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短发夹状RNA使骨肉瘤细胞缺氧诱导因子HIF-1α基因沉默
目的构建低氧诱导因子HIF-1α发夹状小干涉RNA真核表达载体,观察发夹状双链小干涉RNA对骨肉瘤细胞HIF-1的转录后的基因沉默效果.方法体外合成两对互补的寡核苷酸链,分别针对缺氧诱导因子HIF-1αmRNA序列的两个靶位点.退火形成双链,插入pSilencerTMneoU62.1真核表达载体.将构建好的载体经脂质体介导转染骨肉瘤SaOS-2细胞,观察HIF-1α基因的沉默效果.半定量RT-PCR检测HIF-1αmRNA的抑制程度,免疫荧光和免疫印迹(Western Blot)检测HIF-1α蛋白表达情况.结果测序证实成功构建HIF-1α发夹状小干涉RNA真核表达载体.转录生成的发夹状小干涉能够特异抑制HIF-1α表达.RT-PCR结果显示针对HIF-1αmRNA序列的两个靶位点的沉默效果分别为69%和92%,免疫荧光显示转染后荧光强度显著降低,免疫印迹显示两个靶位点的发夹状小干涉RNA分别使HIF-1α蛋白表达下降66%和90%.结论通过体内转录生成的发夹状小干涉RNA能够使骨肉瘤细胞缺氧诱导因子HIF-1α基因沉默.
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小鼠骨髓间充质干细胞Osterix基因特异siRNA的设计和沉默作用
目的 探讨应用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)特异性抑制骨髓间充质干细胞内Osterix基因表达,筛选高效特异性siRNA.方法 根据siRNA设计原则,针对Osterix基因序列特征设计Osterix特异siRNA(1-3),转染骨髓间充质干细胞,用QPCR和Western blot方法检测siRNA对Osterix基因的抑制效果.结果 Osterix siRNA-2可有效抑制骨髓间充质干细胞中Osterix基因的表达.随siRNA-2终浓度由50 nmol/L增加到100 nmol/L及200 nmol/L,抑制效率逐渐增强(P＜0.05);siRNA-2以终浓度200 nmol/L转染后48 h抑制效果强,72 h逐渐减弱,但仍明显抑制(P＜0.05).结论 应用RNA干扰技术可抑制骨髓间充质干细胞中Osterix基因的表达,其抑制作用具有明显的时间、浓度依赖性.
关键词： RNA干扰 Osterix基因 小鼠骨髓间充质干细胞 基因沉默 -
siRNA干扰大鼠神经元Nogo受体mRNA 表达的时程研究
目的:观察大鼠Nogo受体(NgR)特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)在原代神经元干扰其mRNA表达的时程效果.方法:体外培养大鼠原代皮层和海马细胞,应用阳离子脂质体转染试剂转染针对2个基因片段(199和964位点)的大鼠NgR特异性siRNA和对照siRNA,分别于转染后24h、48h、72h和96h,应用实时荧光定量PCR检测NgR mRNA表达情况.结果:2对siRNA(siNgR199和siNgR964)均能够下调靶基因mRNA的表达水平,24h、48h、72h和96h,NgR mRNA表达分别为对照siRNA组的38.12%、12.47%、3.96%、18.4%(siNgR199)和49.54%、24.25%、13.17%、37.93%(siNgR964),与对照siRNA组比较有统计学意义(P＜0.05).结论:NgR特异性siRNA能够在原代皮层和海马细胞下调靶基因mRNA的表达水平,且基因沉默效果在转染后3d显著.
