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人胎儿表皮干细胞的体外分离培养及基因转染
目的探讨人胎儿表皮干细胞体外分离培养的方法以及作为体外基因转染靶细胞的可行性.方法利用Ⅳ型胶原快速贴附法分离人胎儿表皮干细胞,以人胎儿成纤维细胞条件培养液配制表皮干细胞培养基,通过角蛋白19(K19)和整合素β1免疫组化染色、细胞周期分析及克隆形成率测定,对培养细胞进行鉴定.采用脂质体介导法,以含血管内皮细胞生长因子165(VEFG165)基因片段的真核表达载体pcDNA3.1(pcDNA3.1/VEGF165)转染培养细胞;采用病毒载体介导法,以含报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的重组腺相关病毒载体(raav/GFP)转染培养细胞.应用免疫组化染色及荧光显微镜观察检测转染效果.结果人胎儿表皮干细胞呈明显克隆性生长,克隆形成率高,G1期细胞比例明显高于普通基底层角质细胞,K19和整合素β1免疫组化染色呈强阳性.pcDNA3.1/VEGF165转染的表皮干细胞VEGF165免疫组化染色阳性,raav/GFP转染的表皮干细胞呈现强荧光.结论利用Ⅳ型胶原快速贴附法及人胎儿成纤维细胞条件培养基,可初步实现人胎儿表皮干细胞的分离培养.以脂质体为介导或以腺相关病毒为载体进行人胎儿表皮干细胞的体外基因转染是可行的.
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c-jun反义基因重组体转染对缺氧复合烧伤血清刺激下大鼠心肌细胞的保护作用
目的观察c-jun反义基因重组体转染对缺氧复合烧伤血清刺激下大鼠心肌细胞的保护作用. 方法培养大鼠心肌细胞,分为:(1)正常对照组;(2)转染组:构建c-jun反义基因重组体并转染入心肌细胞,随后进行缺氧复合烧伤血清刺激;(3)非转染组:仅进行缺氧复合烧伤血清刺激,不作其他处理.于刺激后1、3、7 h,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测c-jun mRNA的表达变化;用Western blot检测c-jun蛋白、肌钙蛋白T(TnT)和β-微管蛋白的表达变化;在光镜和电镜下观察心肌细胞形态结构改变. 结果 (1)与正常对照组比较,非转染组c-jun mRNA与蛋白表达显著,转染组较非转染组显著下降.(2)与正常对照组比较,非转染组TnT与β-微管蛋白表达显著下降,转染组较非转染组明显回升.(3)转染组心肌细胞骨架结构基本保持完好,偶见断裂与溶解.非转染组骨架网状结构紊乱、溶解与断裂,呈颗粒状. 结论缺氧复合烧伤血清刺激可使大鼠心肌细胞c-jun表达上调,进而引起心肌细胞损伤,c-jun反义基因重组体转染对该刺激条件下的心肌细胞具有保护作用.
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热休克因子1基因转染对烧伤血清刺激的巨噬细胞炎性介质表达的影响
目的 了解外源性热休克因子1(HSF 1)对烧伤血清刺激的巨噬细胞中相关炎性介质基因表达的影响.方法 制备严重烧伤和正常大鼠血清;构建pcDNA 3.1/HSF 1重组载体.将培养的RAW 264.7巨噬细胞株转染(具体分为:未转染、转染空载体、转染重组载体)后再分别使用前述2种血清刺激.另取部分未行血清刺激的转染重组载体的巨噬细胞,用蛋白质印迹法检测其HSF 1蛋白表达水平;反转录-PCR法检测经血清刺激的细胞中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、高迁移率族蛋白B1(HMGB 1)和白细胞介素10(IL-10)基因表达水平.结果 已转染重组载体的细胞株较稳定,检出有HSF 1部分活化.反转录-PCR检测到,未转染的正常血清刺激的巨噬细胞中TNF-α、HMGB 1、IL-10的基因仅有少量表达,而烧伤血清刺激能明显上调其基因表达(分别为0.910±0.100、0.860 ±0.020、0.430±0.010);与转染空载体+烧伤血清组(上述3项指标分别为0.800 ±0.050、0.880±0.030、0.420±0.010)比较,转染重组载体+烧伤血清组可明显抑制巨噬细胞中TNF-α和HMGB 1的基因表达并上调IL-10的基因表达(分别为0.130 ±0.100、0.450±0.020、0.450±0.020).结论 严重烧伤后给予HSF 1可以抑制巨噬细胞产生的某些促炎介质的表达,适当上调某些抗炎介质的表达,对机体发挥保护作用.
