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MicroRNA-132增强乙酰胆碱对肺泡巨噬细胞炎症反应的抑制作用
目的 观察调控microRNA-132 (miR-132)联合乙酰胆碱(ACh)对脂多糖(LPS)诱导的大鼠肺泡巨噬细胞炎症反应的作用.方法 分别采用FAM荧光标记的mimic/inhibitor阴性对照(NC)、miR-132 mimic/inhibitor、mimic/inhibitor NC转染大鼠肺泡巨噬细胞NR8383,通过荧光显微镜观察转染效率,实时荧光定量PCR检测miR-132的表达.转染后细胞给予LPS(1μg/mL)刺激或LPS+ ACh(10 μmoL/L)处理,采用酶联免疫吸附试验检测细胞上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β (IL-1β)及白细胞介素-6(IL-6)浓度.两组间均数比较采用独立样本t检验,以P ＜0.05为差异具有统计学意义.结果 通过在NR8383细胞中转染mimic FAM NC确定50 nmol/L为转染mimic的佳浓度.与mimic NC组相比,miR-132 mimic组细胞中miR-132的表达上调了(21.54±2.14)倍(P=0.001).LPS组中结果发现miR-132 mimic上清液中TNF-α(P=0.683)、IL-1β(P=0.770)、IL-6(P=0.872)水平较mimic NC差异均无统计学意义;LPS+ ACh+ mimic NC组TNF-α(P=0.008)、IL-1β(P =0.004)、IL-6 (P =0.003)水平与LPS+mimic NC组相比均下降;LPS+ ACh+ miR-132 mimic组TNF-α(P=0.001)、IL-1β (P =0.001)、IL-6 (P =0.001)水平与LPS+ ACh+ mimic NC组相比均下降.通过转染inhibitor FAM NC确定100nmol/L为转染inhibitor的佳浓度.LPS组miR-132 inhibitor上清液中TNF-α(P=0.800)、IL-1β(P =0.449)、IL-6 (P =0.418)水平较inhibitor NC差异均无统计学意义.LPS+ ACh组结果显示miR-132 inhibitor可逆转ACh介导的TNF-α (P =0.018)、IL-1β (P =0.022)、IL-6 (P=0.032)水平的下降.结论 在体外培养环境,单独给予LPS时过表达miR-132或抑制miR-132活性不影响肺泡巨噬细胞炎症反应,但miR-132可增强ACh对LPS诱导的肺泡巨噬细胞炎症反应的抑制作用.
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hBDNF-GFP基因转染神经干细胞对视神经损伤大鼠视网膜BDNF表达的影响
目的 探讨移植hBDNF-GFP基因转染神经干细胞后对视神经损伤大鼠视网膜BDNF表达的影响.方法 ①78只SD大鼠随机分为正常对照组(n=6)、视神经夹伤组(n=72).视神经夹伤组动物行右侧视神经夹伤后随机平均分为三个亚组:分别于玻璃体腔内注射0.01 mol/L PBS(PBS组),GFP基因转染神经干细胞(GFP-NSCs组)和hBDNF-GFP基因转染神经干细胞(hBDNF-GFP-NSCs组).各组动物单纯暴露左侧视神经作为假损伤组.分别于移植后3 d,7 d,14 d和28 d处死动物取视网膜,ELISA法检测各组视网膜中BDNF含量.②另取6只视神经损伤大鼠移植hBDNF-GFP-NSCs,分别于2周、4周和8周各处死2只大鼠,取眼球做冰冻切片观察移植细胞存活、迁移情况.③35只sD大鼠随机分为4组:正常对照组(n=5)、右眼视神经损伤NSCs治疗组(n=10)、GFP-NSCs治疗组(n=10)及hBDNF-GFP-NSCs治疗组(n=10).④各组于术后4周和8周分别处死5只大鼠,West-era-blot法检测视网膜组织中BDNF表达.结果 ①ELISA结果显示,正常对照组BDNF含量与假损伤组间比较差异无统计学意义(P>0.05),移植手术后第3天时,三个损伤亚组视网膜匀浆上清中hBDNF含量明显增加(与假损伤组比较P<0.05),而三组间差异无统计学意义(P>0.05);7 d时,GFP-NSCs组与假损伤组比较差异具有统计学意义(P<0.05),而PBS组、hBDNF-GFP-NSCs组与假损伤组比较差异无统计学意义(P>0.05),PBS组与GFP-NSCs组间及hBDNF-GFP-NSCs组与GFP-NSCs组间差异具有统计学意义(P<0.05);移植第14天和28天时,PBS组和GFP-NSCs组中视网膜BDNF含量降低,而hBDNF-GFP-NSCs组中BDNF含量与其他三组比较明显升高,差异有统计学意义(P<0.05).②冰冻切片示移植后,hBDNF-GFP-NSCs可在宿主视网膜内存活,并逐渐迁移至视网膜各层.③Western-blot检测显示,各组内第4周和第8周BDNF表达差异无统计学意义,移植hBDNF-GFP-NSCs组视网膜组织中BDNF表达明显高于于其他各组.结论 hBDNF-GFP基因转染神经干细胞移植后可在宿主视网膜长期存活,且可以稳定高表达BDNF.