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靶向沉默Notch1基因对人膀胱癌细胞生物学行为的影响
目的 探讨沉默Notch1基因对人膀胱癌细胞生物学行为的影响. 方法 将靶向Notch1的siRNA真核表达载体psiRNA Notch1-1转染膀胱癌细胞株T24和BIU-87,噻唑盐法、流式细胞术检测沉默Notch1后膀胱癌细胞生长、细胞周期和凋亡情况.RT-PCR和蛋白质印迹法检测转染前后Notch1基因mRNA和蛋白表达的变化. 结果 转染后72 h,T24和BIU-87细胞G0/G1期细胞比例明显增加,分别为(80.13±2.69)%和(69.44±2.41)%,与T24对照组(23.89±1.32)%和BIU-87对照组(24.63±1.68)%比较差异有统计学意义(P值均<0.05).转染后72 h,T24和BIU-87细胞凋亡率分别为(13.75±1.23)%和(8.72±1.01)%,与T24对照组(1.28±0.14)%和BIU-87对照组(1.01±0.27)%比较差异均有统计学意义(P值均<0.05).转染后24 h细胞生长明显受到抑制,该抑制作用持续到转染后96 h.转染后72 h,T24和BIU-87细胞中Notch1基因mRNA和蛋白表达明显下调(P<0.05). 结论 Notch1在膀胱癌细胞株中可能起致癌作用.沉默Notch1基因能够抑制膀胱癌细胞的增殖.
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RNAi沉默STAT3基因对人前列腺癌PC3细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用
目的 探讨pSilencer1.0-U6-siRNA-STAT3重组质粒对人前列腺癌细胞PC3裸鼠移植瘤生长的抑制作用.方法 采用裸鼠前列腺癌模型模拟siRNA-STAT3基因治疗实验,观察siRNA-STAT3重组质粒的抗瘤疗效,Western blot法检测重组质粒对STAT3基因表达的影响,HE及Tunel染色方法观察肿瘤组织形态及细胞凋亡情况.结果 肿瘤接种后第49天重组质粒组肿瘤体积为(391±56)mm3,盐水对照组为(1111±182)mm3,空质粒对照组为(981±169)mm3,与对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.01);重组质粒抑制瘤体内STAT3及pTyr-STAT3基因表达率分别为77%及68%,与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.01).HE染色证实重组质粒组出现大片细胞核固缩、破碎等凋亡征象,Tunel染色显示癌组织出现大量细胞凋亡.结论 pSilencerl.0-U6-siRNA-STAT 3重组质粒能明显抑制人前列腺癌细胞PC3裸鼠移植瘤的生长,具有良好的应用前景.
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siRNA介导的血管内皮生长因子基因沉默对膀胱癌T24细胞增殖的影响
我们应用RNA干扰技术,以血管内皮生长因子(VEGF)为靶点,对人膀胱癌T24细胞进行研究,初步探讨VEGF特异性小干扰RNA(siRNA)作为膀胱癌基因治疗手段的可能.现报告如下.
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MAP4K4在膀胱癌中的表达及对膀胱癌细胞株T24生物学行为的影响
目的 探讨丝裂原激活蛋白激酶激酶激酶激酶4(MAP4K4)对膀胱癌细胞株T24增殖、侵袭和凋亡的影响. 方法 采用基因芯片技术对2010年6月至201 1年6月5对肌层浸润性膀胱癌及癌旁组织的基凶表达谱进行初步研究,对比癌和癌旁组织的差异基因表达,筛选与膀胱癌发生、发展相关基因.结合文献检索,筛选出 MAP4K4作为研究基因,并采用PCR和蛋白质印迹法从转录和翻译水平检测16对肌层浸润性膀胱癌及癌旁组织中MAP4K4的表达情况,验证基因芯片的结果.然后设计一个空载体质粒(对照组)及MAP4K4靶向短发夹RNA (shRNA)核苷酸序列质粒(靶向干扰组)分别转染T24细胞,嘌呤霉素筛选稳定转染细胞,qRT-PCR和蛋白质印迹法检测靶基因干扰效率,并对转染后T24细胞进行MTT细胞增殖实验、Transwell细胞侵袭实验及Annexin-V法细胞凋亡检测. 结果 膀胱癌组织中MAP4K4表达高于癌旁组织(P=0.020).MAP4K4基因沉默后细胞增殖减慢(靶向干扰组与对照组,P＜0.001).靶向干扰组与对照组穿膜细胞分别为5.40±2.07和17.00±2.74(P=0.004),细胞凋亡比例分别为(15.72±6.40)％和(4.23±3.29)％(P=0.023),组间比较差异均有统计学意义. 结论 MAP4K4在膀胱癌中相对于正常组织高表达,降低MAP4K4基因表达可以抑制膀胱癌细胞的增殖、侵袭,促进细胞凋亡.MAP4K4有望成为膀胱癌治疗的新靶点.