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Ad-shRNA-NgR转染EAE大鼠脑组织安全性评估
目的 观察NgR特异性RNA干扰的重组腺病毒(Ad-shRNA-NgR)转染实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)脑组织后,EAE大鼠的存活情况,为EAE干预实验提供依据.方法 80只大鼠建立EAE大鼠模型后,将其随机分成高、中、低、对照组,每组20只.实验组分别用滴度为1×1011 pfu/mL、1×1010 pfu/mL、1×109 pfu/mL的Ad-shRNA-NgR注入EAE大鼠侧脑室.观察注射后第3天、第7天EAE大鼠的存活情况.结果 Ad-shRNA-NgR转染EAE脑组织后,高滴度组在第3天和第7天时EAE大鼠的存活率显著低于中、低滴度组,差异具有统计学意义(P<0.05).中、低滴度组和对照组EAE大鼠的存活率无显著性差异(P>0.05).结论 Ad-shRNA-NgR转染EAE大鼠实验时,滴度从1×1010 pfu/mL到1×109 pfu/mL范围是安全的.
关键词： 腺病毒 实验性自身免疫性脑脊髓炎 转染 安全性 动物模型 -
hTNFα／CHO基因工程细胞的构建及其分泌蛋白功能的检定
目的：构建能够持续分泌人肿瘤坏死因子（ hTNFα）的中国仓鼠卵巢细胞（ CHO）基因工程细胞hTNFα／CHO细胞系，并且观察其分泌功能的变化。方法应用载体GV141构建携带hTNF基因表达的质粒；采用脂质体转染法，经G418筛选稳定转染细胞株；通过Real-Time PCR鉴定其基因表达，采用ELIAS法鉴定其蛋白分泌情况。结果经序列比对，证明GV141-hTNFα表达载体构建成功，Real-Time PCR证明转染细胞系包含hTNFα目的基因，ELIAS鉴定结果证明该细胞系可以在一定代数稳定持续内分泌hTNFα。结论构建的hTNFα／CHO细胞系可以在一定代数内稳定持续地分泌人肿瘤坏死因子。
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rhBMP-2和rhVEGF转染ADSCs后体外表达及诱导骨缺损成骨修复的实验研究
目的 观察重组人骨形成蛋白2(rhBMP-2)和血管内皮生长因子(rhVEGF)转染脂肪源性干细胞(ADSCs)后的体外表达情况,并以含该转染体系的组织工程骨进行大动物负重骨缺损的修复研究.方法 将外源性基因rhBMP-2和rhVEGF通过脂质体LipofectamineTM2000介导的方式转染第四代ADSCs,以G418筛选出阳性克隆并扩大培养后,用RT-PCR和SABC免疫组化法在转录和蛋白质水平观察其转染后第2天和第4周表达情况.建立小香猪自体前肢尺骨中段1.5cm骨缺损模型,分3组进行对比试验:(A组)转染了生物活性因子的ADSCs与脱细胞骨基质材料(ACBM)复合而成新型组织工程骨植入修复组;(B组)未转染生物活性因子的ADSCs复合ACBM植入修复组;(C组)未处理组.以X线和组织切片评价其修复效果.结果 转基因ADSCs在转染后瞬时和4周时都可表达rhBMP-2和rhVEGF.大动物骨缺损修复实验中,前2周内3组动物均未出现明显的急性炎症反应;连续X线观察和骨切片显示:A组在术后第3个月已完全修复,且修复效果和进程明显优于B组,C组缺损则主要由纤维结缔充填.结论 rhBMP2及rhVEGF转染ADSCs后可获得4周内稳定的表达.携带该缓释体系的新型组织工程骨是一种具有显著成骨能力的优良骨缺损修复材料.
