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LMP-1基因慢病毒重组体对大鼠骨髓间充质干细胞的增殖影响及其表达
目的:探讨LMP-1重组慢病毒载体体外转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)的方法,并检测LMP-1基因对BMSC增殖能力的影响及表达.方法:选取清洁级4周龄SD大鼠6只(雌雄不限),无菌条件下提取骨髓间充质干细胞并培养至第3代,设立空白对照组(未经特殊处理,只有第3代骨髓间充质干细胞)、慢病毒载体转染组(在未经特殊处理的第3代骨髓间充质干细胞中加入PGC-FU-GFP及转染试剂Polybrene)和重组基因转染组(在未经特殊处理的第3代骨髓间充质干细胞中加入PGC-FU-LMP-1-GFP及转染试剂Polybrene)进行转染.转染48 h后,通过免疫荧光显微镜观察荧光表达,流式细胞仪检测慢病毒的转染效率,采用MTT法评价慢病毒转染对BMSC增殖的影响;Western Blot检测转染后基因的表达情况.结果:①成功培养出第3代SD大鼠BMSC,以100的感染复数(MOI)转染,48 h后免疫荧光显微镜下可见大量绿色荧光蛋白表达,转染效率达67％;②不同时间点慢病毒载体转染组和重组基因转染组,与空白对照组细胞增殖比较差异无统计学意义;③Western Blot检测示重组基因转染组72 kDa处有条特征带,其大小与LMP-1融合蛋白(～50kDa+28kDa=78kDa)基本吻合.结论:经LMP-1基因慢病毒重组体转染大鼠骨髓间充质干细胞对其增殖活力没有影响并可有效表达LMP-1.
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慢病毒介导的Sox9基因在兔骨髓间充质干细胞的过表达促进软骨损伤修复
目的：明确在体内Sox9基因过表达的兔骨髓间充质干细胞对于关节软骨损伤修复的作用。方法：以慢病毒介导的Sox9基因转染兔骨髓间充质干细胞（BMSCs），体外检测软骨特异性分子，将新西兰大白兔24只48个膝关节随机分为3组，动物麻醉后，双侧股骨滑车处的关节面上用直径4 mm的钻头钻孔，深度3 mm，穿透软骨下骨，造成全层关节软骨损伤，将转染后的细胞植入体内用以修复全层关节软骨损伤，实验组植入BMSCs-（Lenti-Sox9-EGFP）-藻酸钙复合物，实验对照组植入BMSCs-藻酸钙复合物，空白对照组只钻孔。术后6、12周分别进行光镜、电镜观察，以及HE、免疫组织化学染色检测软骨的修复程度。结果：经Sox9基因转染后的细胞在3 d时，Sox9基因表达高，随后下降。转染后3 d，Ⅱ型胶原开始表达，到14 d时达到高。表明Sox9过表达启动了兔骨髓间充质干细胞的软骨分化。组织学观察显示，实验组术后6周缺损处有透明软骨样组织填充，术后12周缺损处软骨和软骨下骨修复良好。两对照组，缺损处由纤维组织填充。免疫组织化学显示，修复组织内Ⅱ型胶原，免疫组化染色结果阳性强于两对照组。组织学评分结果显示实验组软骨损伤修复各时间点效果明显优于两对照组，差异有统计学意义。结论：Sox9基因过表达的兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）促进软骨损伤的修复。
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活血益气方及其拆方药物血清对VEGF165转染脐静脉内皮细胞分泌MMP-9,MMP-2的影响
目的:探讨活血益气方及其拆方含药血清对含有血管内皮生长因子(VEGF) 165的重组质粒pcDNA3.1-VEGF165转染人脐静脉内皮细胞(HUVEC)分泌基质金属蛋白酶(MMP)2,9的影响.方法:构建pcDNA3.1-VEGF165重组质粒,采用Fugene HD将质粒瞬时转染至HUVEC中.制备活血益气方及其拆方含药大鼠血清、生理盐水正常血清,以5％药物血清作用于转染后的HUVEC,Western blot法检测VEGF的表达,ELISA法测定MMP-2,MMP-9的表达.结果:(1)活血益气方组VEGF蛋白表达高于生理盐水组,与之比较有统计学差异(P＜0.01).拆方各组则低于活血益气方组,与之比较有统计学差异(P＜0.01).(2)活血益气方组、活血方组MMP-2含量高于生理盐水组,与之比较有统计学差异(P＜0.05,P＜0.01).拆方各组中仅益气方组MMP-2含量低于活血益气方组,与之比较有统计学差异(P＜0.01).(3)活血益气方及其拆方各组MMP-9含量均高于生理盐水组,仅活血益气方组、活血方组与之比较有统计学差异(P<0.01,P＜0.05).拆方各组MMP-9含量均低于活血益气方组,与之比较具有统计学差异(P＜0.01).结论:活血益气方可以促进转染后HUVEC表达VEGF及分泌MMP-2,MMP-9,活血方药在这方面起主要作用.推测其治疗性血管生成作用机制可能与促进内皮细胞分泌MMP,从而促进内皮细胞迁移,提高血管通透性有关.