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经VEGF165转染的成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物的构建与临床应用
目的 构建经血管内皮生长因子165(VEGF165)转染的人成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物,并对其在促进深度烧伤患者创面愈合过程中的作用进行评价.方法 将30例深Ⅱ度或Ⅲ度烧伤患者随机分为2组,每组15例.移植转染有VEGF165成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物组为实验组,单纯脱细胞异种真皮替代物移植组为对照组.采用分子生物学方法 将扩增的VEGF165基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),在脂质体介导下将重组质粒转染至经传代培养的人成纤维细胞,再将转染后的人成纤维细胞接种于猪脱细胞真皮表面得到成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物;而后将此替代物与自体薄皮片移植于深度烧伤患者切痂后创面,对创面愈合情况进行观察并与单纯脱细胞真皮移植组进行比较.结果 构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)-VEGF165可成功转染人成纤维细胞,经转染的人成纤维细胞可顺利接种于脱细胞真皮形成成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物,替代物移植后实验组患者皮片成活率(90.25±5.39)%,对照组患者皮片成活率(83.98±3.63)%,两者有显著性差异(t=3.737,P＜0.01).实验组新生的毛细血管数量要明显多于对照组.结论 经VEGF165转染的人成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物具有显著的促进深度烧伤患者创面愈合的作用.
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重组VEGF165在哺乳动物细胞中表达及其生物学活性
目的 构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-血管内皮生长因子(VEGF)165并在哺乳动物细胞中实现目的 基因的表达,对目的 蛋白进行鉴定和生物学活性分析.方法 分子生物学方法将扩增的VEGF165基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),在脂质体介导下将重组质粒转染至哺乳动物细胞NIH 3T3并进行抗生素压力筛选,采用双抗夹心ELISA、SDS-PAGE和免疫印迹方法对目的 蛋白在转染细胞中的特异表达进行鉴定,在血管内皮细胞ECV304上对表达产物的细胞结合活性和促增殖活性进行分析.结果 构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)-VEGF165成功转染NIH 3T3,获得加压筛选的重组细胞,目的 基因得到稳定表达,目的 蛋白能与血管内皮细胞ECV304特异结合,并具有促内皮细胞增殖活性.结论 应用pcDNA3.1(+)-VEGF165载体转染的NIH 3T3细胞可稳定表达具生物学活性的VEGF165重组蛋白.
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超声介导微气泡造影剂促反义寡核苷酸转染的有效性研究
目的探讨超声介导脂质体微气泡转染反义寡核苷酸HA-2741的有效性.方法 12孔板培养人乳腺癌细胞,分组为:(1)单纯超声照射;(2)单纯造影剂;(3)单纯HA-2741;(4)超声照射+HA-2741;(5)造影剂+HA-2741;(6)造影剂+HA-2741+超声照射;(7)脂质体+HA-2741;(8)脂质体+HA-2741+超声照射.造影剂浓度2%,超声波发射频率1.3 MHz ,强度-3 dB,照射时间30 s,予与实验刺激后,流式细胞仪定量分析HA-2741的转染率,RT-PCR的检测乳腺癌细胞的HER-2 mRNA水平,免疫细胞化学检测HER-2蛋白的表达.结果造影剂+HA-2741+超声照射组HA-2741的转染率显著高于其余各组,约94.6 %,造影剂+HA-2741+超声照射组乳腺癌细胞的HER-2 mRNA水平显著降低,HER-2蛋白表达明显减低,其程度与HA-2741转染率呈正相关.结论超声介导微气泡造影剂显著增加基因的转染效率,方法简便,安全,具有良好的靶向性.