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介导pcDNA-IGF-1质粒转染骨髓间充质干细胞两种方法比较
目的 比较阳离子聚合物Xfect与PDS-1000基因枪系统转染人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)的转染效率及两种方法对细胞增殖能力的影响.方法 应用贴壁法原代培养hBMSCs,取第3代细胞以流式细胞术鉴定细胞表面抗原CD29、CD34、CD45、CD90,并分别用Xfect与PDS-1000基因枪系统将pcDNA-胰岛素样生长因子1(IGF-1)质粒转导入hBMSCs中.转染后在不同时间点使用倒置荧光显微镜观察绿色荧光,计数阳性细胞,计算细胞转染率及细胞漂浮率;以酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测IGF-1分泌量.结果 hBMSCs培养成功后,高表达CD29、CD90,低表达CD34、CD45.在转染后1、2d,两种方法细胞转染率差异有统计学意义(t=4.734、5.324,P＜0.05).两种方法转染后细胞IGF-1分泌量均较转染前增加,但两种方法间比较差异有统计学意义(t=2.220～10.678,P＜0.05).两种方法转染均有部分细胞脱落.结论 两种方法均可将pcDNA-IGF-1基因转染入hBMSCs内,转染后细胞能分泌IGF-1.Xfect转染试剂转染效率较高,PDS-1000基因枪系统转染效率较低,两者对细胞都造成一定损伤.
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稳定表达人GM-CSF和IL-4EA.hy926细胞株建立及对DC诱导作用
目的 获得分别能稳定表达人白细胞介素4(IL-4)和人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的内皮细胞株,并用于树突状细胞(DC)的体外诱导培养.方法 构建重组的慢病毒表达载体,在293T细胞中进行慢病毒的包装,用获得的高滴度的慢病毒感染内皮细胞EA.hy926细胞株,建立能够高效、稳定表达IL-4和GMCSF的EA.hy926细胞株.结果 EA.hy926细胞株感染效率达90％以上,长期传代仍能保持较高阳性率.RTPCR在mRNA水平上检测目的基因有表达；ELISA和Western方法证实感染后细胞IL-4、GM-CSF在蛋白水平的表达分别是未感染细胞的80倍和143倍.感染后细胞的生长状态良好,能够长期在体外进行传代培养,可以用于DC诱导实验.结论 构建的细胞系可以稳定表达细胞因子IL-4和GM-CSF.
关键词： 树突细胞 转染 白细胞介素4 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 -
人Ndfip1基因在转染MES23.5细胞中的表达
目的 应用携带人Ndfip1(Nedd4 family interacting protein 1)基因的质粒pCMV6-XL5-Ndfip1转染MES 23.5多巴胺能神经细胞,检测其在细胞中的表达.方法 应用Lipofectamine法转染MES 23.5细胞,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测MES 23.5细胞中Ndfip1 mRNA的表达.结果 该表达载体转染MES23,5细胞后,细胞内Ndfip1 mRNA的表达水平明显增加(t=-8.295,P＜0.01).结论 Ndfip1基因可在MES23.5细胞内表达,从而为进一步研究Ndfip1在神经元保护中的作用奠定了基础.
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糖尿病病人突变CD59蛋白在真核细胞中的表达
目的 构建两种含有人CD59蛋白突变体的真核表达载体,获得中国仓鼠卵巢(CHO)细胞真核表达系统,为在基因水平阐明糖尿病血管增殖性病变的发病机制奠定基础.方法 将两种含有不同突变体的人CD59全长cDNA序列重组pALTER质粒,应用阳离子脂质体导入法与pcDNA共转染CHO细胞,用G418筛选阳性克隆,应用细胞免疫组化及流式细胞仪检测CD59在CHO细胞表面的表达. 结果 含有人CD59两种突变体的重组pLATER质粒经酶切和琼脂糖凝胶电泳鉴定,得到长496 bp的电泳条带,与所插入片段完全相符.运用阳离子脂质体导入法将重组pALTER质粒共转染CHO细胞成功,筛选出的阳性克隆经细胞免疫组化检测,证明突变的CD59可在CHO细胞表面表达,流式细胞仪测定表达率分别为68.6%、71.7%.结论 成功建立了两种高效表达人CD59突变体的真核表达系统,能够进一步研究人CD59的突变体糖基化及抗补体活性,为阐明糖尿病血管增殖性病变的发病机制奠定了基础.
