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反义hTERT基因对白血病细胞端粒酶表达及活性的抑制作用
目的探讨反义hTERT基因体外对白血病细胞端粒酶基因表达及其活性的抑制作用. 方法采用基因重组技术设计并构建了针对端粒酶活性蛋白催化亚单位mRNA的5′端序列的反义pcDNA-hTERT真核表达载体,通过SuperFect(QIAGEN)将其瞬时转染人早幼粒白血病细胞株HL60及人红白血病细胞株K562,并运用流式细胞术测定其细胞凋亡与细胞周期的变化,同时运用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应方法对其端粒酶蛋白催化亚单位基因的表达水平进行了检测,端粒酶活性的检测则采用了非放射性TRAP-银染法.结果成功地构建了反义pcDNA-hTERT真核表达载体,并将其转染至K562和HL60白血病细胞株.结果与空载体组、空白组相比,反义pcDNA-hTERT组体外显示出明显有效地抑制端粒酶的基因表达及其活性的作用;在细胞凋亡与细胞周期方面,反义组能引起细胞周期左移,增殖分裂能力降低,同时伴有细胞凋亡数的增加.结论研究构建的反义hTERT基因体外确实能明显有效地下调白血病细胞端粒酶的基因表达及其活性,在抗肿瘤基因治疗中具有特异的靶向性和潜在应用的广谱性.
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两种不同类型ING1表达对人癌细胞生长影响的比较
目的比较两种不同类型ING1剪接体表达对人癌细胞系生长影响的异同及其作用.方法构建人p33/ING1A和p47/ING1B表达重组子,用瞬时转染和稳定转染法分别导入表达野生型p53的人乳腺癌细胞系MCF-7和肺癌细胞系PAa,用噻唑蓝比色法和软琼脂集落形成观察其生长变化及用Western blot法检测相关基因表达状况.结果瞬时和稳定转染后两种癌细胞系都有p47/ING1A和p33/ING1B表达,但p33/ING1表达量明显高于p47/ING1.外源性p33/ING1B高表达对细胞生长具有抑制作用,细胞出现G0～G1期阻滞(P<0.01);外源性p47/ING1A过表达对细胞生长无明显影响.转染p33/ING1B并出现生长抑制的肿瘤细胞p21WAF1表达水平明显升高,但p53表达并没有变化.结论两种不同类型ING1剪接体过量表达对肿瘤细胞生长具有不同影响.外源性p33/ING1B过量表达可以促进p21WAF1表达,协同p53引起细胞周期阻滞从而抑制肿瘤细胞生长,是p53基因治疗的潜在伴侣.
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回输转染饰胶蛋白聚糖基因的肾系膜细胞对大鼠抗thy-1血清性肾炎的拮抗作用
目的以转染饰胶蛋白聚糖(decorin)基因的肾系膜细胞(MsC)为载体,经肾动脉回输入抗thy-1血清性肾炎大鼠肾小球,观察其存活情况及对模型大鼠肾小球病变的影响及意义.方法用脂质体介导法将载有目的基因(decorin)片段转入正常MsC株而获得阳性表达之细胞克隆;经尾静脉注射兔抗大鼠thy-1血清(ATS)复制其抗thy-1系膜增生性肾炎模型;经左肾动脉将转基因MsC回输入thy-1肾炎大鼠肾小球,并经该鼠MsC原代培养、BrdU和decorin蛋白免疫组织化学染色结合图像分析观察其生存情况;应用转化生长因子β1(TGF-β1)、纤连蛋白和Ⅳ型胶原免疫组织化学结合图像分析研究对thy-1系膜增生性肾炎动物模型肾小球病变的影响.结果经制备兔抗大鼠ATS,将其从尾静脉注入大鼠体内成功复制thy-1系膜增生性肾炎模型.经左肾动脉直接注入转染decorin基因的MsC克隆(D-A6),经原代培养证实其生长活跃,用免疫组织化学法发现其细胞核和细胞质均可分别表达BrdU和decorin蛋白.与未经注射对侧肾相比,回输侧肾的肾小球TGF-β1、纤连蛋白和Ⅳ型胶原的表达均降低,分别为TGF-β1 4 d时P<0.05和纤连蛋白、Ⅳ型胶原1～2 d时P<0.01.结论通过肾动脉直接输入法将转染decorin基因的细胞克隆回输入大鼠抗thy-1血清性肾炎肾小球内,并观察到对病变肾小球的拮抗作用,这为肾小球肾炎动物模型的基因治疗提供实验依据.
