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利用蛋白转导域介导的新型大分子转染方法
目的 构建蛋白转导域(PTD)与扩增链亲和素( Strep)融合蛋白,用于转染常规操作中难于转染生物大分子的血液肿瘤细胞、神经细胞、干细胞等细胞系.方法 采用聚合酶链反应( PCR)法引入PTD和G4S序列、扩增Strep序列；经酶切、连接构建重组质粒pAYZ-PTD-Strep,用低磷培养液AP5诱导表达融合蛋白,E-tag亲和层析柱纯化产物,Western blot鉴定产物,利用pAYZ-PTD-Strep将eGFP质粒转染到悬浮U937细胞内,流式细胞术测定融合蛋白转染效率.结果 目的产物PTD-G4S-Strep融合蛋白以可溶形式表达,产量约为0.7 mg/L,经E-tag亲和层析柱纯化后纯度可达90％以上.融合蛋白PTD-Strep可成功将质粒运送至悬浮细胞U937内,转染效率高于PTD单体.结论 构建的融合蛋白PTD-Strep具有将生物大分子转入血液肿瘤悬浮细胞内的活性,有望发展成为一种高效、可靠的真核细胞转染方法.
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人类Survivin基因真核表达载体的构建及其在K562细胞中的表达
目的 构建带有绿色荧光蛋白的Survivin基因真核表达载体pIRES2-EGFP/Survivin,并转染K562细胞.方法 以pDNR/Survivin质粒为模板,PCR扩增Survivin基因,T-A克隆,亚克隆至pIRES2-EGFP上,并对重组表达载体进行酶切、测序鉴定.采用Superfect转染试剂转染K562细胞.提取细胞RNA,RT-PCR检测Survivin基因mRNA表达.结果 经限制性酶切鉴定及测序分析证实pIRES2-EGFP/Survivin载体序列正确;荧光显微镜下可见转染的K562细胞有绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR证实转染细胞中存在Survivin基因mRNA的表达.结论 pIRES2-EGFP/Survivin表达载体构建成功,并在K562细胞内成功表达.
关键词： Survivin基因 真核表达载体 转染 K562细胞 -
人类前列腺凋亡反应因子4基因真核表达载体的构建及其在K562细胞中的表达
目的 构建带有绿色荧光蛋白的人类前列腺凋亡反应因子4(Par-4)基因真核表达载体pIRES2-EGFP/Par-4,并转染K562细胞.方法 以pDNR/Par-4质粒为模板,PCR扩增Par-4基因,T-A克隆,亚克隆至pIRES2-EGFP上,并对重组表达载体进行酶切、测序鉴定.采用Superfect转染试剂转染K562细胞.提取细胞总蛋白,Western blotting柃测Par-4表达.结果 经限制性酶切鉴定及测序分析证实pIRES2-EGFP/Par-4载体序列止确;荧光显微镜下可见转染的K562细胞有绿色荧光蛋白的表达,Western blotting 证实转染细胞中存在Par-4蛋白的表达.结论 pIRES2-EGFP/Par-4表达载体构建成功,并在K562细胞内成功表达.
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组蛋白去乙酰化酶抑制剂提高腺病毒对K562细胞转染及杀伤效率的研究
目的 研究通过观察组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂曲古抑菌素A(TSA)对人类白血病细胞系K562柯萨奇-腺病毒受体(CAR)表达水平的影响,并探讨HDAC抑制剂在以腺病毒为载体的基因治疗中的应用价值.方法 在mRNA和蛋白水平检测TSA处理K562细胞前后CAR的表达情况,采用流式细胞术测定病毒的转染效率,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测腺病毒及其携带的基因的体外抗瘤效应.结果 TSA处理后,K562细胞CAR的mRNA和蛋白表达明显增高;流式细胞仪分析ADV-GFP转染K562后GFP的表达发现:未处理组的转染率为(8.74±0.34)%,1、10和100 nmol/LTSA处理细胞48h后的转染率分别为(12.26±0.55)%、(20.83±1.22)%和(28.66±0.43)%.未处理组与处理组间及各处理组间转染效率的差异有统计学意义(P《0.05).MTT结果表明腺病毒M1介导的体外杀伤效应TSA处理组比未处理组增强(P《0.05),TSA各处理组间的体外杀伤效应随TSA浓度的提高而增强(P《0.05).结论 低浓度的TSA可以增强腺病毒对K562细胞的感染及杀伤效率,可以提高以腺病毒为载体的血液肿瘤基因治疗的疗效.