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人CD59 RNAi逆转录病毒载体系统的构建与鉴定
目的 利用siRNA表达载体法构建并筛选携带针对CD59基因pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体及稳定产毒的细胞克隆.方法 用DNA重组技术,将3条60 bp能转录产生靶向CD59小发夹RNA(shRNA)的寡核苷酸序列定向克隆入逆转录病毒载体pSUPER retro,脂质体法转染包装细胞系Phoenix A,建立产生逆转录病毒的细胞克隆.结果 重组载体经PCR及限制性内切酶酶切鉴定初步成功后测序序列正确;重组载体转染包装细胞,可表达绿色荧光蛋白,表明包装成功.结论 特异性沉默CD59基因的pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体以及稳定产毒的细胞系构建成功,为后续进行肿瘤细胞的研究奠定了基础,可望为肿瘤治疗开辟新途径.
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重组人突变CD59真核表达质粒的构建和转染
目的获取人突变CD59基因(HM3)并构建HM3真核表达体系,转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO),以获得稳定转染的细胞克隆.方法应用重组PCR定点诱变技术获得突变的CD59 DNA,进一步构建重组质粒pALTER-HM3;与pcDNA3共转染CHO细胞,转染细胞按一定比例稀释后加入G418压力筛选稳定转染细胞克隆,传代扩增培养并及时冻存备用.结果酶切及序列测定均证实成功构建了突变的pALTER-HM3重组质粒;转染细胞培养约2周后套取出G418抗性细胞克隆,获得生长较好的细胞.结论重组PCR定点诱变技术成功获得突变DNA,合适的细胞稀释有利于转染细胞克隆的筛选纯化.
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罗布麻对耐药性菌株R质粒的作用
①目的了解罗布麻对耐药性菌株R质粒的作用.②方法获取活化多重耐药痢疾杆菌D15菌株的R质粒,加入罗布麻浸液中,再与受体大肠杆菌1485相互作用,观察细菌生长情况,并设空白对照实验.③结果罗布麻浸液加入后,受体大肠杆菌1485在含有抗生素平皿上不生长.不加罗布麻浸液的受体大肠杆菌1485在含有抗生素平皿上生长.④结论罗布麻浸液对R质粒有一定的消除和抑制作用.
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联合转染p21基因及反义c-fos核酸对移植静脉血管平滑肌细胞增殖的影响
①目的观察联合转染p21基因及反义c-fos核酸对自体静脉移植后移植血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响,探讨预防移植血管再狭窄的基因疗法.②方法选择20只新西兰家兔,随机分为实验组和对照组,每组各10只.用显微外科技术建立自体颈静脉-颈总动脉移植模型;实验组移植静脉进行p21基因和反义c-fos核酸转染,而对照组未进行转染.术后2周取出移植血管,用电子显微镜及计算机图像分析仪观察血管中段内膜厚度、管腔狭窄度、平滑肌细胞增殖指数,用免疫组织化学方法对移植血管c-fos、c-myc、移植血管VSMC的增殖细胞核抗原(PCNA)阳性表达进行检测.③结果实验组血管中段内膜厚度、管腔狭窄度、平滑肌细胞增殖指数及c-fos、c-myc、PCNA阳性表达率均明显低于对照组(t=8.19～25.19,t′=6.14、7.36,P<0.01).④结论移植静脉联合转染P21基因及c-fos反义核苷酸可有效地抑制移植血管VSMC增殖.