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反义Bmi-1 RNA转染对人肺癌细胞株A549体外增殖的影响
目的 研究转染反义Bmi-1 RNA对人肺腺癌细胞A549的体外增殖及细胞周期和凋亡的影响.方法 将表达反义Bmi-1 RNA的真核表达载体稳定转染A549细胞株,GA18筛选挑取阳性克隆.应用即时荧光定量RT-PCR及Western blot检测转染后Bmi-1基因在mRNA水平及蛋白水平的表达;应用MTT比色法及平板克隆形成实验检测A549细胞体外生长能力;用PI单染及Annexin-V-PI双染技术在流式细胞仪上检测细胞周期及凋亡情况.结果 Western blot结果显示转染反义Bmi-1RNA使A549细胞中Bmi-1蛋白表达量减少了95%;MTT检测细胞生长曲线表明反义Bmi-1 RNA使A549细胞生长速度明显减慢;平板克隆形成实验结果显示转染反义Bmi-1 RNA的A549细胞在平板中形成集落的数目(0.67±0.50)明显低于未转染组(73.0±4.1)及转染空质粒组(67.0±4.0,P<0.01);流式细胞仪结果显示反义Bmi-1使A549细胞阻滞在G_0/G_1期,但对细胞凋亡没有影响.结论 反义Bmi-1 RNA在体外对A549细胞增殖有明显的抑制作用,其抑制作用是通过使A549细胞阻滞在G0/G1期实现的.
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HCV NS3 N端多肽诱导人肝细胞系转化及成瘤实验
目的研究丙型肝炎病毒(HCV)非结构区3 N端多肽(HCV NS3-5′)对人肝细胞株QSG7701的转化作用及致癌性.方法通过脂质体介导将含有HCV NS3 N端cDNA的真核表达质粒(pRcHCNS3-5′)导入人源性肝细胞株QSG7701,G418筛选目的基因表达的细胞;聚合酶链反应(PCR)及免疫组织化学SP法检测细胞中HCV NS3基因及蛋白的表达;细胞计数,锚着非依赖性生长实验,成瘤性检测等鉴定其生物学行为变化,免疫组织化学S-P法检测所致肿瘤中HCV NS3及c-myc蛋白表达.结果 HCV NS3-5′转染的QSG7701细胞中NS3蛋白过度表达于胞质,质粒pRcHCNS3-5′转染细胞的倍增时间较pRcCMV转染细胞和未转染QSG7701细胞明显缩短(分别为12 h,26 h,28 h).pRcHCNS3-5′和pRcCMV转染细胞及未转染QSG7701在软琼脂中的克隆形成率分别为33.0%、1.5%、1.1%.pRcHCNS3-5′转染细胞的克隆率高于其他两种转染细胞(P<0.01).三种细胞接种裸鼠后, pRcHCNS3-5′转染细胞注射组出现肿瘤,为肝细胞癌,肿瘤组织有HCV NS3蛋白和c-myc蛋白的表达.阳性对照组亦出现肿瘤,而pRcCMV转染细胞及未转染QSG7701细胞注射组在注射40 d后仍未见肿瘤发生.结论 HCV NS3 N端蛋白具有转化细胞和促进肿瘤发生的作用.