关键词： 活血益气方 人脐静脉内皮细胞 血管内皮生长因子165质粒 转染 基质金属蛋白酶 -
天螺多糖抑制HBV复制的体外实验研究
天螺多糖是我院首次以天螺(江西巴蜗牛,Bradybana.Jiangxinensis)为原料采用溶剂提取法制取的生物活性物质[1].为进一步了解天螺多糖的药理活性及其细胞毒性,我们以HBV转染的人肝癌细胞2.2.15细胞株为靶细胞,通过细胞培养实验观察其对HBV-DNA复制的抑制作用.
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中国仓鼠卵巢细胞中稳定表达发热伴血小板减少综合征病毒样颗粒新方法的研究
为了探索发热伴血小板减少综合征病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)样颗粒的高效表达方法,本研究根据布尼亚病毒装配成熟的机制,建立SFTS病毒包膜糖蛋白和核蛋白融合表达质粒,并在表达载体中引入荧光蛋白报告基因,转染中国仓鼠卵巢细胞,传代培养两代后,根据荧光蛋白表达水平,采用有限稀释法,在荧光显微镜下,人工挑选细胞集落,建立病毒样颗粒稳定表达细胞系,并通过荧光蛋白表达水平的变化,评价细胞系的稳定性,采用间接免疫荧光、免疫印迹和电子显微镜对病毒样颗粒进行分析鉴定.结果显示,融合表达的包膜糖蛋白和核蛋白可在细胞内装配形成病毒样颗粒并分泌到胞外,在无选择压力条件下筛选的细胞系能够在较长时间内保持稳定,传代40次后报告基因表达水平无明显变化.本研究显示了通过病毒结构蛋白基因的修饰,可以改进病毒样颗粒制备方法,为相关生物制品的生产技术研究提供了重要线索.
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鹅圆环病毒感染性克隆的构建及其转染试验
设计带BamHⅠ酶切标记位点的引物,PCR扩增鹅圆环病毒(Goose circovirus,GoCV)全长基因组,将2个基因组顺式连接插入到pGEM-T Easy载体中,获得GoCV全长基因组头尾串联二聚体感染性克隆质粒pGEMT2GoCV.EcoR Ⅰ酶切线性化pGEMT-2GoCV,与脂质体混合转染GoCV阴性鹅胚和雏鹅,常规PCR检测发现GoCV在转染鹅体内增殖,鹅胚转染组于孵出第2周和第4周检出血清阳性,且其中一个个体于4周龄扑杀时检出法氏囊阳性,雏鹅转染组于转染后2周检出血清阳性.试验进一步对扩增片段进行了BamH Ⅰ标记位点的检测,并应用GoCV实时荧光定量PCR方法对转染阳性样品进行了定量,结果显示阳性法氏囊组织中病毒含量为1.57×106拷贝/mg,阳性血清含病毒拷贝数在3.52×104～5.92×105拷贝/μL.综上,本试验构建的GoCV全长基因组头尾串联二聚体感染性克隆DNA可以转染鹅胚和雏鹅并增殖出带标记的GoCV克隆.
关键词： 鹅圆环病毒 全长基因组头尾串联二聚体 感染性克隆 转染 -
利用反向遗传技术产生8基因全禽源流感病毒疫苗候选株
利用反向遗传技术将含有A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)株禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的6个内部基因与H5N1亚型AIV的2个表面基因HA和NA共转染COS-1细胞,产生了6+2全禽源的重配AIV.将H5N1亚型AIV的HA基因经基因突变致弱,然后将A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)AIV的6个内部基因的cDNA和以上致弱的禽源HA基因及NA基因的cDNA分别克隆到转录/表达载体pHW2000中,构建成8个转录/表达质粒.将8个质粒共转染COS-1细胞,24h后收获细胞及上清接种SPF鸡胚,72～90h后鸡胚死亡,收取鸡胚尿囊液进行血凝、血凝抑制试验、序列分析、病毒致病性试验和动物免疫保护试验,终证实产生了致弱的全禽源AIV疫苗候选株.
