇水平.组间数据比较采用t检验.结果 db/db小鼠注射病毒后6 d,苏木素-伊红染色显示实验组肝细胞胞质含脂肪滴较对照组减少,脂肪肝得到改善.Western blot检测显示实验组核糖体蛋白S6激酶1蛋白表达被抑制,与对照组相比差异有统计学意义(分别为0.12±0.01和0.87±0.06,t=5.36,P＜0.05);实验组胰岛素受体底物1、胰岛素受体底物2、蛋白激酶B丝氨酸473的蛋白表达均较对照组增强(均P＜0.05).和对照组相比,实验组参与脂肪酸合成的基因固醇调节元件结合蛋白1c(分别为2.33±0.29和1.34±0.39,t=3.46,P＜0.01)、脂肪酸合成酶(分别为7.8±1.2和3.4±0.4,t=4.67,P＜0.01)、硬脂酰辅酶A去饱和酶1(764±116和535±54,t=6.12,P＜0.01)mRNA表达均明显下降.血清生化测定结果显示和对照组相比实验组脂肪酸下降(t=2.64,P＜0.05),胆固醇水平降低(t=4.25,P＜0.01),甘油三酯组间比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论在营养过剩的条件下,肝脏核糖体蛋白S6激酶1过度激活,可能通过负反馈引起肝脏胰岛素信号传导下降、上调脂代谢关键调控基因固醇调节元件结合蛋白1c表达而参与了肝脏胰岛素抵抗和脂肪肝的发生.
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核糖体蛋白S6激酶1基因沉默对小鼠肝脏胰岛素抵抗的影响
目的 探讨核糖体蛋白S6激酶1基因沉默对db/db小鼠肝脏胰岛素抵抗的影响及机制.方法 采用随机数字表法将24只9周龄健康雄性db/db小鼠(体质量44.5～48.2 g)随机分至对照组(n1=12)和实验组(n=12),实验组小鼠尾静脉注射核糖体蛋白S6激酶1短发夹RNA重组基因腺病毒,对照组尾静脉注射含U6启动子空载体腺病毒.注射病毒后第6天,对照组和实验组采用随机数字表进一步分为进食组(n=6)及空腹组(n=6).在进食和空腹状态处死小鼠,提取肝脏,应用Western blot法观测胰岛素受体底物-1和胰岛素受体底物-2蛋白表达水平.提取肝脏总RNA,应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测糖异生基因mRNA表达水平.经尾静脉取血,采用酶联免疫吸附法测定胰岛素水平,采用比色法检测游离脂肪酸、甘油三酯、总胆固醇水平.组间比较采用单因素方差分析.结果 与对照组相比,进食及空腹状态时,实验组胰岛素受体底物-1、胰岛素受体底物-2蛋白表达均增加.在空腹状态下,实验组与对照组相比,糖异生基因过氧化酶体增殖物受体共激活因子1α(分别为0.072±0.024和0.028±0.012)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(分别为23.8±4.0和12.3±2.4)、葡萄糖6磷酸酶(分别为3.0±0.8和1.5±0.4)mRNA表达均下降(F值分别为7.58、5.76、9.15,均P＜0.01).对照组和实验组胰岛素水平无显著差异(t=1.26,P＞0.05).空腹及进食状态下,实验组胆固醇水平低于对照组(F=15.48,P＜0.01).与空腹对照组相比,空腹实验组游离脂肪酸降低(t=2.56,P＜0.05).结论 db/db小鼠肝脏核糖体蛋白S6激酶1基因沉默后,空腹糖异生和血清游离脂肪酸水平下降,胰岛素受体底物-1和胰岛素受体底物-2蛋白表达增加,提示营养过剩条件下核糖体蛋白S6激酶1可能在肝脏胰岛素抵抗中发挥重要作用.