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转化生长因子β1/Smad信号通路对大鼠肾系膜细胞基质金属蛋白酶2及其组织抑制因子2表达的影响
目的探讨转化生长因子β1(TGF-β1)/Smad信号通路对大鼠肾系膜细胞(MsC)基质金属蛋白酶2(MMP-2)及其组织抑制因子-2(TIMP-2)蛋白表达和酶活性的影响.方法采用脂质体介导法,分别将Smad 2﹑3﹑7基因瞬时转染体外培养的大鼠MsC,并用免疫荧光﹑逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western印迹法检测其转染成功与否;再分别用Western印迹﹑酶谱法或反式酶谱法,观察转基因MsC及其在TGF-β1作用下MMP-2和TIMP-2 蛋白表达和酶活性的改变.结果转染Smad 2基因的MsC,MMP-2和TIMP-2 蛋白表达和酶活性均略有升高,蛋白表达分别增强1.4倍和1.1倍;酶活性分别提高1.4倍和1.3倍,经TGF-β1作用后有明显升高,蛋白表达分别增加2.8倍和3.0倍(P<0.01);酶活性分别提高3.0倍和1.7倍(P<0.01);转染Smad 3基因的MsC,TIMP-2蛋白表达和酶活性略有升高,蛋白表达增强1.2倍,酶活性提高1.2倍,TGF-β1作用后升高更为明显,蛋白表达增强2.9倍,酶活性提高1.8倍,而MMP-2蛋白表达和酶活性均无明显变化;转染Smad 7基因的MsC,MMP-2和TIMP-2 蛋白表达和酶活性均略有下降,蛋白表达均降低1.2倍,酶活性均下降1.2倍,在TGF-β1作用下更为明显,蛋白表达分别降低2.2倍和2.1倍(P<0.01),酶活性分别下降2.8倍和1.5倍(P<0.01).结论 TGF-β1/Smad信号通路可能通过改变MsC的MMP-2/TIMP-2表达而干扰肾小球细胞外基质代谢过程,从而在肾小球硬化发生中发挥重要作用.
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转染survivin反义mRNA对Jurkat淋巴瘤细胞生长和化疗敏感性的影响
目的研究转染survivin 反义mRNA对Jurkat淋巴瘤细胞生长的影响以及转染后淋巴瘤细胞对化疗药物的敏感性.方法构建survivin 反义mRNA真核表达质粒pcDNA3.1-反义(As)survivin;利用脂质体转染法将其转入高表达survivin mRNA T淋巴母细胞淋巴瘤Jurkat细胞系,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组织化学SP法、Western印迹法检测细胞中survivin表达;用细胞计数、流式细胞术(FCM)检测其细胞生长曲线、细胞凋亡指数,并进行光镜、电镜形态学观察;并对转染pcDNA3.1-Assurvivin前后Jurkat细胞分别加入4-羟基-环磷酰胺(CTX)、甲氨蝶呤(MTX)72 h后,常规MTT检测细胞存活率.结果 RT-PCR检测转染pcDNA3.1-Assurvivin后48 h、5和6周Jurkat细胞survivin mRNA表达,发现survivin mRNA表达皆低于对照组;转染后survivin蛋白表达也明显降低.转染pcDNA3.1-Assurvivin后Jurkat细胞生长倍增时间(52 h)明显延长;用FCM检测细胞凋亡发现,转染pcDNA3.1-Assurvivin后Jurkat细胞凋亡指数[20.2%(48 h)]明显高于对照组(转染空质粒和未转染组,2.1%和1.3%);5和6周为6.2%和6.8%,明显高于未转染细胞(1.3%和1.0%).光镜、电镜观察见转染细胞出现较多凋亡细胞及一些变性肿胀细胞;MTT检测结果显示Jurkat细胞转染前后,经化疗药物4-羟基-环磷酰胺和甲氨蝶呤作用,转染细胞的抑制率明显大于未转染组,差异有统计学意义(P<0.05).结论 survivin基因对Jurkat细胞系的生长起着重要的作用,抑制survivin 基因表达在T淋巴母细胞淋巴瘤治疗中可能有重要的意义,该基因似可能作为治疗的靶点.