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siRNA对人阴茎海绵体平滑肌细胞5型磷酸二酯酶表达的抑制作用
目的观察小干扰RNA(siRNA)对人阴茎海绵体平滑肌细胞5型磷酸二酯酶(PDE5)表达的抑制作用,为阴茎勃起功能障碍(ED)的基因治疗提供实验依据.方法使用美国Ambion公司提供的设计软件设计人PDE5基因的siRNA序列,并合成3对PDE5 siRNA和1对阴性对照siRNA,转染人阴茎海绵体平滑肌细胞.RT-PCR法半定量检测siRNA对PDE5 mRNA表达的抑制作用;Western blot法检测海绵体平滑肌细胞PDE5蛋白表达水平. 结果siRNA1、siRNA2和siRNA3转染后人阴茎海绵体平滑肌细胞PDE5 mRNA表达分别下降58.2%、14.9%和11.9%;PDE5蛋白表达量下降约70.5%、19.8%和17.3%;阴性对照siRNA组未引起PDE5 mRNA和蛋白表达的变化. 结论体外化学合成的PDE5 siRNA能特异有效地下调PDE5基因表达,不同序列特异性的siRNA下调PDE5基因表达的能力不同,为ED的基因治疗提供了新思路.
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RNA干扰沉默EZH2基因增强人肝癌多药耐药Bel/Fu细胞对氟尿嘧啶的敏感性
目的 研究沉默人肝癌多药耐药Bel/Fu细胞的EZH2基因表达是否影响癌细胞对氟尿嘧啶( fluorouracil,5-Fu)的敏感性.方法 体外培养肝癌多药耐药Bel/Fu细胞；EZH2 siRNA干扰沉默EZH2基因表达；RT-PCR和Western blot检测干扰后EZH2 mRNA和蛋白的表达水平；MTT法检测细胞生长抑制率；Annexin V-FITC/PI双标记法检测细胞凋亡率；流式细胞仪分析细胞周期；Western blot检测多药耐药相关蛋白MDR1的表达水平.实验设对照组、5-Fu处理组、EZH2 siRNA处理组、5-Fu和EZH2 siRNA联合处理组.结果 EZH2 siRNA干扰24h后,EZH2 mRNA和蛋白的表达水平明显降低.在联合处理组中,MTF法检测其细胞凋亡抑制率为43.17％±3.81％,明显高于其他3组；流式检测联合处理组细胞凋亡率,其细胞凋亡值为30.4％±1.77％,明显高于其他3组.流式检测联合处理组细胞周期,发现联合组G1期细胞的百分比为69.16％±2.31％,明显高于其他3组,S+G2 +M期细胞的百分比为30.76％±1.29％,明显低于其他3组,细胞周期被阻滞于G1期.检测MDR1在联合组中的表达水平,发现MDR1蛋白的表达水平明显低于其他组别.结论 RNA干扰沉默EZH2基因可以增强Bel/Fu细胞对5-Fu的敏感性,其机制可能与MDR1蛋白表达降低有关.