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抑癌基因p16INK4a与p53抑制白血病细胞株生长作用的比较
目的 比较野生型p16INK4a、p53抑癌基因的表达对白血病细胞株K562和HL60的生长抑制.方法 采用脂质体介导野生型p16INK4a、p53抑癌基因转染K562、HL60细胞并进行G418筛选,免疫印渍检测p16INK4a、p53基因的表达,通过细胞生长曲线检测细胞活力,流式细胞仪进行细胞DNA周期分析及细胞凋亡分析,采用联苯胺氧化试验检测K562细胞的分化.结果 转染后p53、p16INK4a在K562及HL60细胞中表达;与对照细胞相比,实验组细胞生长受到明显的抑制,G1期细胞数增加,S期细胞减少.与p16INK4a相比,抑癌基因p53使细胞表达Annexin V增加,显示出更强的致凋亡现象,尤其在HL60细胞株.结论 抑癌基因p16INK4a、p53能有效抑制白血病细胞株的生长,可能更适合复发、难治性白血病的基因治疗.
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黏蛋白1基因磁转染树突状细胞诱导细胞毒性T细胞抗膀胱肿瘤免疫效应的研究
目的:探讨黏蛋白1(mucins 1,MUC1)基因磁转染体外人树突状细胞(dendritic cell,DC)的可行性,观察其诱导的特异性抗MUC1膀胱癌CTL的免疫效应.方法:以葡聚糖磁性纳米颗粒(DMN)作为载体,在多聚赖氨酸(PLL)的辅助下,通过静电作用结合MUC1基因的真核表达载体pEGFP-C1-MUC1,在钕-铁-硼稀土强磁块的磁场作用下转染DC,荧光显微镜下观察及流式细胞术检测转染效率,并用RT-PCR法检测转基因DC中MUC1基因的表达;再将转染MUC1基因的DC与自体T细胞共培养,并分别用乳酸脱氢酶释放法检测所致敏的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)对MUCI特异性抗膀胱癌(膀胱肿瘤BIU87细胞系)的杀伤活性,用透射电镜观察CTL诱导靶细胞凋亡情况;ELISA法测定MUC1基因修饰后的DC刺激自体T细胞分泌IFN-γ的能力.结果:pEGFP-C1-MUC1转染效率为10%左右,荧光显微镜下可观察到明显绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR法可检测到MUC1条带,转染MUC1基因的DC与自体T细胞混合培养后能诱导出MUC1特异性的CTL,对BIU87细胞的杀伤实验表明T-DC-MUC1的杀伤活性显著高于对照组T-DC-pEGFP-C1和T-DC诱导的CTL(P均<0.05);在透射电镜下也可观察到部分BIU87膀胱肿瘤细胞出现了细胞核核仁消失,染色质浓集于核膜周围等早期凋亡表现;基因修饰后的DC能刺激自体T细胞分泌高水平的IFN-γ,明显高于未转染的DC(P<0.05).结论:葡聚糖磁性纳米颗粒在同定磁场的作用下成功将MUC1基因转入DC,并可有效诱导出特异性抗MUC1膀胱癌的细胞毒性T细胞.