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利用Psm22α-EGFP-1质粒重组体从小鼠间充质干细胞中分选平滑肌祖细胞
目的 为了从骨髓间充质干细胞中分离纯化出平滑肌祖细胞,探讨骨髓来源的平滑肌祖细胞(SMPC)向平滑肌方向分化的机制和特点.方法 构建了含有sm22α启动子序列和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)编码序列的质粒重组体后用脂质体转染的方法,将Psm22α-EGFP-1重组体转入体外原代培养一周的小鼠间充质干细胞中.在转染后的3、5、7、10 d分别观察平滑肌特异性蛋白sm22α启动子控制下绿色荧光蛋白表达量的变化和转入重组体后间充质细胞形态的变化,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法观测转染后的骨髓间充质干细胞中myocardin mRNA表达水平的变化,并以免疫荧光法检测转染后第5天骨髓间充质干细胞CD34的表达.结果 转入Psm22α-EGFP-1重组体后的第3天,在荧光显微镜下观察到有绿色荧光蛋白表达的细胞.此后随着时间的推移,表达绿色荧光蛋白的细胞数目持续增加,在第7天时达到高峰,以后逐渐减弱.在不同时间点的绿色荧光蛋白阳性细胞百分率分别为:3 d:7%±0.13%,5 d:10%±0.32%,7 d:20%±0.26%,10 d:12%±0.18%,t=3.45,P＜0.05.在相应的时间点的转染后的骨髓间充质干细胞,myocardin mRNA表达变化的趋势与绿色荧光表达的变化趋势大致相符.阳性对照组的脂质体的转染效率每个组均控制在70%±1.5%(P＞0.05).在激光共聚焦显微镜下观察可见,发绿色荧光的细胞形态呈多态性,动态观察发现绿色荧光蛋白的分布趋势是从胞核逐步分布至胞质.免疫荧光显示在转染后第5天的细胞中CD34的阳性率为5.2%±0.21%(P＞0.05).结论 在小鼠的骨髓间充质干细胞中存在着具有向平滑肌细胞方向分化潜能的祖细胞,即所谓的平滑肌祖细胞.利用Psm22α-EGFP-1质粒重组体可以从小鼠间充质干细胞中分选出平滑肌祖细胞.
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视网膜母细胞瘤基因对人骨肉瘤细胞株OS732的影响
目的观察外源性N端截短的视网膜母细胞瘤(Rb)基因对骨肉瘤细胞株OS732 的生长和细胞间缝隙连接信息通讯能力的影响.方法构建N端截短的长度为1.65 kb Rb基因的真核表达质粒,并用DOTAP将其导入骨肉瘤细胞株OS732.应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Northern blot 检测Rb基因的表达;用细胞计数、流式细胞仪分析和软琼脂克隆形成试验观察OS732细胞的生长状况;用半定量RT-PCR法和罗氏黄荧光传输法检测细胞间缝隙连接信息通讯的能力.结果转染N端截短的Rb基因后,OS732细胞内可检测到内源性和外源性Rb基因的mRNA表达; OS732细胞的形态发生改变,其生长速度减慢,软琼脂形成集落能力降低,细胞周期阻滞于G0-G1期;缝隙连接蛋白基因Connexin43的表达和细胞间信息通讯能力增强.结论 N端截短的Rb基因可抑制骨肉瘤细胞株OS732的恶性生长表型以及增强细胞间信息通讯能力.
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丙肝病毒NS5B-EGFP融合蛋白真核表达载体的构建及稳定转染HepG2细胞系的建立
目的构建可表达丙型肝炎病毒(HCV)NS5B-EGFP融合蛋白的真核表达载体;获得重组质粒稳定转染的HepG2细胞系.方法利用PCR技术从HCV基因组中扩增出ns5b基因片段,XhoI/Kpn I双酶切后连接到经同样酶切的pEGFP-N3真核表达载体,转化TG1菌株感受态细胞,获得阳性重组质粒pEGFPN3-ns5b.将阳性克隆用脂质体法转染HepG2细胞,经持续G418压力选择和有限稀释法克隆化获得稳定转染的细胞系.结果成功构建了真核表达载体pEGFPN3-ns5b;建立了其重组质粒稳定转染的HepG2细胞系.结论重组质粒稳定转染的HepG2细胞系可表达NS5B-EGFP融合蛋白;该HepG2细胞系可以应用于以ns5b基因为靶位的抗HCV感染研究.