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EB病毒LMP1及其CTAR1、CTAR2导入人HNE2鼻咽癌细胞的研究
用电穿孔转染法,建立稳定表达野生型LMP1及其不同突变体的鼻咽癌细胞系,并以这些细胞系为材料,用MTT法检测增殖期活细胞,观察LMP1及其不同的结构域对鼻咽癌细胞生长的影响.结果得到了LMP1及其三种突变体、空白载体表达的鼻咽癌细胞系:HNE2-LMP1(野生型)、HNE2-LMP1△185-351(CTAR1缺失型)、HNE2-LMP1(1-231)(CTAR2缺失型)、HNE2-LMP1(1-185)(羧基端胞浆区缺失型)、HNE2-pSG5(空载体型).进一步证实HNE2-LMP1、HNE2-LMP1(1-231)、HNE2-LMP1 △185-351平均吸光度(A)比值高于对照组HNE2-pSG5及HNE2(P＜0.01).这提示:EB病毒LMP1及其LMP1(1-231)和LMP1△185-351在体外明显促进HNE2细胞增殖.结果表明EB病毒LMP1可能在鼻咽癌中发挥着重要的作用.
关键词： 鼻咽癌 Epstein-Barr病毒 转染 细胞增殖 -
反转录病毒MSCV介导汉坦病毒核蛋白基因在NIH3T3细胞中整合和表达
汉坦病毒是引起肾综合征出血热(HFRS)和汉坦病毒型肺炎综合征(HPS)的主要病原体.由S基因编码的核蛋白(NP)主要与机体的细胞免疫有关,并调节病毒的复制及诱导细胞程序性死亡.构建了汉坦病毒Z10株核蛋白cDNA与含有pac基因的反转录病毒鼠干细胞病毒(MSCV)重组体MSCV-FlagNP,通过磷酸钙转录法导入产病毒的包装细胞系BOSC23中,产生完整的重组MSCV-FlagNP病毒.然后以重组病毒感染NIH 3T3细胞,利用Puromycin的选择特性(pac基因)对感染细胞进行连续压力筛选,获得了转核蛋白抗性细胞.利用Southern blot和PCR方法分别对核蛋白基因在抗性细胞染色体整合情况及其完整性进行了鉴定.并且用Western blot在抗性细胞中可检测到核蛋白的表达.进一步以Flag单克隆抗体介导的免疫荧光染色联合共聚焦激光扫描荧光显微镜,分析了内源性Flag融合核蛋白在抗性细胞内分布,发现核蛋白主要分布于胞浆及胞核周围区,并且部分核蛋白可聚集形成胞浆包涵体.转核蛋白基因细胞模型的建立,对进一步研究汉坦病毒核蛋白功能以及病毒复制机制有重要意义.
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猪瘟病毒兔化弱毒株全长cDNA克隆的感染性鉴定
用SrfⅠ限制性内切酶将构建的猪瘟病毒兔化弱毒株(C-株)全长cDNA线性化,体外转录获得其基因组RNA,利用脂质体将基因组RNA转染至SK-6细胞系,连续传代,收集5代以后培养细胞,采用RT-PCR、荧光抗体直接法、夹心ELISA进行鉴定.结果表明,所构建的全长cDNA具有感染性.猪瘟病毒C-株全长感染性cDNA的成功构建,为在分子水平上进一步研究中国猪瘟病毒兔化弱毒株提供了极有价值的研究工具.
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杆状病毒反式激活蛋白IE-1诱导昆虫细胞凋亡及几种抑制剂对AcNPV诱导细胞凋亡的影响
为了探讨杆状病毒诱导细胞凋亡的机制,用含AcNPV-ie-1基因的重组质粒pGAM-ie-1转染斜纹夜蛾细胞SL-1和粉纹夜蛾细胞Tn-5B1.转染后24h通过光镜观察、DAPI荧光染料染色、DNA琼脂糖凝胶电泳等发现,SL-1发生了典型的凋亡,而同样的现象并没有在Tn-5B1细胞中出现.利用放线菌酮(cycloheximide,CHX)、莫能菌素(Monensin)及蚜栖菌素(aphidicolin)处理AcNPV感染的SL-1细胞,发现细胞凋亡被莫能菌素及蚜栖菌素抑制,被放线菌酮推迟.此结果为进一步研究杆状病毒诱导昆虫细胞凋亡的机制等奠定了基础.