关键词： 核糖体蛋白质S6激酶类 胰岛素 糖原异生 基因沉默 -
泛素-核糖体融合蛋白52基因沉默对高糖环境下大鼠肾小管上皮细胞转化生长因子β1/Smad信号通路的影响
目的 探讨RNA干扰(RNAi)介导泛素-核糖体融合蛋白52(UBA52)基因沉默对高糖环境下鼠肾小管上皮细胞NRK-52E转分化信号通路转化生长因子β1(TGF-β1)/Smad的影响.方法 首先根据培养基葡萄糖浓度将NRK-52E细胞分为4组:正常对照组(5.6 mmol/L葡萄糖)、高渗对照组(5.6 mmol/L葡萄糖+24.4 mmol/L甘露醇)、葡萄糖中浓度组(20 mmol/L葡萄糖)、葡萄糖高浓度组(30 mmol/L葡萄糖)并分别干预48 h,通过实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测并比较各组UBA52、Smad7、TGF-β1水平,观察葡萄糖浓度对上述指标的表达影响.然后采用三个不同基因序列的UBA52小干扰RNA(UBA52 siRNA)分别转染NRK-52E细胞,通过荧光定量PCR筛选出佳转染效果的UBA52 siRNA基因序列,并确定佳转染时间及转染剂量.然后将NRK-52E细胞分为3组:空白对照组(30 mmol/L葡萄糖)、阴性对照组(30 mmol/L葡萄糖+无关RNA转染组)及转染组(30 mmol/L葡萄糖+UBA52 siRNA转染).48 h后实时荧光定量PCR法分别检测各组UBA52、TGF-β1、Smad7的mRNA表达变化,Western blotting法检测TGF-β1、Smad2/3、Smad7的蛋白表达.通过随机区组方差分析对上述指标进行统计学分析.结果 葡萄糖干预实验中正常对照组、高渗对照组、葡萄糖中浓度组、葡萄糖高浓度组肾小管上皮细胞UBA52、TGF-β1、Smad7 mRNA的表达量差异均有统计学意义(F=60.914、65.112、29.390,均P<0.05);葡萄糖中浓度组及高浓度组的UBA52、TGF-β1表达均明显高于正常对照组及高渗对照组,而Smad7的表达则明显低于正常对照组及高渗对照组.转染实验中空白对照组、阴性对照组及转染组TGF-β1 mRNA表达量分别为1.00±0.04、0.98±0.04、0.49±0.14,差异有统计学意义(F=26.364,P<0.001),转染组明显低于其他2组;3组Smad7 mRNA表达量分别为1.00±0.12、1.05±0.17、2.24±0.31,差异有统计学意义(F=22.816,P<0.001),转染组明显高于其他2组.3组TGF-β1蛋白表达量分别为0.676±0.357、0.613±0.011、0.184±0.073,差异有统计学意义(F=96.433,P<0.01),转染组表达量低;Smad2/3的蛋白表达量分别为0.68±0.10、0.63±0.05、0.27±0.15,差异有统计学意义(F=12.194,P<0.05),转染组明显低于其他2组;Smad7的蛋白表达量分别为0.52±0.05、0.55±0.12、0.83±0.06,3组差异有统计学意义(F=12.154,P<0.05),转染组表达量高.结论 干预高糖环境下鼠肾小管上皮细胞转分化信号通路TGF-β/Smad可能成为糖尿病肾病肾间质纤维化新的干预靶点.
关键词： 泛素-核糖体融合蛋白52 基因沉默 转化生长因子β1 -
siRNA慢病毒载体介导DKK-1基因沉默对骨髓间充质干细胞分化影响的实验研究
背景:激素性股骨头坏死(SONFH)发病机制尚不完全明确,可能与骨髓间充质干细胞(BMSC)的异常分化密切相关.目的:研究siRNA慢病毒载体介导的DKK-1基因沉默,通过调控Wnt/β-catenin信号通路对超生理剂量糖皮质激素作用下大鼠BMSC分化的影响,探索治疗SONFH的新途径.方法:提取、培养SD大鼠BMSC,并构建DKK-1基因慢病毒干扰载体.大鼠第3代BMSC分4组:对照组(A组)、激素组(B组)、激素+无序序列慢病毒载体组(C组)、激素+DKK-1基因慢病毒干扰载体组(D组).A组用基础培养基培养,B组加入浓度为1×10-6mol/L的地塞米松,C、D组除加入地塞米松外,各自加入相应的慢病毒载体转染BMSC.14 d后提取各组细胞RNA及蛋白,对DKK-1、成脂相关基因PPAR-γ2和成骨相关基因RUNX2进行Real-time PCR及Western-blot检测,并对各组进行油红O、茜素红染色,观察各组BMSC分化情况,对结果进行统计学分析.结果:Real-time PCR及Western-blot检测结果示B、C组与A、D组相比,成骨相关基因RUNX2的表达明显较低(P<0.05),而DKK-1及成脂相关基因PPAR-γ2的表达明显较高(P<0.05).油红O染色结果显示B、C组呈阳性,A、D组呈阴性;茜素红染色结果显示A、D组呈阳性,B、C组呈阴性.结论:DKK-1基因沉默通过特异性抑制DKK-1过表达而重新激活Wnt/β-catenin信号通路,减少成脂基因PPAR-γ2的表达、增加成骨基因RUNX2的表达,抑制BMSC成脂分化,促进BMSC成骨分化.