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自制脂质微泡联合超声辐照介导pGL3-Promoter-EGFP质粒转染卵巢癌细胞的实验研究
目的 探讨超声微泡介导基因转染卵巢癌细胞的可行性及转染效率.方法 (1)以不同声强作用SKOV3细胞60 s,筛选出对细胞活性无明显抑制的声强;(2)将筛选出的声强分别与不同浓度的微泡联合作用于SKOV3细胞,筛选出对细胞无明显抑制的适声强和微泡浓度的组合;(3)将SKOV3细胞分成5组,不同方式转染pGL3-Promoter-EGFP质粒:(1)裸质粒组;(2)质粒+微泡组;(3)质粒+超声组;(4)质粒+超声+微泡组;(5)质粒+脂质体组,比较各组转染效率.结果 (1)声强0.5、0.75 W/cm2的超声辐照,细胞死亡率＜10%;(2)0.24×108/ml或0.12×108/ml浓度的微泡联合0.5W/cm2超声辐照,细胞死亡率＜10%;(3)第4组与第5组转染效率无区别(P=0.133),但高于第1、2、3组(P＜0.001).结论 适当浓度微泡联合超声辐照能将外源基因在卵巢癌细胞中高效转移.
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超声辐照联合PEI增强体外基因转染的实验研究
目的 探讨超声辐照联合聚乙烯亚胺(PEI)增强子宫内膜癌细胞(Ishikawa)荧光素酶质粒(pCMV-LUC)基因表达的可行性.方法 以不同氮/磷酸盐比(N/P比)将2种不同分子量PEI与质粒DNA共孵育,制备阳离子复合物(PEI/DNA).利用凝胶阻滞实验测定PEI与DNA形成复合物时所需的比例,运用MTT法比较不同浓度PEI的细胞毒性.通过检测荧光素酶活性和细胞活力,评价不同分子量PEI对基因转染的影响及超声辐照的增强作用.结果 当N/P比达到3或更高时,PEI可有效地缩合质粒DNA.细胞毒性与PEI浓度相关.超声辐照均能提高裸质粒和复合物的荧光素酶活性(P<0.05),但前者的增加幅度显著小于后者(P<0.05),25 kDa显著优于750 kDa(P<0.01).适当的转染条件对细胞活力无明显影响.结论 超声辐照联合25 kDaPEI可明显提高基因转染效率,可为基因治疗提供一种高效的新方法.
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比较超声联合阳离子微泡与声诺维介导SDF-1α基因转染梗死心肌的实验研究
目的 通过比较阳离子微泡与声诺维微泡介导SDF-1α基因对兔梗死心肌的转染效率,探讨阳离子微泡对提高基因转染效率的有效性及可行性.方法 建立兔急性心梗模型并分组,A组:MBc+ US组(阳离子微泡+超声辐照组);B组:MBs+ US组(声诺维+超声辐照组);C组:Control组(空白对照组).A、B组于造模成功后24 h进行基因转染,C组不做任何处理.转染后3d处死部分动物,RT-PCR与Western Blot检测各组心肌中目的基因表达情况;转染后4周行超声心动图和心肌超声造影检测,之后处死动物,免疫组织化学检测各组心肌中毛细血管新生效应.结果 转染后3d,A组SDF-1α的mRNA和蛋白表达均明显高于B组(均P＜0.01).转染后4周,A组心肌毛细血管新生效应、心肌血流灌注以及心功能均高于B组(均P＜0.01).结论 阳离子微泡能显著提高基因携带效率,增加体内转染效率,为基因治疗提供了一种简便高效的微泡载体.
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超声靶向微泡破坏技术介导基因JNK1在小鼠肝癌细胞株中表达及对细胞迁移和侵袭作用的研究
目的 探讨应用超声靶向微泡破坏(UTMD)技术介导小鼠肝癌细胞株Hca-P JNK1基因的表达以及肝癌细胞迁移和侵袭.方法 构建并鉴定pCDNA3.1-JNK1载体.将小鼠肝癌细胞株Hca-P分组如下:A组(空白对照组),B组(质粒组),C组(脂质体+质粒组),D组(超声微泡+质粒+超声辐照组),E组(脂质体+超声微泡+质粒+超声辐照组).采用倒置荧光显微镜观察各组细胞的转染率,荧光定量PCR和Western Blot法检测JNK1的基因和蛋白质表达水平,以CCK-8法检测5组细胞的细胞活性,应用Transwell实验检测各组细胞的体外迁移和侵袭能力.结果 成功构建了pCDNA3.1-JNK1载体.各组转染率比较:E组均大于B、C、D组(P均＜0.05),C、D组转染率均高于B组(P均＜0.05),C、D组之间差异无统计学意义(P＞0.05).E组JNK1 mRNA和蛋白表达水平均高于其他各组(P均＜0.05);E组细胞活性、迁移和侵袭能力均高于其他各组(P均＜0.05)结论 UTMD技术结合脂质体转染法可以提高pCDNA3.1-JNK1载体转染小鼠肝癌细胞株Hca-P的效率,加大基因JNK1表达的上调幅度,增强细胞活性、迁移和侵袭能力.
