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超声微泡介导Itch基因沉默增强T细胞对肺腺癌细胞LA795免疫杀伤作用
目的 利用超声介导微泡破裂技术(UTMD)沉默T细胞Itch基因表达,观察转染T细胞对肺腺癌细胞LA795的体外免疫杀伤效率.方法 磁珠分选纯化T细胞,构建靶向Itch基因的shRNA表达质粒,超声微泡介导转染48 h后,荧光显微镜和流式细胞仪评估细胞转染效率,Western blot检测Itch蛋白表达.转染72 h后,酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞上清液中IL-2和IFN-γ分泌水平,观察对比单纯T细胞、阴性对照T细胞及转染T细胞与小鼠肺腺癌细胞LA795共培养时肿瘤杀伤率.结果 利用UTMD技术介导shRNA转染效率达到52.3% ±3.8%,Itch蛋白表达能够有效被抑制.转染72 h后,超声微泡介导沉默Itch基因显著增加T细胞因子IL-2和IFN-γ分泌水平(P<0.05);与空白组或阴性对照组T细胞相比,在不同的靶效比水平(10 : 1、20 : 1、40 : 1),转染T细胞杀瘤活性均明显增高(P<0.05).结论 利用UTMD技术介导shRNA转染能有效沉默Itch基因表达,促进T细胞免疫活性,增强T细胞对小鼠肺腺癌细胞LA795的体外免疫杀伤效率.
关键词： Itch 超声介导微泡破裂技术 基因沉默 肺肿瘤 免疫治疗 -
沉默T细胞Cbl-b基因对4T1细胞免疫杀伤作用影响
目的 乳腺癌发生发展与机体免疫水平有密切关系,而Cbl-b基因可作为抗肿瘤治疗的免疫靶点.利用超声介导微泡破裂技术(ultrasound-targeted microbubble destruction,UTMD)沉默T细胞Cbl-b基因表达,观察转染T细胞对4T1乳腺癌细胞的体外免疫杀伤效率.方法 磁珠分选纯化T细胞,构建靶向Cbl-b基因的短发夹RNA(short-hair-pin RNA,shRNA)表达质粒,超声微泡介导转染48 h后,荧光显微镜和流式细胞仪评估细胞转染效率,蛋白质印迹法检测Cbl-b蛋白表达情况.转染72 h后,利用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)比较各组细胞上清液中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)分泌水平.转染72 h后,观察对比单纯T细胞、阴性对照T细胞及转染T细胞与小鼠4T1乳腺癌细胞共培养时肿瘤杀伤效率.结果 原代培养T细胞纯度为93.7％.利用UT-MD技术介导shRNA转染效率达到61.3％.qPCR和蛋白质印迹法检测结果显示,Cbl-b基因和蛋白水平表达均能被有效抑制.与空白组(1.007±0.022)相比,实验组Cbl-b mRNA表达量(0.333±0.046)明显降低,P<0.001;实验组、对照组和空白组Cbl-b蛋白相对表达量分别为0.301±0.080、0.773±0.101和0.719±0.090,检验统计量组间总变异,F=38.751,P<0.001;实验组Cbl-b蛋白表达显著降低.与空白组〔(74±6)pg/mL〕相比,实验组T细胞因子TNF-α分泌〔(157±26)pg/mL〕水平明显升高,P=0.001.转染72 h后,与空白组及阴性对照组T细胞相比,在15:1(P=0.046)、30:1(P=0.028)和60:1(P=0.003)的效靶比水平,转染T细胞杀瘤活性均明显增高.结论 利用UTMD技术介导shRNA转染能有效沉默Cbl-b基因表达,促进T细胞免疫活性,增强T细胞对小鼠4T1乳腺癌细胞的体外免疫杀伤效率.
关键词： Cbl-b 超声介导微泡破裂技术 基因沉默 乳腺癌 免疫治疗 -
超声微泡介导沉默T淋巴细胞Itch基因对胃癌MFC细胞免疫杀伤作用的实验硏究
目的 利用超声介导微泡破裂技术(UTMD)沉默T淋巴细胞Itch基因表达,观察转染T细胞对胃癌MFC细胞的免疫杀伤效率.方法 免疫磁珠分离T淋巴细胞,构建靶向Itch基因的shRNA表达质粒,超声微泡介导转染48 h后,流式细胞仪分析T细胞转染成功率,Western blot测定T细胞Itch蛋白表达.转染24 h后,流式细胞仪检测T淋巴细胞活化早期标志CD69表达.转染72 h后,观察对比单纯T淋巴细胞、阴性对照T淋巴细胞及转染T淋巴细胞与小鼠胃癌MFC细胞共培养时肿瘤杀伤率.结果 利用UTMD技术介导shRNA转染效率达到51.9％, Itch蛋白表达能被有效抑制.转染24h后,转染组T淋巴细胞早期活化标志CD69表达较其他组更高.转染72 h后,与阴性对照组和空白组相比,在不同的效靶比水平(10: 1、 20: 1、40: 1), 转染T淋巴细胞杀瘤活性均增强.结论 利用UTMD技术介导shRNA转染能有效沉默 Itch基因表达,促进T淋巴细胞免疫活性,增强T淋巴细胞对胃癌MFC细胞的免疫杀伤效率.
关键词： Itch 超声介导微泡破裂技术 基因沉默 胃癌 免疫治疗