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T7RNA聚合酶真核表达质粒的构建及其病毒拯救功能的鉴定
目的 建立T7RNA聚合酶真核表达质粒细胞内病毒拯救系统.方法 利用分子生物学技术,以大肠埃希菌BL21(DE3)的T7RNA聚合酶基因为目的 基因,构建T7RNA聚合酶真核表达质粒VR-1a并鉴定,然后将VR-1a和EV71病毒感染性克隆质粒共转染Vero细胞并传代,观察其细胞病变,同时用RT-PCR检测EV71病毒核酸和用ELISA检测EV71病毒抗原.结果 酶切和测序显示成功构建T7RNA聚合酶真核表达质粒VR-1a,和EV71病毒感染性克隆共转染Vero细胞后出现明显的病变,RT-PCR检测EV71病毒核酸阳性并测序证实,ELISA检测显示有EV71病毒抗原.结论 此方法可以用于细胞内拯救EV71病毒,有望应用于EV71病毒的核酸疫苗免疫研究.
关键词： DNA指导的RNA聚合酶 肠道病毒属 转染 -
三种不同转染方法拯救病毒的比较研究
目的 比较3种不同转染方法,探索佳的拯救病毒策略.方法 3种转染方法包括:①含T7 RNA聚合酶启动子的全长肠道病毒71(EV71)感染性质粒(P-EV71)和T7RNA聚合酶真核表达质粒(VR-1a)共转染Vero细胞;②含T7RNA聚合酶启动子的EV71全长基因片段(PCR产物)与VR-1a共转染Vero细胞;③利用体外转录技术得到EV71病毒全长RNA,直接转染Vero细胞.分别观察3种方法转染后产生细胞病变效应(CPE)时间及病变情况,用RT-PCR扩增拯救病毒核酸,测序验证其正确性,用蛋白印迹方法检测拯救病毒抗原.结果 3种方法均可成功转染Vero细胞得到拯救病毒,三种转染方法转染效果比较:方法③优于②、②优于①.结论 三种转染方法均可成功拯救EV71病毒,以病毒RNA直接转染效果好.
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携带HSP70-HBsAg嵌合基因复制缺陷型重组腺病毒的制备
目的 构建表达乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和热休克蛋白70(HSPT0)嵌合基因的复制缺陷型重组腺病毒载体.方法扩增结核分枝杆菌HSP70基因片段,亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV-HBsAg上,与5型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共同电转化到大肠埃希菌BJ5183内进行同源重组,经卡那霉素抗性筛选和酶切鉴定筛选出携带HBsAg-HSP70嵌合基因的重组腺病毒载体,用脂质体包裹Pac Ⅰ酶切线性化的重组质粒,转染到293细胞内进行重组腺病毒的包装.体外转染真核细胞,通过示踪基因绿色荧光蛋白表达的观察、RT-PCR和ELISA检测目的基因的表达.结果成功获得重组腺病毒质粒pAd-HBsAg-HSP70.重组质粒pAd-HBsAg-HSP70导入293细胞,经包装和二次扩大培养获得了具有感染能力的重组腺病毒颗粒Ad-HBsAg-HSP70,其病毒滴度达2×1012pfu/L,并能在真核细胞中有效表达目的基因.结论成功构建表达HBsAg-HSP70复制缺陷型重组腺病毒载体,为进一步开展HBV基因治疗研究提供实验基础.