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微囊化转染神经生长因子基因细胞移植在周围神经再生中的作用
目的探讨应用免疫隔离技术进行转染神经生长因子(NGF)基因的3T3细胞移植促进周围神经损伤后再生的可行性.方法采用海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠(APA)微胶囊包埋NGF-3T3细胞并进行培养;制备坐骨神经横断损伤SD大鼠模型,96只SD大鼠随机分A组(微囊化NGF-3T3细胞组)、B组(空胶囊组)、C组(转染NGF的3T3细胞组)和D组(阴性对照组).分别采用神经干动作电位(NAP)、神经传导速度(NCV)和坐骨神经功能指数(SFI)检测坐骨神经功能恢复情况.结果微囊化NGF-3T3细胞培养后保持活性和增殖能力,将具有分化潜能的大鼠嗜铬细胞瘤细胞与其共培养,7 d时细胞胞体分化成多边形或锥形,形成突起;培养10 d左右NGF分泌量高,达269 pg/ml;培育50 d仍然保持在208 pg/ml.移植术后4、8及12周时,A组大鼠的NAP及NCV均大于B、C、D组(P＜0.05),而B、C、D三组之间无显著性差异(P＞0.05);A组大鼠的SFI恢复情况优于B、C、D组(P＜0.05),而B、C、D三组之间无显著性差异(P＞0.05).结论微囊化NGF-3T3细胞在体外培养一定时间后,仍保持增殖能力和生物活性,移植到大鼠周围神经损伤局部后可长时间存活,并通过持续分泌NGF起到促进周围神经修复的作用.
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小鼠胚胎神经干细胞的体外培养及增强型绿色荧光蛋白基因转染研究
目的:探索小鼠胚胎神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的体外培养,探讨NSCs作为基因靶细胞,以及增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)标记NSCs的可行性.方法:胚胎小鼠脑组织分离神经干细胞,无血清细胞培养,免疫细胞荧光染色技术鉴定.NucleofectorTM转染仪将增强型绿色荧光蛋白基因转导入NSCs,用G418筛选,在荧光显微镜下观察并挑选EGFP表达强的克隆,并做免疫荧光鉴定及诱导分化细胞的鉴定.结果:从胚胎小鼠脑组织分离的细胞具有连续克隆能力,表达神经上皮干细胞蛋白,诱导分化后的细胞表达神经细胞和星形胶质细胞特异性的蛋白.增强型绿色荧光蛋白报告基因转染神经干细胞后能高效表达,且不影响其增殖、分化能力.结论:小鼠胚胎神经干细胞能够在体外适宜的条件下进行长期培养;神经干细胞可直接作为基因靶细胞;转染EGFP的神经干细胞表达稳定且对NSCs的增殖和分化无明显影响.
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过表达Bcl-2雪旺细胞抗凋亡能力的实验研究
目的:探讨凋亡相关基因Bcl-2过表达对抗过氧化氢诱导的雪旺细胞凋亡的影响.方法:构建含有人Bcl-2cDNA的逆转录病毒真核表达载体PLXSN,脂质体法将重组质粒转染PA317细胞,G418筛选阳性克隆,鉴定后浓缩收集病毒液,感染人雪旺细胞株系Schwann's cells,采用Western法检测Bcl-2蛋白表达情况.5mM H2O2作用并诱导细胞凋亡后,流式细胞仪检测细胞凋亡发生变化.结果:成功构建出含目的基因Bcl-2的逆转录病毒表达载体pLBcl-2SN.5mM H2O2成功的诱导雪旺细胞凋亡.Bcl-2逆转录病毒感染雪旺细胞后,Bcl-2蛋白水平呈过高表达,并能显著对抗H2O2诱导的雪旺细胞凋亡.结论:Bcl-2蛋白过表达能够抑制氧化剂诱导的雪旺细胞凋亡.
