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ClC-3荧光真核表达载体的构建及表达
目的 构建表达ClC-3的荧光真核表达载体,为研究其在肿瘤细胞中的作用提供分子工具.方法 将ClC-3的编码序列亚克隆到pEGFP-N1质粒,构建荧光真核表达载体pEGFP-N1/ClC-3,利用脂质体介导将ClC-3基因导人人乳腺癌细胞MCF-7内,通过绿色荧光观察检测基因的表达.结果 成功构建荧光真核表达载体pEGFP-N1/ClC-3,该载体转染MCF-7细胞后,可观察到绿色荧光.结论 表达ClC-3的荧光真核表达载体构建成功,并在乳腺癌细胞中得到正确表达,为进一步研究ClC-3在乳腺癌中的作用奠定了基础.
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碱性成纤维细胞生长因子荧光真核表达载体构建及对过氧化氢诱导血管内皮细胞凋亡的影响
背景:已证实外源性碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)可抑制血管内皮细胞凋亡.目的:构建表达bFGF 的荧光真核表达载体,探讨其对过氧化氢(H2O2)诱导的血管内皮细胞凋亡和凋亡相关蛋白的影响.方法:通过基因亚克隆构建荧光真核表达载体pcDNA3.1-bFGF-GFP,利用脂质体介导将bFGF 基因导入人脐静脉内皮细胞内,通过荧光观察和RT-PCR 检测基因的表达.实验分为3 组,对照组(转染pcDNA3.1)、过氧化氢组(转染pcDNA3.1+H2O2)和bFGF 转染+过氧化氢组(转染pcDNA3.1-bFGF-GFP+H2O2),流式细胞术测定细胞凋亡率,Western blot 检测caspase-3 P17 活性亚单位和Bax 蛋白表达.结果与结论:成功构建荧光真核表达载体pcDNA3.1-bFGF-GFP,该载体转染人脐静脉内皮细胞后,bFGF mRNA 显著增加,并可观察到绿色荧光.与对照组相比,过氧化氢组细胞凋亡率和caspase-3 P17 活性亚单位、Bax 蛋白的表达量都明显增加(P < 0.01),而bFGF 转染+过氧化氢组的细胞凋亡率和caspase-3 P17 活性亚单位、Bax 蛋白的表达量则比过氧化氢组显著降低(P < 0.01).证实bFGF 基因转染能抑制过氧化氢诱导的血管内皮细胞凋亡,其作用机制可能与调控Bax 蛋白表达和caspase-3 活性有关.
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胶质细胞源性神经营养因子基因真核荧光表达载体的构建
目的:构建可在真核细胞中表达胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic growth factor,GDNF)的荧光表达载体.方法:采用聚合酶链反应(PCR)扩增GDNF基因,将GDNF DNA克隆到pEGFP-N1质粒,通过抗性基因筛选阳性克隆,经酶切和测序鉴定.结果:酶切和DNA序列鉴定均证实插入片段与Genebank报道的GDNF基因序列一致.结论:成功构建了GDNF荧光真核表达载体,为从分子水平开展GDNF 转基因相关研究奠定了基础.
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碱性成纤维细胞生长因子真核荧光表达载体的构建
目的:构建可在真核细胞中表达碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的真核表达载体,为进一步开展bFGF基因治疗缺血性脑血管疾病奠定基础.方法:①采用线栓法建立SD大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血模型,取缺血灶周围脑组织经逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增bFGF基因;②将bFGF DNA克隆到pGEM-T Easy质粒,经菌落PCR和HindⅢ和EcoRI双酶切鉴定;③然后将bFGF DNA亚克隆到pEGFP-N3质粒;通过抗性基因筛选阳性克隆,经菌落PCR、酶切和测序鉴定.结果:菌落PCR、酶切和DNA序列鉴定均证实插入片段与GenBank报道的bFGF基因序列一致. 结论: 经RT-PCR反应得到了特异的bFGF基因片段并成功构建了bFGF荧光真核表达载体.
