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HBV全基因组克隆转染细胞系的建立
目的:建立HBV体外细胞培养体系. 方法:构建HBV全基因克隆质粒pcDNA3-3HBV,稳定转染HepG2细胞,G418筛选. ELISA检测细胞上清液HBsAg,HBeAg的表达,免疫组化检测细胞内HBcAg的表达,RT-PCR检测细胞S基因mRNA的表达,PCR检测细胞上清液DNA. 结果:成功构建了HBV全基因克隆质粒pcDNA3-3HBV,稳定转染HepG2后,培养上清HBsAg,HBeAg阳性,细胞内HBcAg呈核浆型分布,且以浆型分布为主. RT-PCR证实有HBV S基因 mRNA 的表达,上清中HBV S及前S基因阳性,荧光定量PCR检测显示培养上清中HBV 滴度达1×108拷贝/L. 结论:重组质粒pcDNA3-3HBV能在HepG2细胞中表达、转录、复制,该细胞培养体系能产生较高水平的HBV.
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AFP基因转染CD34+造血干细胞来源的树突状细胞诱导特异性抗肝癌免疫
目的: 以AFP基因转染CD34+造血干细胞来源的树突状细胞(DC),诱导DC产生特异性抗肝癌免疫,观察其对肝癌细胞的杀伤.方法: 采用化疗和集落刺激因子动员肝癌患者外周血造血干细胞,血细胞分离机采集CD34+造血干细胞,IL-4、GM-CSF联合TNF-α刺激CD34+细胞分化为DC.通过脂质体转染的方法将携带人AFP基因质粒pEGFP-AFP转染树突状细胞,MTT法检测对人肝癌细胞HepG2的特异性杀伤.结果: 经细胞因子刺激诱导培养的DC具有典型的分枝状突起,高表达CD11C,CD80,CD86.转染AFP基因后可见到转染细胞表达绿色荧光蛋白,细胞化学染色胞质内可见到红色颗粒.MTT法检测AFP基因转染后的DC可诱发特异性CTL反应杀伤HepG2细胞,AFP基因转染组、空载体组和对照组的杀伤率分别为(92.0±3.5)%,(75.5±4.1)%和(72.9±3.4)%,转染组与空载体组和对照组间存在显著性差异(P＜0.05).结论: AFP基因转染CD34+造血干细胞来源的DC可诱导特异性CTL反应杀伤肝癌细胞.
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转染pcDNA3-hCEA的人树突状细胞抑制MGC803裸鼠移植瘤的生长
目的:探讨转染癌胚抗原基因pcDNA3-hCEA的人树突状细胞(DC)对胃癌细胞MGC803裸鼠移植瘤生长的影响. 方法:采用细胞因子rhIL-4和rhGM-CSF诱导培养法制备人外周血DC,并用Lipofectine向人DC转染pcDNA3-hCEA. RT-PCR检测转染人CEA真核表达质粒的表达. 使用DC(pcDNA3-hCEA)疫苗体外诱导人T淋巴细胞靶向性杀伤反应,并在体内实验中观察DC(pcDNA3-hCEA)对MGC803在裸鼠上致瘤性的影响. 结果:针对特定引物DC(pcDNA3-hCEA)在588 bp处有CEA片段的表达;DC(pcDNA3-hCEA)能够诱导的人T淋巴细胞靶向性杀伤活性(%),在效靶比分别为10∶ 1,20∶ 1,40∶ 1时的结果为19.4±3.8, 24.7±3.7, 38.1±5.4;DC(pcDNA3-hCEA)能显著抑制MGC803的生长,其肿瘤生成日期较对照组延长(中位数10 d vs 6 d, n=5),瘤体生长速度较对照组缓慢,d 23瘤体体积明显小于对照组[(0.24±0.10) cm3 vs (0.65±0.17) cm3, (1.36±0.42) cm3, n=5, P<0.05]. 结论:转染pcDNA3-hCEA的人DC能有效抑制MGC803在裸鼠体内的生长.
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不同类型的DNA聚合酶β基因对CHO细胞的影响
目的:比较野生型和突变型(58 bp缺失)DNA聚合酶β(polβ)基因对真核细胞生长特性的影响. 方法:将表达人野生型和缺失型DNA polβ的中国仓鼠卵巢细胞株(CHO),用RT-PCR方法鉴定野生型和缺失型DNA polβ mRNA水平的表达,MTT法测生长曲线、流式细胞术测细胞周期. 结果:转染野生型和突变型DNA polβ的CHO细胞株中,都有外源基因mRNA水平的表达;转染突变型(58 bp缺失)polβ基因的细胞增殖速度和S期比例增高均高于未转染组细胞,差异有统计学意义(P<0.05). 而转染野生型polβ基因对细胞增殖速度和细胞周期无明显影响(P>0.05). 结论:高表达外源性野生型和突变型DNA polβ,对CHO细胞生长具有不同的影响.