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鉴别病毒受体方法的研究进展
病毒与易感细胞上的受体分子相结合，是病毒进入细胞的第一步，也是病毒嗜性的基础。这些受体分子介导的病理过程很可能与病毒的致病机制相关，鉴别病毒的受体对于了解其组织嗜性和病理机制，制定预防和治疗措施有着重要的意义。而且也为了解病毒与细胞的相互作用，病毒的感染周期等有趣的问题提供了基础的切入点。本文谨就识别病毒蛋白受体的几种方法的研究进展综述如下。1 筛选易感细胞的cDNA文库鉴别受体蛋白 这是一种既经典又在不断发展的方法。易感细胞的易感性来源于细胞内编码受体蛋白基因的表达，建立所有表达基因的cDNA文库，采用适当的方法筛选cDAN文库，则可直接找到编码受体蛋白的基因。一般的设计是：将易感细胞cDNA文库转染拮抗细胞，转染后获得编码受体蛋白克隆的拮抗细胞也获得了对病毒的易感性，就可以有病毒结合和进入，借助一些筛选标志可筛选出这些细胞从而分离出编码受体的克隆。其中筛选标志和策略的确定是关键，它依不同的病毒“量身定做”，有很强的针对性。
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人肝细胞离线混合生物人工肝治疗慢加急性肝衰竭一例
应用转染人肝再生增强因子(hALR)基因的Hep G2细胞筛选出一株肝细胞作为生物材料,并建立生物人工肝支持系统,经检测具有良好生物合成及转化功能.我们采用离线混合生物人工肝治疗慢加急性肝衰竭1例,报道如下.
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乙肝病毒HBsAg-EGFP融合蛋白真核表达载体构建及稳定转染Chang Liver细胞系的建立
目的 构建可表达乙型肝炎病毒(HBV)HBsAg-EGFP融合蛋白的真核表达载体;获得重组质粒稳定转染的Chang Liver细胞系.方法 利用PCR技术从HBV基因组中扩增出HBsAg基因片段,BamH I/EcoR l双酶切后连接到经同样酶切的pEGFP-N1真核表达载体,转化TG1菌株感受态细胞,获得阳性重组质粒pEGFPNl.HBsAg.将阳性克隆用脂质体法转染Chang Liver细胞,经持续G418压力选择和有限稀释法克隆化获得稳定转染的细胞系.结果 成功构建了真核表达载体pEGFPN1-HBsAg;建立了其重组质粒稳定转染的Chang Liver细胞系.结论 重组质粒稳定转染的Chang Liver细胞系可表达HBsAg-EGFP融合蛋白;该细胞系可以用于筛选HBsAg转染细胞后,差异表达的蛋白质研究,为深入研究HBsAg可能的致病机制提供依据.
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模拟mIL-18天然生成真核表达体系的构建及生物活性初探
目的构建模拟小鼠IL-18(mIL-18)天然生成真核表达体系,并探讨其与人IL-2(hIL-2)真核表达载体pVR1012-hIL-2(phIL-2)体内外共转染对细胞免疫功能的影响.方法分别构建小鼠IL-18前体(mproIL-18)和小鼠IL-1β转换酶(mICE)的真核表达载体pVR1012-mproIL-18(pmproIL-18)和pEGFP-N1-mICE(pmICE).两者单独或共转染COS-7细胞,分别在mRNA和蛋白水平检测IL-18的表达;将pmproIL-18、pmICE和phIL-2 3种真核表达载体分别通过体内、外共转染,初步检测其生物学活性.结果pmproIL-18及pmICE构建正确,分别转染COS-7细胞后能检测到相应mRNA表达.在pm-proIL-18单独或pmproIL-18/pmICE共转染的COS-7细胞中能检测到前体和成熟2种不同形式的mIL-18蛋白表达,并且mIL-18能分泌到上清;所分泌的mIL-18与hIL-2体外联合作用可增强小鼠脾细胞增殖能力.pmproIL-18、pmICE和phIL-2 3种真核表达载体联合肌肉注射的小鼠脾细胞体外杀伤同基因型肿瘤细胞的能力显著提高.结论构建的模拟mIL-18天然生成的真核表达体系(pmproIL-18/pmICE)与phIL-2共转染有可能用于肿瘤的基因治疗.