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超声－微气泡介导的基因转染研究进展
能否成功高效地转染靶基因对于基因治疗的效果具有决定性的影响。微气泡是具有稳定的封装壳，直径为微米量级的小气泡，已作为超声造影剂被广泛应用。微气泡在超声脉冲的作用下可以在靶区释放其携带的基因并使之转染，同时超声脉冲产生的热效应和空化效应能提高转染率。若将微气泡与磁性纳米颗粒结合，还可以进一步提高转染率和转染精度，是一种理想、安全的基因载体。本文综述了由超声－微气泡介导的基因转染在近5年的主要研究成果。对影响转染率的主要因素如微气泡种类、超声辐照条件、基因及受体类型等方面做了详细的论述，并对微气泡介导基因转染过程中的安全性、长效性和差异性等问题进行了讨论。
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大鼠GDNF基因的克隆表达及对PC12工程细胞的影响
克隆与表达大鼠胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)并观察其对PC12工程细胞的影响.从新生4天的SD大鼠海马组织中提取总RNA,通过 RT-PCR方法,扩增出GDNF cDNA.构建表达质粒pET-GDNF,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导GDNF表达并在Ni2+-NTA柱上用一步复性法纯化和复性.把PCDNA3.0-GFRα1和pcDNA3.0-RET质粒双转染入PC12细胞,G418筛选稳定克隆,构建PC12工程细胞.用GDNF刺激工程细胞,3天后观察其存活和分化.大鼠GDNF cDNA 的克隆与表达获得成功,纯化和复性的重组GDNF蛋白可显著增强PC12-GFRα1-RET工程细胞的存活和分化.初步明确GDNF诱导PC12工程细胞存活和分化是通过RET-依赖途径.
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HIF-1α转染方法的优化及其对间充质干细胞存活及分化功能的影响
目的 探索应用脂质体作为载体将低氧诱导因子-1α(HIF-1α)转染至间充质干细胞(MSCs)的转染方法.方法 应用脂质体作为载体将HIF-1α转染至P3代MSCs,荧光观察绿色荧光蛋白(GFP)表达,评估转染效率.比较在不同情况下细胞的转染效率.将转染的MSCs、空质粒转染的MSCs和未转染的MSCs置于缺氧环境下(CoCl2模拟缺氧),比较3种细胞HIF-1α mRNA、HIF-1α蛋白的表达.鉴定转染的MSCs向成骨细胞和脂肪细胞的分化能力,及在缺氧环境中的存活率.结果 应用脂质体法可以成功将pcDNA3.0-HIF-1α-eGFP转染至MSCs.当细胞汇合度在80％以上,DNA与质粒的比为(g/μL)1∶1.25,且转染时间为4h时转染效率高,为21％.转染HIF-1α的MSCs在缺氧环境中可被成功向脂肪细胞和成骨细胞诱导分化,HIF-1α转染可以提高缺氧时MSCs存活率(P＜0.05).在缺氧条件下pcDNA3.0-HIF-1α-eGFP瞬时转染的MSCs较空质粒(pcDNA3.0-eGFP)转染的MSCs和未转染的MSCs能高表达HlF-1αmRNA及HIF-1α蛋白(P＜0.05).结论 应用脂质体作为载体可以将HIF-1α转染至MSCs,HIF-1α转染的MSCs在缺氧时高表达HIF-1αmRNA及蛋白.
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PRDX6过表达增强肺癌细胞系A549的迁移和侵袭
目的 探讨PRDX6过表达对肺癌细胞系A549迁移性及侵袭性的影响.方法 1)体外培养人肺癌细胞系A549,分为空白组、转染PRDX6组、转染空质粒组. 2) Western blot检测细胞PRDX6蛋白表达;3) Transwell小室法检测细胞的迁移性及侵袭性.结果 1)转染PRDX6组PRDX6蛋白表达较空白组及转染空的质粒组明显增高(均P<0. 05);2)转染PRDX6组迁移性及侵袭性较空白组及转染空质粒组显著增高( P<0. 05).结论 PRDX6的高表达增强肺癌细胞系A549的迁移性及侵袭性.
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转染携带Ifi204基因的慢病毒上调大鼠主动脉成纤维细胞的p204表达
目的 观察转染携带Ifi204基因的慢病毒对大鼠血管外膜成纤维细胞P204表达的影响.方法 培养大鼠主动脉外膜成纤维细胞(VAF),免疫 细胞化学鉴定细胞类型及纯度.用携带Ifi204基因的慢病毒载体系统转染体外培养的大鼠成纤维细胞(Ifi204组),分别以空载慢病毒处理和未处理的 大鼠成纤维细胞作为对照组(C组)和空白组(N组).用q-PCR技术和Western blot检测细胞中p204 mRNA和蛋白表达.结果 p204在N组存在结构表达 .与N组和C组比较,Ifi204组的p204 mRNA及蛋白表达均上调(P＜0.01).结论 转染携带Ifi204基因的慢病毒可上调大鼠VAF的P204表达.