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抗人血小板/T细胞活化抗原1(PTA1)不同表位单克隆抗体的制备及鉴定
目的 研制一套可识别PTA1分子不同功能性表位的单克隆抗体(mAb). 方法 采用亲和层析法从血小板裂解液中纯化的天然PTA1分子免疫BALB/c 小鼠，以间接ELIS A筛选阳性杂交瘤，并以PTA1 cDNA转染COS7细胞，进行间接免疫荧光染色和流式细胞术鉴定 mAb的特异性. 竞争结合试验确定mAb识别PTA1分子的表位. 纯化的PTA1经SDS-PAGE后，转 移到PVDF膜，确定mAb是否可用于Western blot. 结果 共获得7株可稳定 分泌mAb的杂交瘤 细胞株，分别命名为FMU1，FMU2，FMU3，FMU4，FMU5，FMU6和FMU7. 所有mAb与纯化天然PTA 1和PTA1/Ig融合蛋白均有良好的免疫反应性，均可识别PTA1 cDNA转染的COS7细胞. 流式细 胞仪检测阳性荧光峰型与PTA1阳性对照Leo A1 mAb的荧光峰型相似；7 株mAb识别PTA1分子 的5个不同表位；FMU1，FMU2，FMU4，FMU5，FMU6和FMU7可应用于Western blot. 结 论 成 功地制备7株抗PTA1分子的特异性mAb,这些mAb可分别识别PTA1的5个表位，为PTA1分子结构 与功能的研究提供了新的手段.
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人肝素酶基因正反义荧光真核表达载体的构建及肺癌细胞转染
目的: 构建正义和反义人肝素酶与绿色荧光蛋白真核共表达载体,并分别转染人低转移肺癌细胞株95C及高转移细胞株95D. 方法: 采用基因重组技术,用EcoRⅠ从pcDNA3-Hpa质粒上切下约1.7 kb的人肝素酶全长cDNA片段,然后连入 pIRES2-EGFP质粒的EcoRⅠ酶切位点上,经BamHⅠ酶切鉴定出正义和反义表达载体,并用脂质体法将肝素酶正义真核表达载体转入人低转移肺癌细胞株95C、反义真核表达载体转入人高转移肺癌细胞株95D,G418筛选后,荧光倒置显微镜检测转染结果. 结果: 经BamHⅠ酶切后,正义质粒形成5.3+1.7 kb两条DNA片段,而反义重组质粒为6.5和0.5 kb两条DNA片段,与理论计算值完全一致;转染后肺癌细胞倒置荧光显微下呈绿色荧光. 结论: 成功构建了人肝素酶的正、反义真核表达载体,并成功转染人低、高转移肺癌细胞株,为进一步研究正、反义肝素酶基因转染对肿瘤细胞的影响奠定了基础.
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人MCHR1真核表达载体构建及稳定转染HEK293细胞系的建立
目的 构建人MCHR1真核表达载体,转染HEK293细胞,建立稳定转染的HEK293细胞系.方法 采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR1基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染HEK293细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的HEK293细胞系,用RT-PCR、Western-blot检测MCHR1的表达.结果 构建了pcDNA3.1(+)/MCHR1真核表达载体,建立了稳定转染的HEK293细胞系,并成功地表达了目的 基因.结论 真核表达载体成功构建和稳定转染HEK293细胞系的建立为进一步研究MCHR1的功能奠定了良好的实验基础.
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β-分泌酶底物肽反转录病毒载体及其包装细胞株的构建
目的 用pLXSN反转录病毒载体构建介导β-分泌酶底物肽(BACEsp)基因表达的pLXSN-BACEsp反转录病毒载体,并建立高效、稳定表达BACEsp的包装细胞株.方法 根据BACEsp基因序列设计引物,PCR合成的BAC-Esp片段和pLXSN载体用EcoRⅠ、BamH Ⅰ双酶切后连接,构建成表达BACEsp的pLXSN-BACEsp反转录病毒载体.用脂质体介导转染PT67包装细胞,经抗性筛选后,挑单克隆扩大培养,用NIH3T3细胞测定病毒滴度,筛选出高效产毒细胞株.结果 经酶切、连接后构建成的质粒称为pLXSN-BACEsp,经测序证实构建成功,无任何碱基突变.经脂质体介导转染包装细胞、抗性筛选和测定病毒滴度,筛选出具有高病毒滴度的细胞集落,扩大培养后建立BAC-Esp高效表达的包装细胞株.结论 成功构建了能表达BACEsp的pLXSN-BACEsp反转录病毒载体,并建立了稳定、高效地产生有活性的BACEsp产毒包装细胞株.