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高滴度逆转录病毒载体的4种方法转染小鼠T淋巴细胞转染率比较
①目的比较逆转录病毒载体4种转染方法对小鼠脾脏T淋巴细胞的转染率.②方法应用衣霉素预处理包装细胞提高逆转录病毒滴度,运用标准法、离心法、共培养法和脂质体-病毒混合法转染T淋巴细胞.③结果共培养法转染率为32.33%±2.12%,离心法为18.72%±2.97%,脂质体-病毒混合法为9.43%±1.81%,标准法转染率为6.64%±1.37%.共培养法转染率高于离心法(F=95.24,q=35.06,P<0.01);共培养法和离心法转染率均高于标准法(q=18.79、17.59,P<0.01);脂质体-病毒混合法和标准法的转染率无显著差异(q=3.11,P>0.05).共培养法转染率高,但易于混入包装细胞.④结论离心转染法是一种较好的转染方法.
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兔椎间盘组织细胞表达外源性转化生长因子基因的实验研究
①目的探讨椎间盘不同组织细胞对外源性基因的敏感性,为椎间盘组织退变的基因治疗提供理论依据.②方法取成年新西兰大白兔5只,将外源性转化生长因子β1基因直接注射于L3～4椎间隙,术后1周取出相应椎间盘组织,利用免疫组织化学方法观察细胞对转化生长因子基因产物的表达情况.应用VIDAS图像分析系统进行免疫阳性细胞半定量分析.③结果注射转化生长因子基因的椎间盘,在髓核、纤维环及两者之间的过渡区,都能够观察到转化生长因子免疫阳性细胞,其中以髓核中央区细胞染色深,纤维环细胞次之,过渡区细胞表达较弱,测得三者各50个阳性细胞的平均吸光度值分别为0.472 3±0.043 2,0.416 3±0.075 6和0.398 2±0.076 1,髓核区与纤维环区、过渡区比较,差异有显著性(F=97,q=6.374,8.423,P<0.01).④结论椎间盘不同的组织细胞都能够被外源性基因转染,但以髓核细胞的表达为强烈.
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转染外源性转化生长因子β1基因对兔髓核细胞凋亡的影响
①目的探讨转染转化生长因子β1(hTGF-β1)基因对兔髓核细胞凋亡的影响,为活化椎间盘细胞功能、预防椎间盘组织退变提供依据.②方法取成年新西兰大白兔5只,将外源性hTGF-β1基因直接注射于L3～4 椎间隙,以注射同样剂量磷酸缓冲液的L4～5作为实验对照.术后3周取出相应椎间盘组织,利用TUNEL免疫荧光组织化学方法观察髓核细胞凋亡情况.应用Vidas图像分析系统进行免疫阳性细胞半定量分析.③结果注射hTGF-β1基因的椎间盘凋亡细胞数明显少于对照组,测得OPTDM值分别为0.002±0.001、0.159±0.041,二者差异有显著性(t=27.83, P<0.01).④结论转染hTGF-β1基因可以明显减少兔椎间盘髓核细胞凋亡的发生.
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转染外源性转化生长因子β1基因对兔椎间盘髓核细胞成纤维细胞生长因子表达的影响
①目的探究体内转染腺病毒载体转化生长因子β1(Ad/CMV-hTGF-β1)对椎间盘组织退变的保护作用机制.②方法纯种成年新西兰大白兔10只,随机分为实验组和对照组,每组5只.采取腹部手术入路,暴露腰椎间盘,取20 μL本院骨科实验室构建的以腺病毒为载体的Ad/CMV-hTGF-β1,其滴度为6×106 pfu,注射于腰3、4椎间盘髓核内;对照组仅进行相应的外围手术操作,椎间盘未做任何处理.手术后3周取出椎间盘,通过苏木精-伊红(HE)染色观察髓核组织细胞形态;用免疫组织化学方法观察髓核细胞成纤维细胞生长因子(FGF)的表达;并用VIDAS图像分析系统进行半定量分析.③结果普通HE染色结果显示,2组椎间盘髓核组织形态基本相同.免疫组织化学染色显示,实验组椎间盘髓核细胞FGF的表达比对照组明显增高,差异有统计学意义(t=3.48,P<0.05).④结论体内转染腺病毒载体Ad/CMV-hTGF-β1具有提高椎间盘髓核细胞FGF表达的作用.