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TPT1基因转染对肝癌细胞系SMMC-7721生物学行为的影响
目的:观察TPT1转染对肝癌细胞系生物学行为的影响.方法:用QIAGEN超纯质粒抽提试剂盒抽提TPT1的真核表达质粒pEGFP-N3TPT1和pEGFP-N3,通过lipofectAMINE,在24 h内连续3次转染肝癌细胞系SMMC-7721,通过荧光显微镜、RT-PCR观察转染、表达效率,通过MTT实验、软琼脂克隆形成实验、细胞周期分析,研究TPT1转染对肝癌细胞系SMMC-7721生物学行为的影响.结果:用此重构体转染后,在荧光显微镜下,可见细胞发出明亮的绿色荧光,转染效率约在30%左右.RT-PCR分析显示,pEGFP-N3 TPT1转染的细胞,TPT1 mRNA水平升高0.78倍(P<0.05).与对照组相比,pEGFP-N3TPT1转染可明显增强肝癌细胞系的增殖能力和软琼脂克隆形成能力(P值均<0.05),使G2+S/M期细胞数增多.结论:pEGFP-N3 TPT1可在肝系细胞内高效表达,TPT1可增强肝癌细胞系SMMC-7721的恶性表型.
关键词： 肝肿瘤/病理学 转染 细胞系 肿瘤 肿瘤蛋白质类/遗传学 -
神经营养因子-3质粒转染失神经肌肉的表达
目的:观察外源性神经营养因子-3(neurotrophin-3,NT-3)基因直接转染失神经肌肉的表达及治疗效果.方法:SD大鼠40只,制成腓肠肌失神经支配模型.实验组术后腓肠肌内注射人NT-3质粒10 μl(1 μg/μl),对照组注射等量生理盐水10 μl/d,不同时间点取材采用免疫组化检测蛋白的表达,并进行肌湿重、肌纤维横截面积和运动终板检测.结果:实验组2d后肌细胞出现外源性NT-3免疫组化染色阳性,7 d时达到高峰,14 d和28 d时有所下降,但与2 d相比,仍维持在较高水平.而对照组免疫组化染色结果为阴性.实验组与对照组检测指标比较差异有显著性.结论:NT-3基因直接转染可在肌细胞内表达蛋白,为失神经肌肉萎缩的基因治疗提供了初步的理论和实验依据.
关键词： 神经营养因子3/遗传学 基因疗法 肌萎缩/治疗 转染 肌/代谢 -
Survivin反义RNA/HSP70双基因表达载体的构建及鉴定
目的:构建Survivin 反义RNA/HSP70双基因表达载体,为后期转染肿瘤细胞,抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡以及激发机体有效的特异性抗肿瘤免疫应答提供重要的实验材料.方法:应用RT-PCR从Jurkat细胞中获得Survivin cDNA片段,反向插入pIRES2-DsRed2质粒载体中,经酶切和测序鉴定所构建的Survivin 反义RNA表达载体是否成功;应用RT-PCR从HepG2细胞中获得的HSP70 cDNA片段,定向插入到pIRES2-DsRed2质粒载体中;经菌落PCR、酶切和测序鉴定所构建的HSP70表达载体是否正确.结果:经酶切和测序鉴定证明Survivin 反义RNA表达载体已成功构建;经菌落PCR、限制性酶切和测序鉴定证明HSP70表达载体已成功构建.结论:本实验已成功构建了Survivin 反义RNA/HSP70双基因表达载体,为进一步研究提供了实验基础.
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聚酰胺-胺型树状高聚物介导短发卡RNA转染小鼠腹膜组织的实验研究
目的 研究聚酰胺-胺型树状高聚物(PAMAM)载体介导pHK-shRNA质粒在小鼠腹膜组织的表达情况.方法 将昆明小鼠随机分为转染组和对照组,分别经腹腔注射PAMAM G9/pHK-shRNA复合物或生理盐水,于24h、48h、96h和168h留取壁层和脏层腹膜组织,在荧光显微镜下观察壁层腹膜绿色荧光蛋白(GFP)的表达,同时采用Western Blot检测脏层腹膜GFP的表达.结果 正常对照组的小鼠腹膜组织未能检测到GFP表达,而PAMAM G9/pHK-shRNA转染组的各时间点均可检测到GFP表达,以48h表达强,显著高于其他各时间点(P＜0.01).Western Blot结果与冰冻组织切片的结果一致.结论 PAMAM载体可介导pHK-shRNA转染正常小鼠的腹膜组织,为进一步体内研究提供实验依据.