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大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及GFP转染标记
目的建立大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离和培养方法,检测绿色荧光蛋白基因转染MSCs的瞬时表达及转染效率.方法应用Percoll密度梯度离心法分离大鼠MSCs,贴壁法不断纯化,流式细胞仪检测2代细胞表面CD34、CD71和CD90的表达,然后用pEGFP-N3与Lipofectamine 2000不同浓度比例转染MSCs,荧光倒置显微镜下观察瞬时表达及转染效率.结果①原代MSCs多呈纺锤形或梭形,有聚集生长的倾向,多3～5个细胞成为一个集落.传代后,细胞变为形态均一的排列有序的成纤维细胞样,长梭形,胞浆突起较少,胞体轮廓不甚清晰,胞体也相对较大;②GFP转染后24 h即可见绿色荧光蛋白表达,72 h表达强,此后逐渐减弱,到4周时仍可见少量表达;③转染效率与质粒和脂质体的浓度比例有关,1:2到1:3高.结论利用Percoll密度梯度离心法结合贴壁法可以获得比较纯的MSCs;GFP转染是一种较好的MSCs标记方法.
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核转录因子激活蛋白-1对PPARδ表达的调控作用
目的研究在过氧化物酶体增长因子活化受体δ(PPARδ)表达中的相关调控因子.方法用RT-PCR扩增人类PPARδ启动子序列,通过Deletion及重组将不同长短的PPARδ启动子序列转化到PGL3-basic载体中,转染LOVO细胞,通过观测各重组体转染活性,确定PPARδ启动子活性区域.再通过电泳迁移率变更分析(EMSA)、突变等方法确定核转录因子激活蛋白-1(AP1)对PPARδ表达的作用.结果 Deletion及重组转染后发现PPARδ启动子活性区域在序列3361～3464之间,EMSA、突变发现AP1因子结合位点突变后转染活性明显降低.结论 AP1因子结合位点突变后转染活性明显降低,提示AP1是PPARδ的一个增强子.
关键词： 过氧化物酶体增长因子活化受体δ 核转录因子激活蛋白-1 突变 转染 -
外源性p16基因对肾癌细胞周期及体外增殖的影响
目的观察外源性p16基因对肾癌细胞周期的影响及其对肾癌细胞的生长抑制作用.方法利用携带人p16基因的真核表达载体,采用脂质体介导法将其导入人肾癌细胞系GRC-1中,观察其对瘤细胞的作用.结果①免疫组织化学方法检测显示转染p16基因的GRC-1细胞可显著表达p16蛋白.②流式细胞仪检测证明,外源性p16基因可在肾癌细胞周期G1期到S期发挥抑制作用.③与对照组相比,转染p16基因的GRC-1细胞生长明显受到抑制.结论外源性p16基因具有细胞周期特异性地抑制肾癌细胞生长的作用.
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血管抑素对胰腺癌血管生成的抑制作用
目的 观察血管抑素在胰腺癌血管生成中的作用.方法 采用Lipofectamine 2000基因转染技术将真核表达载体pcDNA3.1(+)-angiostatin导入人胰腺癌PC-3细胞,筛选阳性克隆并扩大培养.PC-3细胞分为血管抑素转染组、空白对照组及脂质体对照组,分别检测各组血管抑素蛋白表达；利用显微镜下细胞计数法测定转染前后PC-3细胞的体外生长曲线；检测各组PC-3细胞培养上清所分泌的血管抑素对血管内皮细胞ECV-304增殖的影响.进一步建立种植瘤模型,通过CD34染色法检测Angiostatin对种植瘤中血管密度的影响.结果 Western blotting检测显示血管抑素转染组的PC-3细胞可分泌血管抑素,而空白对照组及脂质体对照组的PC-3细胞无血管抑素的分泌；细胞生长曲线显示,血管抑素转染组、空白对照组及脂质体对照组的细胞生长速度和倍增时间无明显差异；3组PC-3细胞上清液对内皮细胞ECV-304的生长有明显差异,血管抑素转染组的生长明显低于空白对照组及脂质体对照组.体内试验显示血管抑素转染组的种植瘤生长明显低于空白对照组及脂质体对照组.血管抑素转染组的种植瘤微血管密度(19.6±3.6)显著少于空白对照组(48.5±4.7)和脂质体对照组(51.1±5.4).结论 血管抑素可抑制血管内皮细胞的增殖,进一步产生抑制胰腺癌血管生成效应.