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miRNA模拟物转染人支气管上皮细胞的影响因素和条件筛选
目的:研究miRNA模拟物浓度、脂质体浓度、转染时间对人支气管上皮细胞转染效果和毒性的影响,筛选miRNA模拟物转染人支气管上皮细胞的适宜条件.方法:分别应用0、10、30、50 nmol/L化学合成的、经Cy3标记的miRNA模拟物,以0、0.1%、0.3%、0.5%浓度的脂质体转染剂转染人支气管上皮细胞,转染6、12、24 h后应用荧光显微镜观察细胞转染情况,计算荧光强度,评价转染效果;转染24 h后,应用WST-8法检测不同转染条件对细胞活性的影响.结果:随着miRNA模拟物、脂质体浓度增加和转染时间的延长,细胞内荧光信号增强.30和50 nmol/L miRNA模拟物的转染效率明显高于10 nmol/L组(P<0.05);0.3%和0.5%脂质体组的转染效率明显高于0.1%组(P<0.05);转染24 h的荧光强度明显高于转染12 h和6 h组(P<0.05).与对照组相比,转染24 h后各转染组细胞活性无显著性变化(P>0.05).结论:人支气管上皮细胞适合应用脂质体进行化学合成miRNA模拟物的转染研究,miRNA模拟物浓度、脂质体浓度、转染时间均是转染的重要影响因素,30 nmol/L miRNA模拟物、0.3%脂质体、转染24 h可获得理想的转染效果,转染后对细胞活性无影响.
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CtBP1基因shRNA真核表达载体的构建及其干扰效果的初步鉴定
目的:构建C-末端结合蛋白-1(CtBP1)基因RNA干扰(RNAi)的真核表达载体,转染人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1(ADR+/+),初步鉴定其干扰效果.方法:以人CtBP1基因为靶基因,以pGenesil-1质粒为载体,根据GenBank数据库提供的CtBP1基因核苷酸序列,选择设计两条siRNA干扰序列,将带9个碱基茎环结构的干扰序列插入带有绿色荧光蛋白(EGFP)基因、卡那霉素(Kanr)抗性基因及U6启动子的真核表达载体pGenesil-1中,构建针对CtBP1基因的shRNA真核表达载体,转化大肠杆菌DHSa菌株,提取质粒,进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析.确认载体构建成功后,用脂质体LipofectamineTM 2000将重组质粒瞬时转染人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1(ADR+/+),在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,计数转染细胞数,计算转染效率,RT-PCR法检测载体对CtBP1基因的表达抑制效果.结果:构建针对CtBP1基因的pGenesil-1-CtBP1小发夹RNA(pGenesil-1-CtBP1-shRNA),经限制性内切酶酶切、PCR和DNA测序证实与设计完全一致;在荧光显微镜下观察到B-MD-C1(ADR+/+)细胞表达绿色荧光蛋白(EGFP),证实重组质粒己转染人细胞,转染效率达到60%～70%;RT-PCR结果显示B-MD-C1(ADR+/+)细胞中CtBP1基因被特异抑制,基因表达抑制率达40%以上,与转染试剂对照组、空白对照组和阴性序列对照组间的差异均具有统计学意义(P均<0.05).结论:成功构建CtBP1基因的shRNA表达载体,可以有效抑制B-MD-C1(ADR+/+)细胞上CtBP1基因表达.为进一步研究CtBP1基因功能进而逆转肿瘤的多药耐药奠定基础.
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HBV DNA重组质粒转染小鼠卵母细胞的研究
背景与目的:乙型肝炎是危害人类健康的全球性疾病.为了探索乙肝病毒通过卵母细胞垂直传递的可能性,对HBV DNA重组质粒能否转染小鼠卵母细胞进行了研究.材料与方法:将小鼠卵母细胞与pBR322-HBV DNA重组质粒进行共培养后,分别提取卵母细胞DNA及制备小鼠卵母细胞中期染色体.用PCR、Southern、斑点杂交及FISH技术证实HBV DNA能否转染小鼠卵母细胞.结果:PCR试验在受检样本中观察到HBV DNA阳性条带.Southern试验在受检PCR产物中观察到明显的阳性杂交信号.用每次实验的后3次洗液进行斑点杂交未发现HBV DNA阳性信号,排除了PCR和Southern阳性结果来自洗液污染的可能性.荧光原位杂交在1 000个卵母细胞中的36个中期相内发现HBV DNA杂交信号.结论:HBV DNA序列能够通过卵母细胞的透明带和细胞膜,进入卵母细胞内并整合到卵母细胞染色体上.此类卵母细胞与正常精子受精时,有可能作为载体将HBVDNA带进胚胎.
