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超声微泡介导Itch基因沉默增强T细胞对肺腺癌细胞LA795免疫杀伤作用
目的 利用超声介导微泡破裂技术(UTMD)沉默T细胞Itch基因表达,观察转染T细胞对肺腺癌细胞LA795的体外免疫杀伤效率.方法 磁珠分选纯化T细胞,构建靶向Itch基因的shRNA表达质粒,超声微泡介导转染48 h后,荧光显微镜和流式细胞仪评估细胞转染效率,Western blot检测Itch蛋白表达.转染72 h后,酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞上清液中IL-2和IFN-γ分泌水平,观察对比单纯T细胞、阴性对照T细胞及转染T细胞与小鼠肺腺癌细胞LA795共培养时肿瘤杀伤率.结果 利用UTMD技术介导shRNA转染效率达到52.3% ±3.8%,Itch蛋白表达能够有效被抑制.转染72 h后,超声微泡介导沉默Itch基因显著增加T细胞因子IL-2和IFN-γ分泌水平(P<0.05);与空白组或阴性对照组T细胞相比,在不同的靶效比水平(10 : 1、20 : 1、40 : 1),转染T细胞杀瘤活性均明显增高(P<0.05).结论 利用UTMD技术介导shRNA转染能有效沉默Itch基因表达,促进T细胞免疫活性,增强T细胞对小鼠肺腺癌细胞LA795的体外免疫杀伤效率.
关键词： Itch 超声介导微泡破裂技术 基因沉默 肺肿瘤 免疫治疗 -
ITCH的功能及其与疾病的关系
ITCH又称AIP4(atrophin 1 相互作用蛋白4),初是在研究小鼠表皮颜色时被发现的.ITCH是一个单体蛋白,属于同源的HECT类型的泛素连接酶E3家族,参与体内多种蛋白质的泛素化降解过程;参与免疫反应;参与多种细胞过程,包括细胞循环、增殖和凋亡;在肿瘤的形成过程中发挥重要的作用.现就ITCH的功能及其与疾病的关系研究进展予以综述.
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泛素蛋白连接酶Itch生物活性及其免疫调节作用
泛素-蛋白酶体通路是选择性降解蛋白质的重要途径,在细胞分裂调节、DNA修复及肿瘤细胞消除等方面具有重要作用.E3泛素连接酶能够特异性识别并结合底物蛋白,是泛素-蛋白酶体通路中靶蛋白降解的关键调节分子.Itch是近期发现的一种高度保守的HECT家族E3泛素连接酶,在免疫调节、细胞凋亡等多种生物过程中发挥重要调节功能.本文对泛素连接酶Itch生物活性的研究进展作一综述.
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特异性小干扰RNA沉默Itch基因增强小鼠T细胞对MFC胃癌细胞的免疫杀伤作用
背景与目的：Itch蛋白是一种具有调节T细胞免疫应答起始的关键分子，属于E3泛素转移酶家族，广泛参与细胞内多种信号蛋白如ZAP70、P85、VAV、PLC-γ和PKC-θ等的泛素化修饰过程，在肿瘤诱导机体免疫耐受中起着重要作用。Itch通过调节T细胞表面受体活性及转移生长因子-β信号通路来介导T细胞免疫无反应性，诱导外周组织Treg细胞增殖。因此，通过改变Itch蛋白表达活性有望成为一种治疗自体免疫性疾病和肿瘤的有效途径。我们利用特异性小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)沉默T细胞Itch基因的表达，观察转染T细胞对小鼠MFC胃癌细胞的体外免疫杀伤作用。方法：分离615小鼠脾脏T细胞，筛选高效特异性沉默Itch基因的siRNA序列转染T细胞，蛋白质印迹法检测各分组Itch蛋白的表达水平；转染72 h后，利用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测细胞因子IL-2、INF-γ分泌情况，比较空白组、空转组及转染组T细胞与小鼠MFC胃癌细胞混合培养肿瘤杀伤率。结果：转染48 h后，与对照组相比，转染T细胞Itch蛋白表达率降低至16%；转染72 h后，检测转染组、空转组、空白组细胞因子IL-2分泌水平分别为(1891.96±141.91)pg/mL，(1241.69±91.67)pg/mL，(1175.03±89.14)pg/mL(P<0.001)，转染组、空转组、空白组细胞因子INF-γ分泌水平分别为(958.33±75.46)pg/mL，(683.33±66.67)pg/mL，(691.72±68.72)pg/mL(P<0.05)。在体外实验中，与空白组及空转组T细胞相比，转染组T细胞能更高效地杀伤小鼠MFC胃癌细胞，高杀瘤率达到(54.18±2.96)%。结论：利用特异性siRNA技术沉默Itch基因能够促进小鼠T细胞因子IL-2、INF-γ分泌，增强T细胞对小鼠MFC胃癌细胞的体外免疫杀伤作用。
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Intradermal administration of formalin to the cheek induces itch as well as pain behaviors in rats
Objective· Formalin is a classic and most widely used algogenic substance,but its itchy effect is not clear.The present study aims to explore the hypothesis that formalin may induce itch as well as pain.Methods· Flinching,as well as licking and forelimb wiping of the site of injection were counted as pain responses,whereas biting and hind paw scratching of the cheek were counted as itchy responses.To discriminate formalin-induced sensations in rats,the irritant (saline as control) was injected,and then pain and itchy responses were recorded.Results · Intraplantar injection of formalin elicited biphasic behavior responses characterized as flinching,as well as biting or licking of the hind paw without significant gender differences.Following intradermal administration of formalin to the cheek,rats exhibited episodic forelimb wiping of the cheek,representative of pain.No gender difference was noticed for this type of behavior.In addition,episodes of hind paw scratches of the cheek,representative of pruritoceptive responses,also occurred.Interestingly,hind paw scratches appeared to be more pronounced in male than in female rats.Conclusion · Intradermal administration of formalin elicits pruritoceptive as well as nociceptive responses in rats.
关键词： formalin cheek model Itch Pain -
超声微泡介导沉默T淋巴细胞Itch基因对胃癌MFC细胞免疫杀伤作用的实验硏究
目的 利用超声介导微泡破裂技术(UTMD)沉默T淋巴细胞Itch基因表达,观察转染T细胞对胃癌MFC细胞的免疫杀伤效率.方法 免疫磁珠分离T淋巴细胞,构建靶向Itch基因的shRNA表达质粒,超声微泡介导转染48 h后,流式细胞仪分析T细胞转染成功率,Western blot测定T细胞Itch蛋白表达.转染24 h后,流式细胞仪检测T淋巴细胞活化早期标志CD69表达.转染72 h后,观察对比单纯T淋巴细胞、阴性对照T淋巴细胞及转染T淋巴细胞与小鼠胃癌MFC细胞共培养时肿瘤杀伤率.结果 利用UTMD技术介导shRNA转染效率达到51.9％, Itch蛋白表达能被有效抑制.转染24h后,转染组T淋巴细胞早期活化标志CD69表达较其他组更高.转染72 h后,与阴性对照组和空白组相比,在不同的效靶比水平(10: 1、 20: 1、40: 1), 转染T淋巴细胞杀瘤活性均增强.结论 利用UTMD技术介导shRNA转染能有效沉默 Itch基因表达,促进T淋巴细胞免疫活性,增强T淋巴细胞对胃癌MFC细胞的免疫杀伤效率.
关键词： Itch 超声介导微泡破裂技术 基因沉默 胃癌 免疫治疗