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原癌基因Fra-1高表达与乳腺癌细胞转移表型的关系
目的 研究原癌基因Era-1与人乳腺癌细胞系MCF-7细胞侵袭及迁移的关系.方法 提取乳腺癌细胞系MDA231细胞的总RNA,通过RT-PCR扩增Fra-1全长基因,将其克隆入pcDNA3.1(-)mye-his表达载体;应用脂质体法转染MCF-7细胞,观察Fra-1过表达对MCF-7细胞增殖、黏附和迁移的影响.结果 高表达Fra-1增强了MCF-7细胞的增殖、黏附和迁移的能力.结论 原癌基因Fra-1可能通过促进肿瘤细胞的增殖、黏附和迁移,在肿瘤细胞的侵袭和转移过程中发挥作用.
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hGPx-1-198Leu真核表达载体的构建与鉴定及在H9C2细胞中的表达
目的 构建含有人GPx-1基因Pro198Leu多态的真核表达载体,为深入研究GPx-1基因Pro198Leu多态在相关疾病中的作用与机制提供依据.方法采用全基因合成的方法合成含多态位点的人GPx-1基因cDNA片段,同时在基因5′端和3′端分别引入BamHⅠ和NotⅠ酶切位点,通过限制性内切酶酶切目的 片段和真核表达载体pEGFP-N3,再用T4 DNA连接酶将含有目的 基因的片段定向插入到载体pEGFP-N3真核人巨细胞病毒启动子下游.连接产物转化至DH5α中.挑取克隆、提取质粒进行鉴定.将hGPx-1-198Leu真核表达载体转染HEK293细胞,观察转染效率,并采用RT-PCR检测转染重组载体后细胞中GPx-1的mRNA表达水平.重组载体转染H9C2细胞,观察补硒之后的GPx-1表达情况.结果 获得目的 基因cDNA片段全长869bp,PCR和测序鉴定载体中含有人GPx-1-198Leu基因cDNA.重组载体转染HEK293细胞后检测到GPx-1的mRNA水平比未转染组及空质粒转染组明显升高,为深入研究GPx-1基因Pro198Leu多态在相关疾病中的作用与机制奠定了基础.H9C2细胞在转染后GPx-1蛋白水平升高并且随着硒浓度的升高而升高.结论 成功构建了含Pro198Leu多态位点的hGPx-1真核表达载体,并且也插入了保证该基因有效表达的硒代半胱氨酸插入序列.
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miR-195表达载体构建及其对肝癌细胞株HepG2植瘤抑制效果的影响
目的 研究miR-195对人肝癌细胞株HepG2肿瘤形成的影响.方法 应用分子克隆技术构建miR-195表达载体；用脂质体转染以及克隆筛选技术,建立miR-195高表达HepG2细胞株,并通过测序及序列比对等进行鉴定；建立荷瘤小鼠模型,检测不同细胞系的肿瘤生长能力.结果 通过测序及序列比对,证明miR-195表达载体构建成功；荧光显微镜观察结果显示,miR-195高表达HepG2细胞株成功构建,实时定量PCR鉴定结果表明,构建的miR-195高表达HepG2细胞株miR-195表达量为对照培养HepG2细胞株的2 000倍(P＜0.01)；植瘤实验证明,miR-195高表达可以抑制肿瘤的形成过程.结论 作为抑癌的miRNA,miR-195有望成为肝癌基因治疗的效应分子.
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短发卡RNA抑制survivin表达并诱导CNE-2细胞凋亡
目的 观察以短发卡RNA(shRNA)抑制鼻咽癌细胞survivin表达对细胞凋亡与增殖的影响.方法 构建特异性survivin shRNA,转染CNE-2细胞.分组:A组为空白对照组；B组为阴性干扰组,转染pSIREN-survivin/nonsenseshRNA;C组为阳性干扰24 h组,转染pSIREN-survivin/shRNA;D组为阳性干扰48 h组,转染pSIREN-survivin/shRNA.以RT-PCR、Western-blot分别测定细胞survivin mRNA及蛋白,PI、TUNEL及MTT检测细胞周期、凋亡率、细胞增殖.结果 转染效率约(70.90±4.76)％；C组survivin mRNA和蛋白抑制率分别为(41.58±0.63)％、(68.29±0.52)％；D组抑制率分别为(63.64±0.96)％、(70.83±0.48)％.C组凋亡率为(36.24±0.78)％,D组为(50.37±0.85)％,显著高于B组和A组；S期细胞减少,G2/M期比例增高；MTT结果提示细胞增殖受到明显抑制.结论 特异性shRNA可有效干扰CNE-2内survivin的表达,诱导细胞凋亡并抑制其过度增殖.
