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核糖体蛋白S6激酶1基因沉默对小鼠肝脏胰岛素抵抗的影响
目的 探讨核糖体蛋白S6激酶1基因沉默对db/db小鼠肝脏胰岛素抵抗的影响及机制.方法 采用随机数字表法将24只9周龄健康雄性db/db小鼠(体质量44.5～48.2 g)随机分至对照组(n1=12)和实验组(n=12),实验组小鼠尾静脉注射核糖体蛋白S6激酶1短发夹RNA重组基因腺病毒,对照组尾静脉注射含U6启动子空载体腺病毒.注射病毒后第6天,对照组和实验组采用随机数字表进一步分为进食组(n=6)及空腹组(n=6).在进食和空腹状态处死小鼠,提取肝脏,应用Western blot法观测胰岛素受体底物-1和胰岛素受体底物-2蛋白表达水平.提取肝脏总RNA,应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测糖异生基因mRNA表达水平.经尾静脉取血,采用酶联免疫吸附法测定胰岛素水平,采用比色法检测游离脂肪酸、甘油三酯、总胆固醇水平.组间比较采用单因素方差分析.结果 与对照组相比,进食及空腹状态时,实验组胰岛素受体底物-1、胰岛素受体底物-2蛋白表达均增加.在空腹状态下,实验组与对照组相比,糖异生基因过氧化酶体增殖物受体共激活因子1α(分别为0.072±0.024和0.028±0.012)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(分别为23.8±4.0和12.3±2.4)、葡萄糖6磷酸酶(分别为3.0±0.8和1.5±0.4)mRNA表达均下降(F值分别为7.58、5.76、9.15,均P＜0.01).对照组和实验组胰岛素水平无显著差异(t=1.26,P＞0.05).空腹及进食状态下,实验组胆固醇水平低于对照组(F=15.48,P＜0.01).与空腹对照组相比,空腹实验组游离脂肪酸降低(t=2.56,P＜0.05).结论 db/db小鼠肝脏核糖体蛋白S6激酶1基因沉默后,空腹糖异生和血清游离脂肪酸水平下降,胰岛素受体底物-1和胰岛素受体底物-2蛋白表达增加,提示营养过剩条件下核糖体蛋白S6激酶1可能在肝脏胰岛素抵抗中发挥重要作用.
关键词： 核糖体蛋白质S6激酶类 胰岛素 糖原异生 基因沉默 -
脂联素对子宫内膜癌细胞AMPK/mTOR/S6K1信号通路及胰岛素增敏的影响
目的 探讨脂联素对子宫内膜癌HEC-1B细胞腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳类雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)信号通路及胰岛素增敏效应的影响.方法 实验分为4组:脂联素组(Ad组,加入20μg/ml的脂联素作用30 min);抑制剂组(加入10μmol/L的AMPK抑制剂——复合物C作用30 min);脂联素+抑制剂组(Ad+抑制剂组,10μmol/L复合物C预处理30 min后,再加入20μg/ml脂联素作用30 min);对照组(仅加入无血清DMEM培养基).(1)荧光定量PCR技术及蛋白印迹法检测HEC-1B细胞中脂联素受体(AdipoR)1、AdipoR2 mRNA和蛋白的表达水平.(2)以不同浓度(分别为2.5、5、10、20μg/ml)脂联素作用于HEC-1B细胞30 min,增敏实验时再加50 nmol/L胰岛素作用5 min;以20μg/ml脂联素作用于HEC-1B细胞不同时间(分别为15、30、45、60 min),增敏实验时再加50 nmol/L胰岛素作用5 min.蛋白印迹法检测HEC-1B细胞中AMPK、mTOR、S6K1蛋白活化水平以及胰岛素受体底物1(IRS1)酪氨酸磷酸化水平.(3)活细胞计数(CCK-8)法检测4组HEC-1B细胞的增殖能力,体外穿膜实验检测4组HEC-1B细胞的迁移能力.结果 (1)在HEC-1B细胞中,AdipoR1 mRNA及蛋白的表达水平分别为8.50±0.09、0.91±0.03,明显高于AdipoR2 mRNA及蛋白(分别为1.00±0.00、0.69±0.03;P<0.05).(2)脂联素以时间、浓度依赖方式诱导HEC-1B细胞中AMPK蛋白活化水平增高但抑制mTOR、S6K1蛋白活化水平(P<0.05),且脂联素浓度为20μg/ml、作用时间为30 min时,AMPK蛋白的活化水平均达到峰值.脂联素以浓度依赖方式诱导IRS1酪氨酸磷酸化水平增高(P<0.05).(3)Ad组HEC-1B细胞增殖的抑制率为(0.68±0.34)％,Ad+抑制剂组为(0.24±0.04)％,两组比较,差异有统计学意义(t=17.88,P<0.05).Ad组穿膜细胞数为(77±8)个,Ad+抑制剂组为(132±13)个,两组比较,差异有统计学意义(t=-7.34,P<0.05).结论 脂联素通过AMPK/mTOR/S6K1信号通路发挥抑制子宫内膜癌HEC-1B细胞增殖的效应,并通过调控AMPK/S6K1/IRS1信号通路增加HEC-1B细胞对胰岛素的敏感性.
