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发夹状小干涉RNA文献资料
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短发夹状RNA使骨肉瘤细胞缺氧诱导因子HIF-1α基因沉默
目的构建低氧诱导因子HIF-1α发夹状小干涉RNA真核表达载体,观察发夹状双链小干涉RNA对骨肉瘤细胞HIF-1的转录后的基因沉默效果.方法体外合成两对互补的寡核苷酸链,分别针对缺氧诱导因子HIF-1αmRNA序列的两个靶位点.退火形成双链,插入pSilencerTMneoU62.1真核表达载体.将构建好的载体经脂质体介导转染骨肉瘤SaOS-2细胞,观察HIF-1α基因的沉默效果.半定量RT-PCR检测HIF-1αmRNA的抑制程度,免疫荧光和免疫印迹(Western Blot)检测HIF-1α蛋白表达情况.结果测序证实成功构建HIF-1α发夹状小干涉RNA真核表达载体.转录生成的发夹状小干涉能够特异抑制HIF-1α表达.RT-PCR结果显示针对HIF-1αmRNA序列的两个靶位点的沉默效果分别为69%和92%,免疫荧光显示转染后荧光强度显著降低,免疫印迹显示两个靶位点的发夹状小干涉RNA分别使HIF-1α蛋白表达下降66%和90%.结论通过体内转录生成的发夹状小干涉RNA能够使骨肉瘤细胞缺氧诱导因子HIF-1α基因沉默.