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小鼠Reg3α基因cDNA成功转染MIN6细胞株并促其生长
目的 建立一过表达Reg3α cDNA的胰岛MIN6细胞株,研究其在低葡萄糖环境中的生长特性.方法 将全长Reg3α cDNA插入到质粒载体pcDNA3.1中,并将Reg3α pcDNA3.1和pcDNA3.1空载体用脂质体法转染胰岛MIN6细胞,分别获得Reg3α cDNA过表达和空载体pcDNA3.1MIN6细胞.应用Real time PCR和Western blot方法检测这两种细胞在低葡萄糖培养基中Reg3α的表达,并用MTT法测定Reg3α过表达对MIN6细胞生长的影响.结果 有三株Reg3α转染的细胞株显示Reg3α的高表达,在空载体转染的MIN6细胞株中未检测到Reg3α的表达,Reg3α mRNA和蛋白水平分别平均升高6～10倍.用Western blot检测发现Reg3α蛋白释放到培养液.采用MTT法测定,与空载体转染的MIN6细胞株相比,三株Reg3α稳定转染细胞株,7 d后细胞数目升高2倍.结论 本研究结果表明已成功地建立了过表达Reg3α cDNA的胰岛MIN6细胞.Reg3α可能具有内分泌作用,促进胰岛细胞生长.
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超声及超声微泡介导基因转染的可行性研究
目的 探讨超声、超声造影剂微泡介导基因转染的可行性及所需超声照射时间.方法 选择超声能量在MI=1.5,超声频率f=8 MHz,向人脐静脉内皮细胞(HUVEC)悬液加入微泡后分别超声辐照20 s、1、5、10、15、30 min,继续培养24 h.然后用台盼蓝拒染法计数活细胞,各组与对照组(无辐照)行统计学分析,选择超声辐照的佳时长.然后,微泡与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)质粒充分孵育后,采用该时长进行超声微泡介导基因转染试验,细胞继续培养48 h后,通过荧光显微镜观察EGFP的表达.结果 超声辐照10、15、30 min组细胞计数比对照组降低,差异有统计学差异(P＜0.05).利用超声能量在MI=1.5、超声频率f=8 MHz条件下辐照5 min,继续培养48 h后荧光显微镜观察,有EGFP表达,细胞生长良好.结论 超声微泡能够促进质粒进入细胞并转染基因.超声能量MI=1.5、超声频率f=8 MHz时,超声微泡介导基因转染的佳辐照时长为5 min.
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假型逆转录病毒载体高效介导兔平滑肌细胞基因转染
目的 构建假型逆转录病毒载体MuLV/VSV-G,并用于转染兔平滑肌细胞,为兔平滑肌细胞基因转染寻找一种高效的载体.方法 构建含有报道基因lacZ的假型逆转录病毒载体MuLV/VSV-G,测定滴度,并转染兔平滑肌细胞,观察其转导效率.并与MuLV的转导效率进行比较.结果 构建的MuLV/VSV-G载体,病毒滴度为6～7.8×10~6CFU,转染兔平滑肌细胞的效率是(92±12)%.而MuLV的转导效率为(24±5)%.结论 成功构建了假型逆转录病毒载体MuLV/VSV-G载体,该载体作为一种高效的载体可用于兔平滑肌细胞基因转染.
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一种改良式质粒DNA提取方法的建立与应用
目的 建立一种稳定、可靠的质粒DNA提取改良方法,探讨其在分子生物学实验研究中的应用价值.方法 将含有目的 质粒的菌株扩增后,运用改良后的碱裂解法进行质粒DNA小量提取,微量核酸仪测定提取质粒DNA的产量及纯度;采用琼脂糖凝胶电泳、内切酶酶切及质粒转染真核细胞鉴定提取质粒DNA的质量及转染效率.结果 改良式质粒提取方法获得质粒DNA产量为3.2 mg/L菌液,A260/280=1.91;内切酶酶切完全;质粒DNA以超螺旋结构为主;真核细胞转染效率为20%左右.结论 改良式质粒DNA抽提方法操作简单、实用,获得质粒DNA产量多、质量高,能达到分子生物学常规实验的要求.