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高与低表达RSK4基因人乳腺癌细胞株的筛选及鉴定
目的:探讨核糖体S6激酶4(RSK4)抑癌基因在人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、T47D、Bcap37和MCF-7中的表达,并筛选出高和低表达RSK4基因的乳腺癌细胞.方法:逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法从mRNA和蛋白水平检测RSK4在MDA-MB-231、T47D、Bcap-37和MCF-7 4种乳腺癌细胞株中的表达.结果:人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、T47D、Bcap37和MCF-7中均有RSK4基因表达,其中,MCF-7细胞RSK4表达水平高,为表达量低的MDA-MB-231细胞的2.9倍,MCF-7细胞RSK4蛋白表达水平也高,与其他3种细胞株相比,差异有统计学意义,P＜0.001.RT-PCR法和蛋白质印迹法检测结果一致,具有高度相关性,r=0.766,P＜0.001.结论:人乳腺癌细胞株MCF-7为高表达RSK4基因的细胞,MDA-MB-231细胞为低表达RSK4基因的细胞,两者均可作为人乳腺癌细胞中研究RSK4基因的实验材料.
关键词： 乳腺肿瘤 细胞系 肿瘤 核糖体蛋白质S6激酶类 基因表达 -
磷酸化流式技术评估肝移植后P70S6激酶活性的意义
目的 探讨应用流式磷酸化技术检测肝移植受体外周血CD3+细胞的mTOR通路下游P70S6激酶的磷酸化水平及价值.方法 选取自2008年10月至2013年10月首都医科大学附属北京朝阳医院肝移植患者84例,其中以西罗莫司为主要免疫抑制剂方案的26例(西罗莫司组),以他克莫司为主要免疫抑制剂方案的35例(他克莫司组),以环孢素A为主要免疫抑制剂方案的23例(环孢素A组).检测各组患者CD3+细胞P70S6激酶磷酸化水平,分析西罗莫司组P70S6激酶磷酸化水平与血药浓度的相关性.同时检测3例健康人P70S6激酸磷酸化程度的个体内差异和个体间差异.结果 健康人P70S6激酶磷酸化个体内差异的变异度范围为3.5％ ～ 5.6％,个体间差异变异度为18.9％ ～22.5％.西罗莫司组CD3+细胞P70S6激酶磷酸化(28.9±10.5)显著性低于健康对照组(57.2±8.4,P＜0.001),他克莫司组(42.5±14.1,P＜0.001)和环孢素A组(51.4±10.9,P＜0.00l).健康对照组的P70S6激酶活性(57.2±8.4)显著性高于他克莫司组(42.5±14.1,P＜0.01)和环孢素A组(51.4±10.9,P＜0.05).在西罗莫司组,P70S6激酶磷酸化与血药浓度无关(r=-0.18,P=0.39).结论 磷酸流式技术可以通过检测P70S6激酶磷酸化评估mTOR的抑制程度,检测P70S6激酶磷酸化水平可以为个性化免疫治疗提供更好的依据.