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FADDDEL-GFP基因修饰在小鼠胰岛细胞移植中的作用
目的 探讨融合蛋白FADDDEL-GFP在胰岛细胞移植治疗1型糖尿病中的作用.方法 将重组子FADDDEL-GFP导入胰岛细胞NIT-1,检测基因转染前后胰岛细胞分泌胰岛素的水平.用STZ诱导1型糖尿病模型小鼠,将FADDDEL-GFP修饰的NIT-fg细胞移植于糖尿病小鼠,检测胰岛细胞移植后对糖尿病小鼠的影响.结果 转染重组子FADDDEL-GFP的NIT-1可见绿色荧光蛋白表达;移植NIT-fg细胞的精尿病小鼠血糖降至正常,生存期延长,与对照组有明显差异.结论 FADDDEL-GFP可增强机体抗同种移植排斥反应的能力.
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磁性纳米颗粒与脂质体介导REST-siRNA转染hADSCs的比较
目的 对聚乙烯亚胺包被的磁纳米颗粒(PEI-SPIO)与脂质体(lipofectamineTM 2000)作为基因载体转染人脂肪间充质干细胞(hADSCs)的可行性及转染后细胞的增殖、转染效率及基因瞬时干扰效率进行比较分析.方法 分别将PEI-SPIO和lipofectamineTM 2000作为基因载体连接REST-siRNA体外转染hADSCs,用MTT法检测hADSCs增殖和功能;用荧光显微镜观察转染效率;分别用Real-time PCR和Western blot检测REST的表达.结果 用磁性纳米颗粒和脂质体作为基因载体转染细胞后,细胞成活率分别为99％和79％ (P ＜0.05);磁纳米颗粒和脂质体的转染效率无差异,分别为75％和71％;磁纳米颗粒和脂质体作为基因载体时RNA表达量分别为(0.46±0.04)和(0.53±0.05),蛋白水平表达量分别为(0.501 ±0.006)和(0.523 ±0.004).结论 磁性纳米颗粒因其具有低细胞毒性可代替脂质体作为转染干细胞的基因载体.
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GRIM-19基因的克隆及其对小鼠前列腺癌细胞株的促凋亡作用
目的 构建GRIM-19基因真核表达质粒,探讨GRIM-19基因转染对小鼠前列腺癌rm-1细胞的促凋亡作用.方法 采用RT-PCR及重组DNA技术构建pcDNA-GRIM-19真核表达质粒,体外进行基因转染.形态学观察,DNA ladder检测转染后rm-1细胞凋亡,RT-PCR方法检测rm-1细胞caspase-3活性.结果 扩增出GRIM-19 cDNA全长,测序结果与GenBank记载基本一致.转染rm-1细胞48 h后证明其能在真核细胞表达,形态学及共聚焦显微镜观察到pcDNA3.1-GRIM-19重组质粒组出现明显的细胞凋亡,并出现典型的DNA ladder.转染pcDNA3.1-GRIM-19重组质粒组caspase-3表达强度较对照组及空质粒组明显上调(P＜0.05).结论 成功克隆并构建鼠GRIM-19基因真核表达载体pcDNA3.1-GRIM-19,该载体可诱导鼠rm-1细胞凋亡.其凋亡机制与caspase-3酶活性有关.
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脂质体转染VEGF-C反义寡核苷酸对人胃癌OCUM-2MD3细胞VEGF-C表达的影响
目的 探讨脂质体转染VEGF-C反义寡核苷酸在人胃癌OCUM-2MD3细胞中的转染效率及对VEGF-C表达的影响.方法 以VEGF-C基因翻译起始区为靶点合成反义寡核苷酸,脂质体介导转染人胃癌OCUM-2MD3细胞,荧光显微镜观察转染效率,RT-PCR检测转染后VEGF-C mRNA表达水平,流式细胞术检测VEGF-C蛋白表达.结果 经脂质体介导可成功将VEGF-C反义寡核苷酸转染至胃癌OCUM-2MD3细胞,12 h达其峰值87.93%.反义组VEGF-C mRNA相对吸光度值为0.38±0.11,显著低于正义组(0.83±0.17)和对照组(0.80±0.14)(P＜0.01).反义组VEGF-C蛋白表达水平(31.26±5.17)%,较正义组(41.83±7.49)%和对照组(38.65±7.11)%亦明显下降(P＜0.01).结论 VEGF-C反义寡核苷酸经脂质体介导转染胃癌OCUM-2MD3细胞,可降低胃癌细胞VEGF-C mRNA及其蛋白表达水平.