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短发卡RNA稳定沉默FOXM1对肝癌细胞体外生长的影响
目的 探讨短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达载体稳定沉默叉头框M1(forkhead box M1,FOXM1)基因对人肝癌细胞体外生长的影响.方法 构建针对人类FOXM1mRNA的不同干扰靶点的4个shRNA表达载体,选择干扰效果佳的表达载体和阴性对照质粒转染人肝癌细胞QGY-7703,用新霉素(G418)筛选稳定转染的克隆.用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法和平板克隆形成实验检测FOXM1基因沉默前后肝癌细胞体外生长能力的变化.用Annexin V-APC/PI双染法检测细胞凋亡.结果 不同人肝癌细胞株中普遍表达FOXM1蛋白.4个shRNA表达载体中,shRNA-1026表达载体的干扰效果佳,对FOXM1 mRNA和蛋白表达水平的抑制率分别为38.5%和53.2%.用shRNA-1026稳定沉默FOXM1基因后,QGY-7703细胞增殖受到抑制,培养48、72和96 h后,沉默组的吸光值均显著低于对照组(分别t=10.830,3.578,5.734,均P＜0.05);沉默组的克隆形成能力较对照组显著降低(t=5.336,P＜0.05),而细胞凋亡较对照组显著增加(t=6.827.P＜0.05).结论 shRNA表达载体稳定沉默FOXM1基因抑制肝癌细胞的生长.
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Atrogin-1基因沉默对肌细胞营养不良保护作用的实验研究
目的 采用肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的肌细胞营养不良模型和核糖核酸干扰技术,研究Atrogin-1基因沉默对肌细胞营养不良的保护作用.方法 设计5对Atrogin-1-siRNA靶序列及对照序列,逐步克隆到慢病毒核心载体FG12中,重组FG12与三种包装质粒(pRSVREV、pMDLg/pRRE、pHCMV-G)共同转染293T细胞以包装病毒,感染C2C12细胞,并将其分化成肌管,用TNF-α进行刺激,实时荧光定量PCR法、Western blot法检测肌管中Atragin-1表达,观察比较各组肌管的形态学变化.结果 重组载体中含大小、序列正确的片段,能成功感染C2C12细胞,TNF-α能引起对照组肌管Atrogin-1表达上调、肌管萎缩,但RNA干扰组肌管无此现象.结论 沉默Atrogin-1基因可避免产生TNF-α诱导的肌细胞营养不良,Atrogin-1基因可作为肿瘤恶液质的理想治疗靶点.
关键词： RNA干扰 基因沉默 肌细胞营养不良 Atrogin-1基因 -
CXCR4基因沉默对小鼠黑素瘤的抑瘤效应及器官转移影响
目的 探讨短发夹RNA(shRNA)沉默CXCR4基因对小鼠黑素瘤的抑瘤效应及器官转移的影响.方法 设计合成CXCR4特异性shRNA插入pSilencer载体,转染人高转移性黑素瘤细胞株MV3,通过小鼠尾静脉瘤细胞注射方法,建立黑素瘤转移模型,观察肿瘤生长情况,分析CXCR4基因沉默对黑素瘤细胞肝、脑、肺等实质性器官转移的影响.实验随机分为3组:A组(CXCR4-shRNA转染组)、B组(无关对照组)和C组(空白对照组).结果 小鼠黑素瘤皮下种植瘤成功率为100％,肿瘤生长曲线表明,A组肿瘤生长明显抑制.A组与C组和B组比较差异具有统计学意义(P＜0.01).肝、脑组织内转移瘤数目A组较B组和C组明显少.黑素瘤定向肺转移能力下降:B、C组和A组肺转移发生率分别为90.0％、87.5％和20.0％；B、C组和A组的肺转移结节数目分别为206、165和23个.结论 shRNA介导的CXCR4基因沉默可在黑素瘤皮下种植瘤产生抑瘤效应,明显降低肝、脑器官转移能力和定向肺转移能力.