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CYP2E1基因过表达细胞株的建立及鉴定
目的：应用分子克隆技术，构建CYP2E1基因过表达载体，转染L02肝细胞，建立CYP2E1过表达细胞株并进行鉴定，为深入研究环境和职业毒物的毒作用机制提供模型细胞。方法：根据GenBank提供的基因cDNA序列设计引物，PCR扩增该基因并将其克隆到慢病毒过表达载体pLVX-acGFP1-C1中，将已经构建的慢病毒载体对293FT细胞进行转染，收集病毒上清，感染正常L02肝细胞。用嘌呤霉素进行筛选得到转染CYP2E1基因的L02细胞，通过基因测序、荧光定量PCR和Western blot对细胞株进行鉴定。结果：测序证明重组慢病毒过表达载体CYP2E1基因序列与GenBank提供的CYP2E1序列一致，荧光定量PCR检测转染CYP2E1基因的L02细胞比正常肝细胞CYP2E1 mRNA表达提高273倍，Western blot实验显示转染CYP2E1基因的L02细胞CYP2E1蛋白表达水平比正常肝细胞提高3.2倍。结论：成功构建了CYP2E1基因过表达细胞株，可应用于环境毒物和职业毒物的分子机制研究。CYP2E1
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肽核酸对大肠癌细胞生长影响的实验研究
研究肽核酸(PNA)对大肠癌细胞端粒酶活性的抑制作用及其对大肠癌细胞生长的影响,探索大肠癌治疗新方法.(1)检测不同浓度PNA对大肠癌LS-174T细胞端粒酶活性的影响;(2)应用脂质体LipfectamineTM介导不同浓度PNA-DNA杂交混合物转染LS-174T细胞,观察细胞克隆生长抑制结果,确定PNA对细胞生长的佳抑制剂量;(3)选用佳抑制剂量PNA转染LS-174T细胞、LipfectamineTM组和空白对照组,并观察其克隆形成率、细胞形态及群体生长差异.结果显示:(1)不同浓度PNA对大肠癌细胞端粒酶活性均有抑制作用,且与PNA浓度呈正相关;(2)细胞克隆形成抑制实验中PNA对LS-174T细胞佳抑制浓度为200nmol/L;(3)PNA实验组端粒酶活性明显低于脂质体组和空白对照组.结果表明,PNA抑制大肠癌细胞端粒酶活性对大肠癌LS-174T细胞生长具有明显抑制作用,为大肠癌早期诊断与治疗开辟新途径.
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转染音猬因子对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响
目的 建立能够持续稳定表达音猬因子(Shh)的骨髓基质干细胞(BMSCs),观察其成骨分化能力,为体内治疗骨质疏松提供可行性依据.方法 使用Gateway Technology构建pDown-DsRed-Shh,贴壁培养法获取SD大鼠BMSCs,慢病毒转染法将pDown-DsRed-Shh、pDown-DsRed报告质粒转染进BMSCs,分为DsRed-BMSCs组(A组)和Shh-DsRed-BMSCs组(B组),荧光显微镜下观察DsRed表达,判断转染效率.48 h后使用RT-PCR法和Western印迹法检测Shh基因的表达情况,7 d后检测碱性磷酸酶(ALP)活性,28 d后茜素红染色检测骨髓间充质干细胞的成骨情况.结果 慢病毒转染24 h后Shh-DsRed-BMSCs的转染率约为90％.同A组相比,B组能持续稳定高水平表达Shh mRNA和蛋白,同A组相比,B组的ALP活性更强,差异具有统计学意义(t=17.665,P<0.05),B组的茜素红染色表达情况明显高于A组.结论 慢病毒转染音猬因子的骨髓间充值干细胞可以导致Shh的持续稳定高水平表达,并具有很高的成骨细胞分化能力,为骨质疏松的体内治疗提供了理论基础.
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转染TGF-β1基因对大鼠树突状细胞成熟分化的影响
目的建立大鼠骨髓DC的分离和体外扩增方法,构建TGF-β1重组质粒并转染DC,检测TGF-β1基因对DC分化成熟的影响.方法分离大鼠骨髓造血前体细胞,在GM-CSF作用下经手法筛选,纯化、培养并扩增DC.构建TGF-β1-pcDNA3质粒,并以脂质体介导转染DC.以Dil荧光法和免疫细胞化学染色检测转染DC的 TGF-β1和RT1B的表达.结果 TGF-β1-pcDNA3质粒可转染未成熟DC并有效抑制DC表面RT1B的表达,并能抑制DC对LPS的反应.结论 TGF-β1基因能有效抑制DC成熟,并诱导机体免疫耐受.