关键词： 碱性成纤维细胞生长因子 逆转录聚合酶链反应 荧光真核表达载体 -
bFGF荧光真核表达载体构建及表达
目的构建可在哺乳细胞中表达碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)的荧光真核表达载体,以便进一步转染成骨细胞,研究bFGF基因转移在骨组织工程学中的应用.方法应用基因重组技术,将已经克隆的bFGF基因从PBR322-bFGF载体上亚克隆到荧光真核表达载体pEGFP-C3,构建的重组质粒经脂质体介导转染3T3细胞,36 h 后观察瞬时表达情况.结果①酶切、PCR和DNA序列鉴定均证实插入片段的正确性.②荧光显微镜下观察GFP的表达情况,观察到部分经转染的细胞发出绿色荧光;免疫组化检测bFGF的表达分泌情况,结果显示部分经转染的细胞呈阳性(棕色颗粒).结论成功地构建了bFGF荧光真核表达载体pEGFP-C3-bFGF,并在3T3细胞中表达了bFGF.
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人肝素酶基因正反义荧光真核表达载体的构建及肝癌细胞转染
目的构建正义和反义人肝素酶绿色荧光蛋白真核共表达载体,并分别转染人低转移肝癌细胞株MHCC97-L及高转移细胞株MHCC97-H和HCCLM6.方法采用基因重组技术,用EcoR I从pcDNA3-Hpa质粒上切下约1.7kb的人肝素酶全长cDNA片段,然后连入pIRES2-EGFP质粒的EcoR I酶切位点上,经BamH I酶切鉴定出正义和反义表达载体,并进一步测序确认.用脂质体法将肝素酶正义真核表达载体转入人低转移肝癌细胞株MHCC97-L,反义真核表达载体转入人高转移肝癌细胞株MHCC97-H和HCCLM6,24 h后荧光倒置显微镜下检测转染结果.结果经BamH I酶切后,正义质粒形成5.3kb和1.7kb两条DNA片段,而反义重组质粒为6.5kb和O.5kb两条DNA片段,与理论计算值完全一致;测序结果进一步确认了方向的正确性.转染成功的肝癌细胞在倒置荧光显微镜下呈绿色荧光.结论成功构建了人肝素酶的正、反义真核表达载体,并成功转染人低、高转移肝癌细胞株,为进一步研究正、反义肝素酶基因转染对肝癌细胞的转移能力的影响奠定了基础.
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正、反义Heparanase基因荧光真核表达载体的构建及胰腺癌SW1990细胞转染
目的构建正、反义人肝素酶绿色荧光蛋白真核共表达载体,并转染人胰腺癌SW1990细胞.方法用EcoR I从pcDNA3-Hpa质粒上切下约1.7 kb的人肝素酶全长cDNA片段,然后连入pIRES2-EGFP质粒的EcoRI酶切位点上,经BamH I酶切鉴定出正义和反义表达载体,并进一步测序确认.用脂质体法将肝素酶正、反义真核表达载体转染人胰腺癌SW1990细胞,24 h后荧光倒置显微镜下检测转染结果.结果经BamH I酶切后,正义质粒形成5.3 kb和1.7 kb两条DNA片段,反义重组质粒为6.5 kb和0.5 kb两条DNA片段,与理论计算值一致; 测序结果进一步确认了方向的正确性.转染成功的胰腺癌细胞在倒置荧光显微镜下呈绿色荧光.结论成功构建了人肝素酶正、反义真核表达载体,并成功转染人胰腺癌细胞株SW1990,为进一步研究正、反义肝素酶基因转染对胰腺癌细胞的转移能力的影响奠定基础.
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人肝素酶基因正反义荧光真核表达载体的构建及肺癌细胞转染
目的: 构建正义和反义人肝素酶与绿色荧光蛋白真核共表达载体,并分别转染人低转移肺癌细胞株95C及高转移细胞株95D. 方法: 采用基因重组技术,用EcoRⅠ从pcDNA3-Hpa质粒上切下约1.7 kb的人肝素酶全长cDNA片段,然后连入 pIRES2-EGFP质粒的EcoRⅠ酶切位点上,经BamHⅠ酶切鉴定出正义和反义表达载体,并用脂质体法将肝素酶正义真核表达载体转入人低转移肺癌细胞株95C、反义真核表达载体转入人高转移肺癌细胞株95D,G418筛选后,荧光倒置显微镜检测转染结果. 结果: 经BamHⅠ酶切后,正义质粒形成5.3+1.7 kb两条DNA片段,而反义重组质粒为6.5和0.5 kb两条DNA片段,与理论计算值完全一致;转染后肺癌细胞倒置荧光显微下呈绿色荧光. 结论: 成功构建了人肝素酶的正、反义真核表达载体,并成功转染人低、高转移肺癌细胞株,为进一步研究正、反义肝素酶基因转染对肿瘤细胞的影响奠定了基础.