关键词： 核糖体蛋白质S6激酶类 西罗莫司 血药浓度 -
1,25（OH）2D3对人肾小球系膜细胞增殖及mTOR/p70s6K表达的影响
目的：探讨1,25-二羟基维生素D3[1,25(OH)2D3]对人肾小球系膜细胞增殖的影响及其在肾小球系膜细胞调控中对mTOR/p70s6K信号通路的作用。方法体外培养人肾小球系膜细胞，取传代培养至3~7代细胞分为4组：正常对照组（加含5%胎牛血清DMEM培养基），VD组[加1,25(OH)2D310-8 mol/L]，R组（加雷帕霉素5 mg/L），R+VD组[加雷帕霉素5 mg/L及1,25(OH)2D310-8 mol/L]，干预48 h。采用细胞增殖与活性检测试剂盒CCK-8检测细胞增殖情况，流式细胞术检测细胞周期时相分布，免疫荧光法检测细胞中mTOR、p70s6K的表达情况。结果正常对照组、VD组、R组、R+VD组：（1）吸光度值（A450）依次降低，组间多重比较差异均有统计学意义（均P<0.05）；抑制率（IR）依次升高。（2）G1期细胞比例依次增加，S期、G2/M期依次减少，增殖指数（PI）依次降低，除R组与VD组比较差异无统计学意义外，其余组间多重比较差异均有统计学意义。（3）系膜细胞中mTOR、p70s6K蛋白表达强度均依次降低，除R组与VD组比较差异无统计学意义外，其余组间多重比较差异均有统计学意义。结论1,25(OH)2D3可显著抑制人系膜细胞增殖，且其可能通过抑制mTOR/p70s6K信号通路调控肾小球系膜细胞增殖。
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七氟醚后处理对大鼠离体心脏缺血再灌注时心肌细胞p70S6K表达的影响
目的 评价七氟醚后处理对大鼠离体心脏缺血再灌注时心肌细胞核糖体40S小亚基蛋白S6激酶(p70S6K)表达的影响.方法 取Langendorff心脏模型制备成功的大鼠心脏90个,采用随机数字表法分为3组(n=30):假手术组(S组)、缺血再灌注组(I/R组)和七氟醚后处理组(SP组).离体心脏缺血30 min,再灌注2h.SP组于缺血末至再灌注15 min灌注经3.0％七氟醚饱和的K-H液,随后更换为正常K-H液再灌注105 min.于再灌注2h时测定心肌梗死体积,计算心肌梗死体积百分比,采用Western blot法检测心肌细胞p-p70S6K/t-p70S6K、细胞质和线粒体细胞色素c和caspase-8的表达水平.结果 与S组比较,I/R组心肌梗死体积百分比升高,心肌细胞p-p70S6K/t-p70S6K、细胞质细胞色素c和caspase-8表达上调,线粒体细胞色素c表达下调(P＜0.05);与I/R组比较,SP组心肌梗死体积百分比降低,心肌细胞p-p70S6K/t-p70S6K和线粒体细胞色素c表达上调,细胞质细胞色素c和caspase-8表达下调(P＜0.05).结论 七氟醚后处理可减轻离体大鼠离体心脏缺血再灌注损伤,其机制与上调心肌细胞p-p70S6K表达,抑制线粒体细胞色素c转移至细胞质,从而减少细胞凋亡有关.
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mTOR/P70S6K 信号通路在宫颈癌组织中的表达及其临床意义
目的：探讨 mTOR/ P70S6K 信号通路在宫颈癌组织中的表达水平及其相关临床诊断、治疗意义。方法收集2012年1月—2014年1月手术切除或进行活检的正常宫颈组织65例,宫颈癌组织、癌旁组织各85例,提取组织中的 mRNA,应用 RT-PCR 的方法来检测3种组织中 mTOR 和 P70S6K mRNA 的表达水平,并进行分析。结果宫颈癌组织中 mTOR、P70S6K mRNA 的表达明显高于癌旁组织及正常组织(P <0．05),mTOR、P70S6K mRNA 水平在宫颈癌组织、癌旁组织及正常组织中均呈正相关(P <0．05)。结论 mTOR 信号通路在宫颈癌组织中处于活化状态,其在宫颈癌的发生发展以及向其他部位转移中具有重要作用,是一个诊断和治疗的分子靶点。
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蟾蜍令灵对裸鼠食管鳞癌原位移植瘤中 P70S6K 表达的影响