关键词： 黑素瘤 趋化因子受体CXCR4 基因沉默 肿瘤转移 -
Livin 基因短发夹状 RNA 对子宫颈癌 Siha 细胞增殖迁移的影响
Livin基因作为近年来发现的一种人类凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP),低表达于健康成人组织和胚胎组织中,而高表达于包括黑色素瘤、淋巴瘤、结肠癌前列腺癌、宫颈癌、乳腺癌等[1-3]多种类型的肿瘤组织中.已有研究表明,Livin基因在肿瘤细胞的增殖和凋亡过程中发挥着重要作用,加之Livin基因特异性表达于肿瘤细胞,因此,其可能作为诱导肿瘤细胞凋亡过程中的一个新靶点而备受关注.RNA干扰(RNAi)技术是近年发展起来的一种新的分子生物学实验技术,是双链RNA(double stranded RNA dsRNA)引发的转录后水平基因沉默[4],能特异高效地阻断靶基因的表达,进而使相应蛋白表达下调[5].
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靶向MDR1基因的小分子干扰RNA对卵巢上皮性癌裸鼠移植瘤多药耐药的抑制作用
化疗是治疗晚期卵巢上皮性癌(卵巢癌)的重要手段,但多药耐药的产生常使化疗不能达到理想的效果,而多药耐药基因--MDR1基因编码的P糖蛋白(P-gP)的过度表达是导致肿瘤细胞耐药的直接原因.已有研究表明,小分子干扰RNA(siRNA)可诱导序列特异性基因沉默[1].
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短发夹状RNA抑制AKT2基因表达增强卵巢上皮性癌细胞对紫杉醇敏感性的研究
RNA干扰(RNAi)技术是运用双链RNA引发的转录后水平基因沉默机制[1],特异性抑制靶基因转录,进而下调相应蛋白表达水平及功能.新近的RNAi技术,是利用DNA载体直接在体内表达短发夹状RNA(shRNA),特异性封闭相应的靶基因mRNA,抑制mRNA的翻译.与早期的RNA干扰技术相比,该方法的特异性和干扰效率均有较大提高,已广泛应用于多种研究领域.利用RANi技术特异地抑制癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表达,使这些基因保持在沉默或休眠状态,从而使肿瘤细胞增殖速度减慢,凋亡加快,显示了RNAi技术用于肿瘤基因治疗的可行性和有效性.
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轴突导向因子netrin-1基因沉默对胎盘血管生成影响的体内外实验研究
目的 研究轴突导向因子netrin-1基因沉默对胎盘血管生成的影响.方法 应用RNA 干扰技术分别沉默netrin-1基因在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和孕鼠胎盘组织中的表达;用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞活性;克隆形成实验检测细胞增殖能力;细胞迁移实验检测细胞迁移能力;小管形成实验检测细胞管腔形成能力;观察胎鼠体质量;CD34因子的免疫组化链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)法检测孕鼠胎盘的微血管密度.结果 (1)HUVEC:沉默netrin-1基因后,HUVEC细胞活性受到抑制,克隆形成率由(69±6)%降至(46±5)%,迁移细胞数由(86±17)个降至(46±13)个,小管形成的分支点数由(37±9)个降至(17±5)个,HUVEC的netrin-1基因沉默前后比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).(2)孕鼠胎盘组织:沉默孕鼠胎盘组织netrin-1基因后,胎鼠体质量由(2.39±0.17)g降至(2.12±0.10)g,胎盘微血管密度由(258±38)条/mm2降至(197±32)条/mm2,孕鼠胎盘组织netrin-1基因沉默前后比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 沉默netrin-1基因,可以抑制体外HUVEC的细胞活性及增殖、迁移和管腔形成能力,同时使体内胎盘组织的血管生成能力下降.netrin-1是重要的促胎盘血管生长基因.