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稳定过表达XAF1基因鼻咽癌CNE-2R细胞株的生物学特性的研究
目的 本课题组前期通过反复大剂量射线照射人鼻咽癌细胞株CNE-2构建出稳定传代的鼻咽癌放射抗拒细胞株CNE-2R,应用全基因组表达谱芯片研究发现XAF1基因在鼻咽癌放射抗拒细胞株CNE-2R中低表达,应用慢病毒作为载体将XAF1基因转染到CNE-2R中,成功构建稳定过表达XAF1基因鼻咽癌细胞株XAF1-CNE-2R,本研究拟探讨稳定过表达XAF1基因对鼻咽癌放射抗拒细胞株CNE-2R生物学特性的影响.方法 采用qRT-PCR和western blot法检测各组细胞XAF1蛋白表达的变化.用克隆形成实验、流式细胞术分别检测各组细胞的放射敏感性及细胞周期变化.结果 细胞克隆形成实验表明XAF1-CNE-2R细胞株放射敏感性增加(放射增敏比为SER=1.57).XAF1基因高表达后,细胞G2/M所占比例增加.结论 用慢病毒载体可以成功构建稳定过表达XAF1基因的鼻咽癌细胞株XAF1-CNE-2R;过表达XAF1基因可以逆转鼻咽癌的放射抗拒性,但尚需进一步研究.
关键词： X连锁的凋亡抑制蛋白相关因子1 鼻咽癌 转染 放射敏感性 -
重组人MBL在CHO细胞中的表达及检测
[目的] 在CHO-K1细胞中表达重组MBL并进行检测.[方法] 构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-mbl,用阳离子转染试剂Transfast转染CHO-K1细胞,G418筛选稳定转染的细胞.应用RT-PCR、ELISA及免疫荧光检测重组MBL的表达.[结果] RT-PCR从稳定转染pcDNA3.1(+)-mbl的CHO-K1细胞中检测到mbl基因的表达,夹心ELISA并未从转染细胞上清中检测到重组MBL,免疫荧光表明稳定转染pcDNA3.1(+)-mbl的CHO-K1细胞能够在胞浆中表达重组人MBL.[结论] 成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-mbl并转染CHO-K1细胞,转染的细胞能够表达重组人MBL.
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人微血管内皮细胞不同浓度的siRNA转染效果的实验观察
目的:观察不同浓度siRNA对人微血管内皮细胞HMEC-1细胞转染效果的影响,优化HMEC-1细胞的转染方法和siRNA用量.方法:HMEC-1细胞采用相同的细胞量接种处理后,荧光标记的siRNA (FAM-siRNA)随机分为高中低浓度及对照四个组,然后运用Lipofectamine@2000 Reagent转染试剂进行转染,培养48h后荧光显微镜观察转染的效果.结果:中高浓度siRNA转染效果较低浓度组好,且中高浓度转染效果相同.结论:中浓度siRNA更适合HMEC-1细胞的转染.
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SD仔鼠雪旺细胞的体外培养及转染NT-3基因的实验研究
目的体外培养雪旺细胞并转染NT-3基因,观察转染后细胞的生物学行为.方法用预涂有10%多聚赖氨酸的培养瓶体外原代和传代培养SD仔鼠雪旺细胞并用抗S-100多抗鉴定细胞性质,原代培养12小时后加入10-5 M阿糖胞苷,72小时后换成100μg/ml的G-418,连续作用5天后加入2μM氟丝扣林继续培养.用脂质体法转染入质粒pIRES2-EGFP-NT-3,免疫细胞化学检测NT-3的表达并用图象分析法定量,观察转染NT-3细胞的形态和细胞周期的变化.结果体外成功培养了SD仔鼠雪旺细胞,免疫细胞化学证实成功转染了NT-3基因,转染NT-3组有丝分裂期细胞数量较未转染组增高,但是细胞形态未见明显变化.结论细胞转染NT-3基因后,细胞的有丝分裂增快,细胞增殖增快.