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9型重组腺相关病毒介导 R65核酶基因体外转染人血管不同细胞的对比研究
目的：研究9型重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus 9，rAAV9）载体介导R65核酶基因及增强型绿色荧光蛋白（ enhanced green fluorescent protein ，EGFP）对体外培养人脐静脉内皮细胞（ human umbilical vein endothelial cells ， HUVECs ）、人主动脉平滑肌细胞（ human aortic smooth muscle cells ， HASMCs）的转染及病毒载体对两种不同细胞的增殖情况和对NF-κB通道P65表达的影响。方法 rAAV9-EGFP-R65按转染复数（multiplicity of infection，MOI）为1×105、1×106、1×107转染HUVECS、HASMCS细胞，倒置荧光显微镜下观察 HUVECs、HASMCs 细胞中EGFP 的表达，流式细胞仪检测rAAV9-EGFP-R65对HUVECs、HASMCs细胞的转染效率，Alamar Blue 检测rAAV9-EGFP-R65载体对HUVECS、HASMCs细胞增殖的影响。 Western blot法检测rAAV9-EGFP-R65对HUVECs和HASMCs两种细胞中NF-κB通道P65表达的影响。结果 rAAV9-EGFP-R65转染的荧光强度随着MOI的增加和转染时间的延长而增加。 HUVECs和HASMCs在rAAV9-EGFP-R65转染24 h后EGFP 开始表达。 HUVECs 在转染后第6天达到高峰，而HASMCs在转染后第5天达高峰。高峰表达时流式细胞术检测rAAV9-EGFP-R65对HUVECs的转染率分别为MOI＝1×105组：（1．40±1．20）％，MOI＝1×106组：（12．30±1．35）％，MOI＝1×107组：（52．80±2．05）％。rAAV9-EGFP-R65对HASMCs的转染率分别为MOI＝1×105组：（5．30±1．04）％，MOI＝1×106组：（18．30±2．24）％，MOI＝1×107组：（52．40±3．21）％。 rAAV9-EGFP-R65转染HUVECs和HASMCs细胞后，细胞生长及形态均正常，Alamar Blue法进一步检测表明HUVECs和HASMCs各细胞内转染组与未转染组之间A值差异均无统计学意义。 Western blot 法检测显示rAAV9-EGFP-R65转染HUVECs 和HASMCs 两种细胞后NF-κB通道P65的表达减弱。结论 rAAV9-EGFP-R65能够有效转染人脐静脉内皮细胞和人主动脉平滑肌细胞，对两种细胞增殖均无抑制作用，均能有效抑制两种细胞中NF-κB通道P65的表达。
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小鼠端粒酶逆转录酶基因重组腺病毒转染对树突状细胞功能的影响
用携带目的基因的病毒载体转染树突状细胞(DC)已广泛应用于抗肿瘤和诱导耐受等方面的实验研究和治疗.但用病毒载体转染DC过程中,存在病毒本身常能影响DC的抗原提呈细胞功能,有文献报道痘苗病毒载体和单纯疱疹病毒载体转染DC后可阻碍DC成熟和下调成熟DC表面的共刺激分子,因此,避免病毒载体干扰DC的功能十分
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LPS提高单核细胞TRAIL表达及诱导肝细胞凋亡的研究
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF related apoptosis inducing ligand, TRAIL)是近年来新发现的TNF家族中成员[1],与TNF、FasL不同,它除了诱导肿瘤细胞及病毒转染细胞发生凋亡外,近研究发现TRAIL同样能诱导正常肝细胞凋亡[2],其在病毒性肝炎发病机理中的作用受到重视.本实验从脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)致单核细胞TRAIL表达情况作研究,探讨LPS通过TRAIL致肝细胞凋亡途径在重型病毒性乙型肝炎致病机理中的可能作用.