背景食管癌是世界上常见的消化道恶性肿瘤之一，近年研究发现，核糖体蛋白 S6激酶（P70S6K）与其发生密切相关。笔者前期的研究表明，蟾蜍令灵（Bufalin）有明显的抗肿瘤作用。目的探讨 Bufalin 对裸鼠食管鳞癌原位移植瘤中 P70S6K 表达的影响。方法 Nu/ Nu 健康裸鼠36只，雌雄各半，采用随机数字表法分为4组，每组9只，即对照组（0.9%氯化钠溶液）、Bufalin 低剂量（0.5 mg/ kg，BL）组、Bufalin 中剂量（1.0 mg/ kg，BM）组、Bufalin 高剂量（1.5 mg/ kg，BH）组。观察经 Bufalin 治疗后裸鼠肿瘤生长情况；反转录 PCR（RT - PCR）法检测裸鼠原位移植瘤中 P70S6K mRNA 的表达，Western blotting 及免疫组化法检测裸鼠原位移植瘤中 P70S6K 和p - P70S6K相对表达量。结果4组治疗前及治疗后第1天裸鼠体质量比较，差异无统计学意义（P >0.05）。4组治疗前肿瘤体积比较，差异无统计学意义（P >0.05）；治疗后第15天肿瘤体积比较，差异有统计学意义（P <0.05）。治疗后第15天，BM组、BH 组肿瘤体积均低于 BL 组和对照组（P <0.05）。3组肿瘤抑制率比较，差异有统计学意义（ P <0.05）。4组P70S6K mRNA 及 P70S6K 相对表达量比较，差异无统计学意义（F =0.634、0.119，P >0.05）。4组p - P70S6K相对表达量比较，差异有统计学意义（F =233.005，P <0.05）。结论 Bufalin 对裸鼠食管鳞癌原位移植瘤具有抑制作用；Bufalin 可以下调 P70S6K 的磷酸化水平，而 P70S6K 则不受影响，提示 Bufalin 可能通过抑制 P70S6K 活化而发挥作用。
关键词： 食管肿瘤 蟾蜍令灵 核糖体蛋白质S6激酶类 70-kDa 原位移植瘤 -
RSK2沉默对肝癌细胞化疗药物敏感性的影响
目的:探讨RSK2在肝细胞癌(HCC)中的表达与化疗药物耐药的关系.方法:将HepG2细胞分为RSK2干扰组(PGCsi3.0-RSK2 siRNA转染细胞),5-FU处理组(10 μg/mL 5-FU处理细胞24 h),5-FU处理+RSK2干扰组及空白对照组,采用MTT方法检测各组细胞增殖情况；用Western blot方法检测5-FU处理组和5-FU处理+RSK2干扰组细胞RSK2,c-Jun,Bcl-2,LKB1蛋白表达.结果:与空白对照组比较,沉默RSK2蛋白与5-FU干预均可明显抑制HepG2细胞增殖(均P＜0.05),且其联合作用大于两者单独的作用(均P＜0.05)；与RSK2干扰组比较,5-FU处理+RSK2干扰组细胞RSK2,c-Jun,Bcl-2表达上调,LKB1表达下调(均P＜0.05).结论:抑制RSK2表达可以增强肝癌细胞对化疗药物5-FU的敏感性,机制作用可能与其调节c-Jun,Bcl-2,LKB1蛋白的表达有关.
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mTOR信号通路与肿瘤研究进展
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是1991年从酵母中分离出的一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是多条信号通路的关键蛋白分子，在体内参与多种细胞增殖、分化、自噬、凋亡及周期调控，是近年来在肿瘤领域的研究热点并已取得很大进展。本文就其与常见肿瘤的关系作一综述。
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miR-181b影响ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化形成的自噬调节机制
目的 探讨微小RNA 181b(miR-181b)是否通过调节自噬相关靶蛋白参与动脉粥样硬化发展.方法通过颈总动脉套环诱导ApoE-/-小鼠颈动脉粥样硬化斑块形成.通过尾静脉注射miR-181b慢病毒载体构建其过表达(miR-181bOE)及低表达(miR-181bKD)模型.检测血浆中脂质水平,苏木精-伊红染色对动脉粥样硬化斑块大小和体积进行定量,Western Blot检测自噬相关蛋白的表达.结果各组ApoE-/-小鼠血浆中总胆固醇 、三酰甘油 、低密度脂蛋白胆固醇水平均无显著差异(P>0.05).MiR-181bKD和miR-181bOE分别显著减少和增加颈动脉斑块面积和体积(F=118.95~322.03,P<0.05).MiR-181bOE可下调微管相关蛋白1轻链3膜结合型(LC3-Ⅱ)的表达,上调核糖体蛋白质S6激酶类70-kDa(p70S6K)表达,抑制自噬体形成;相反,miR-181bKD可上调LC3-Ⅱ 的表达,下调p70S6K表达,促进自噬体形成.差异均有显著性(F=107.38~398.13,P<0.05).结论抑制miR-181b可能通过下调p70S6K表达增加自噬活性,延缓颈动脉粥样硬化斑块的形成.
关键词： 动脉粥样硬化 微RNAs 自噬体 核糖体蛋白质S6激酶类 70-kDa