关键词： 聚酰胺-胺型树状高聚物 腹膜组织 转染 -
转染人Rb反义寡脱氧核苷酸对骨肉瘤细胞生长的影响
目的从分子水平研究Rb基因对骨肉瘤生长的影响,为骨肉瘤的基因治疗提供依据.方法用脂质体将人工合成的Rb反义寡脱氧核苷酸转入有Rb表达的人成骨肉瘤细胞.免疫组化方法检测肿瘤中Rb蛋白表达,MTT法检测细胞转染前后的增殖情况.同时流式细胞术检测细胞周期.结果转染Rb反义寡核苷酸后肿瘤细胞的Rb蛋白表达明显下降,G1期细胞比例减少,细胞增殖增加.结论转染Rb反义寡核苷酸的细胞,Rb蛋白表达明显降低,并引起肿瘤细胞增殖增加.
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质粒构象对转染后蛋白表达时间曲线的影响
目的 探讨质粒的不同构象下磷酸钙转染后对蛋白表达量时间曲线的影响.方法 经过处理的pcDNA3 - MADCAM -1 - Fc,pcDNA3.1/Hygro(+)- Alpha4,pcDNA3.1/Hygro(+)- Beta7三种质粒磷酸钙转染293T细胞,第一种表达分泌到胞外的蛋白通过收集上清,ProteinA纯化,另外两种表达于细胞外膜,通过流式细胞仪检测荧光强度.结果 pcDNA3 - MADCAM -1 - Fc磷酸钙转染后处理组(缺口开环)比对照组表达蛋白量多(t =5.009,p=0.0376).pcDNA3.1/Hygro(+)- Alpha4,pcDNA3.1/Hygro(+)- Beta7两种质粒共转后处理组荧光强度36h后略高于对照组,48h后对照组明显升高.结论 质粒的不同构象下磷酸钙转染后蛋白表达量有时间依赖性.
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治疗性超声介导体外基因转染的参数优化
目的 探讨不同治疗性超声(TUS)参数对基因转染的作用,优化TUS参数以实现高效率的转染,减少对细胞活力和质粒完整性的影响.方法 将质粒和SonoVue微泡加入培养的Hela细胞后行超声辐照,改变超声强度、占空比以及辐照时间等参数,比较不同的TUS辐照策略对细胞活力及红色荧光蛋白(DsRed)表达效率的影响,以确定佳辐照参数,并对质粒完整性进行分析.结果 低超声强度(0.4 W/cm2、1.0 W/cm2)、低占空比(10%和20%)时,细胞存活率较高(>80%),辐照1 min和3min之间的细胞活力差异不明显(P>0.05).当增加超声强度(1.6 W/cm2、2.2 W/cm2)和占空比(50%)时,细胞活力显著下降(P<0.05).当20%占空比,1.0 W/cm2的TUS辐照3min时,可实现高的转染率.质粒DNA结构的完整性不受优化的TUS参数影响.结论 TUS是一种有效的基因输送方法 ,优化的参数在无显著细胞死亡和DNA损伤的前提下增加转染,这种非侵袭性的基因转染方法 可能是临床基因疗法的一种有用工具.
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体外实验观察微泡-阳离子纳米脂质体合物促进 HGF 基因转染
目的 通过生物素-亲和素的特异结合,制备一种高效载肝细胞生长因子(HGF)基因的脂质微泡(LMB)-阳离子纳米脂质体复合物(LMB-CNLP),观察转染情况,探讨其对对数生长期的肝星状细胞株HSC-T6活性的影响.方法 将HSC-T6细胞分为载HGF基因的LMB组、LMB-CNLP组和对照组(单纯质粒),超声辐照各组进行HGF转染.以荧光显微镜及流式细胞仪观测转染情况,ELISA试剂盒检测HGF蛋白表达情况,流式细胞仪检测HSC-T6细胞凋亡.结果 LMB-CNLP组HGF基因的转染率为41.29％,明显高于其他2组.转染后的细胞能持续表达HGF,且随着HGF蛋白增多,HSC-T6细胞凋亡率增高.结论 超声辐照LMB-CNLP复合物能提高HGF基因在体外培养的HSC-T6细胞中的转染情况,促进HSC-T6凋亡,为基因治疗肝纤维化提供实验依据.
关键词： 脂质微泡-阳离子纳米脂质体复合物 转染 肝细胞生长因子 肝星状细胞 凋亡