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不同方法转染人外周血淋巴细胞效率比较
目的 采用不同方法转染原代人外周血淋巴细胞,以寻找一种简便、高效的淋巴细胞转染方法.方法 采用聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)分离法从健康人外周血中分离出单个核细胞,锥虫蓝检测细胞存活率.单个核细胞在6孔板内培养2h后吸出悬浮的淋巴细胞至24孔板中继续培养.分别采用电穿孔介导载体质粒(PEGFP-N1)转染活化的淋巴细胞、慢病毒(LVGFP)单次感染及慢病毒重复感染方法分别转染静息或活化的淋巴细胞,在荧光显微镜下观察感染后不同时间点细胞绿色荧光蛋白(GFP)表达情况,同时收集细胞用流式细胞术检测GFP阳性细胞的比例,比较不同条件下慢病毒感染淋巴细胞的效率.结果 通过Ficoll-Hypaque分离的单个核细胞的纯度可达95％,其活细胞率＞95％,获得的淋巴细胞占90％～ 95％,形态较均一.“2 100V、10 ms、1个脉冲”电穿孔淋巴细胞后可见散在荧光,但随着时间推移荧光逐渐减弱,72 h基本看不到荧光.慢病毒单次感染静息期淋巴细胞48 h后无绿色荧光,流式细胞术检测GFP阳性细胞＜1％.慢病毒单次感染增殖期淋巴细胞可见绿色荧光,且随着病毒浓度增大,荧光逐渐增强,GFP阳性细胞在1％～5％之间.慢病毒重复感染增殖期淋巴细胞可见较强绿色荧光,GFP阳性细胞在5％～10％左右,随着时间推移荧光逐渐增强.结论 慢病毒重复感染增殖期淋巴细胞,能有效地将外源基因导入淋巴细胞内稳定表达.
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CD19基因过表达K562细胞株及NOD-SCID小鼠皮下移植瘤模型的建立
目的 建立人CD19基因过表达的K562细胞株(CD19-K562)NOD-SCID小鼠皮下移植瘤模型.方法 克隆人CD19基因构建MigR1-CD19反转录病毒载体,转入Plat-A包装细胞,病毒上清转染K562细胞,反转录聚合酶链反应(PCR)及流式细胞术检测转染细胞CD19基因和蛋白表达,体外反复传代获得CD19-K562稳定转染细胞株,锥虫蓝染色,细胞计数检测细胞增殖,Annexin V/碘化丙啶(PI)双染流式细胞术检测细胞凋亡.CD19-K562细胞株皮下接种NOD-SCID小鼠并经体内外传代后建立移植瘤亚系CD19-K562-a,建立NOD-SCID小鼠皮下移植瘤模型.应用反转录PCR、瑞特染色、免疫组织化学等方法验证CD19-K562-a细胞性质.结果 成功建立了人CD19-K562细胞稳定株,CD19阳性率(99.80±0.17)％.CD19-K562细胞增殖、凋亡未受转染及传代影响.CD19-K562细胞稳定株皮下接种NOD-SCID小鼠后经体外结合体内传代建立移植瘤亚系CD19-K562-a,其CD19阳性率为(99.78±0.04)％,CD19-K562-a和CD19-K562细胞均呈未分化形态.CD19-K562-a皮下接种NOD-SCID小鼠成功建立移植瘤模型,CD19-K562-a瘤体CD19基因表达强阳性.结论 通过构建MigR1-CD19重组载体获得CD19基因过表达的K562稳定转染细胞株(CD19-K562),同时采用体外结合体内传代建立稳定成瘤的NOD-SCID小鼠移植瘤亚系CD 19-K562-a并成功建立NOD-SCID小鼠皮下移植瘤模型.