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SPOCK2基因表观失活在卵巢子宫内膜异位症恶变中的作用
目的 通过比较卵巢子宫内膜异位症(内异症)恶变患者的恶变组织、异位内膜组织和在位内膜组织中SPOCK2基因的甲基化及蛋白表达情况,探讨该基因的表观失活在卵巢内异症恶变中的作用.方法 选择2005年1月至2011年1月在中国医科大学附属盛京医院妇产科住院手术、并经术后病理确诊为卵巢内异症恶变患者22例的病理石蜡标本为恶变组(包括11例卵巢内膜样癌、8例透明细胞癌、2例浆液性囊腺癌及1例黏液性囊腺癌),以同期22例单纯卵巢内异症患者的异位内膜及在位内膜的病理石蜡标本(内异症组)及16例宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅲ患者的正常子宫内膜的病理石蜡标本(对照组)为对照.通过显微切割技术分别获取恶变组患者的恶变组织22份,癌旁异位内膜组织15份及在位内膜组织10份;内异症组患者的异位内膜组织22份及在位内膜组织17份;对照组患者的正常子宫内膜组织16份.通过亚硫酸盐修饰后酶切技术检测各组织中SPOCK2基因甲基化情况,免疫组化SP法检测SPOCK2基因的蛋白表达情况.探讨SPOCK2基因异常甲基化与其蛋白表达的关系.结果 (1)SPOCK2基因甲基化情况:恶变组患者的恶变组织中,SPOCK2基因甲基化发生率为45％(10/22),显著高于癌旁异位内膜组织(1/15),两者比较,差异有统计学意义(P＜0.05);恶变组患者的癌旁内异症组织中SPOCK2基因甲基化发生率(1/15)与内异症组患者的异位内膜(5％,1/22)比较,差异无统计学意义(P＞0.05).(2)SPOCK2基因蛋白表达情况:恶变组患者的恶变组织中SPOCK2基因蛋白表达缺失率为44％(11/22),显著高于恶变组患者癌旁异位内膜组织的2/15,两者比较,差异有统计学意义(P＜0.05);但恶变组患者癌旁异位内膜组织中SPOCK2基因蛋白表达缺失率(2/15)与内异症组异位内膜(5％,1/22)比较,差异无统计学意义(P＞0.05).3组在位内膜组织中SOPCK2基因的蛋白表达缺失率比较,差异无统计学意义(P＞0.05).(3)SPOCK2基因甲基化与其蛋白表达缺失的关系:SPOCK2基因异常甲基化能够导致其蛋白表达缺失( 20/22,P＜0.05).结论 SPOCK2基因的表观失活与卵巢内异症恶变相关.
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RNA干涉在肿瘤研究中的应用进展
RNA 干涉(RNA interference,RNAi)是生物体内的一种通过双链RNA(d ouble-stranded RNA,dsRNA)来抵抗病毒入侵和抑制转座子活动的自然机制,近来研究发现,21～25nt大小的小干涉RNA(small interfering RNA,siRNA)可在哺乳动物细胞中介导高度序列特异性的基因沉默,并且具有高效性和序列特异性,已经成为功能基因组研究的有力工具,并且有可能在某些疾病如肿瘤等的基因治疗中发挥重要作用.
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沉默T细胞Cbl-b基因对4T1细胞免疫杀伤作用影响
目的 乳腺癌发生发展与机体免疫水平有密切关系,而Cbl-b基因可作为抗肿瘤治疗的免疫靶点.利用超声介导微泡破裂技术(ultrasound-targeted microbubble destruction,UTMD)沉默T细胞Cbl-b基因表达,观察转染T细胞对4T1乳腺癌细胞的体外免疫杀伤效率.方法 磁珠分选纯化T细胞,构建靶向Cbl-b基因的短发夹RNA(short-hair-pin RNA,shRNA)表达质粒,超声微泡介导转染48 h后,荧光显微镜和流式细胞仪评估细胞转染效率,蛋白质印迹法检测Cbl-b蛋白表达情况.转染72 h后,利用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)比较各组细胞上清液中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)分泌水平.转染72 h后,观察对比单纯T细胞、阴性对照T细胞及转染T细胞与小鼠4T1乳腺癌细胞共培养时肿瘤杀伤效率.结果 原代培养T细胞纯度为93.7％.利用UT-MD技术介导shRNA转染效率达到61.3％.qPCR和蛋白质印迹法检测结果显示,Cbl-b基因和蛋白水平表达均能被有效抑制.与空白组(1.007±0.022)相比,实验组Cbl-b mRNA表达量(0.333±0.046)明显降低,P<0.001;实验组、对照组和空白组Cbl-b蛋白相对表达量分别为0.301±0.080、0.773±0.101和0.719±0.090,检验统计量组间总变异,F=38.751,P<0.001;实验组Cbl-b蛋白表达显著降低.与空白组〔(74±6)pg/mL〕相比,实验组T细胞因子TNF-α分泌〔(157±26)pg/mL〕水平明显升高,P=0.001.转染72 h后,与空白组及阴性对照组T细胞相比,在15:1(P=0.046)、30:1(P=0.028)和60:1(P=0.003)的效靶比水平,转染T细胞杀瘤活性均明显增高.结论 利用UTMD技术介导shRNA转染能有效沉默Cbl-b基因表达,促进T细胞免疫活性,增强T细胞对小鼠4T1乳腺癌细胞的体外免疫杀伤效率.
关键词： Cbl-b 超声介导微泡破裂技术 基因沉默 乳腺癌 免疫治疗 -
shRNA沉默CDK2基因对B16-F1细胞小鼠皮下移植瘤的影响
目的 早期恶性黑色素瘤可以通过手术切除的方式得到缓解,发生转移的黑色素瘤由于其耐药性,预后较差.为探索治疗黑色素瘤的新方法,本研究探讨由慢病毒载体pUL介导的shRNA沉默CDK2基因对黑色素瘤细胞B16-F1皮下移植瘤生长的影响.方法 于C57BL/6小鼠右侧腹股沟皮下注射B16-F1细胞建立移植瘤模型,采用癌灶多点注射的方法分为空白对照组、阴性对照组和实验组(n=5).阴性对照组,采用癌灶多点注射的方法将携带NC-shRNA的重组慢病毒(滴度为2×108 TU/mL)导入肿瘤灶,每只小鼠200,μL,隔日1次,共6次,观察18 d;空白对照组,用与阴性对照组相同的方式方法向瘤体注射PBS,观察18 d;实验组,采用癌灶多点注射的方法将携带CDK2-shRNA的重组慢病毒(滴度为2×108 TU/mL)导入肿瘤灶,每只小鼠200 μL,隔日1次,共6次,观察18d.观察肿瘤生长情况并绘制肿瘤生长曲线,18 d后杀鼠取瘤称瘤质量,计算肿瘤生长抑制率,TUNEL检测肿瘤组织细胞凋亡情况,蛋白质印迹法检测肿瘤组织细胞中CDK2蛋白表达情况.结果 C57BL/6小鼠接种瘤细胞3d后均有肿瘤形成.治疗的第6天空白对照组、阴性对照组和实验组的肿瘤体积分别为(48.7±8.4)、(50.0±8.9)和(31.4±8.7) mm3,实验组与空白对照组和阴性对照组相比,肿瘤生长速度明显降低,差异有统计学意义,F=8.879,P=0.004.空白对照组、阴性对照组和实验组的肿瘤重量分别为(0.56±0.10)、(0.55±0.11)和(0.28±0.07)g,实验组与空白对照组和阴性对照组相比,肿瘤体质量明显降低,差异有统计学意义(F=13.659,P=0.001),实验组与空白对照组相比肿瘤生长抑制率为50.2％;空白对照组、阴性对照组和实验组的细胞凋亡指数分别为(7.73±1.08)％、(7.87±1.42)％和(32.27±3.62)％,实验组与空白对照组和阴性对照组相比,瘤细胞凋亡指数显著升高,差异有统计学意义,F=189.748,P＜0.001.实验组与空白对照组和阴性对照组相比,组织细胞中CDK2蛋白的表达显著降低,差异有统计学意义(F=293.346,P＜0.001),实验组相对于空白对照组CDK2蛋白表达的抑制率为50.4％.结论 重组慢病毒CDK2-shRNA沉默CDK2基因的表达能有效抑制B16-F1细胞移植瘤的生长,CDK2基因可能成为黑色素瘤基因治疗的有效靶点.
