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一种载基因阳离子微泡超声造影剂的制备及特性研究
目的 制备一种新型的阳离子超声造影剂,评价其理化性质,载基因及体内显影能力.方法 采用水浴机械震荡法,加入DC-胆固醇制备一种阳离子脂质微泡;观察其形态、粒径、表面电位等物理特性,并考察平均粒径及浓度在一定条件下随时间变化情况；检测其载基因量,评价其体内显像效果及对细胞的毒性作用. 结果 所制备的阳离子微泡形态规则,稳定性好,马尔文电位仪测得平均表面电位为(29.02±1.30) mV.与普通脂质微泡比较,阳离子微泡载基因量明显增加,大基因结合量达4 μg/108个微泡,大基因结合率为39.2％.对细胞无明显毒性,且体内实验阳离子微泡持续增强兔肝脏显影超过15 min.结论 自制的新型阳离子微泡是一种理想的超声造影剂,并能显著增加基因携带量,可望提高超声靶向微泡破坏技术介导的基因转染效率.
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比较超声联合阳离子微泡与声诺维介导SDF-1α基因转染梗死心肌的实验研究
目的 通过比较阳离子微泡与声诺维微泡介导SDF-1α基因对兔梗死心肌的转染效率,探讨阳离子微泡对提高基因转染效率的有效性及可行性.方法 建立兔急性心梗模型并分组,A组:MBc+ US组(阳离子微泡+超声辐照组);B组:MBs+ US组(声诺维+超声辐照组);C组:Control组(空白对照组).A、B组于造模成功后24 h进行基因转染,C组不做任何处理.转染后3d处死部分动物,RT-PCR与Western Blot检测各组心肌中目的基因表达情况;转染后4周行超声心动图和心肌超声造影检测,之后处死动物,免疫组织化学检测各组心肌中毛细血管新生效应.结果 转染后3d,A组SDF-1α的mRNA和蛋白表达均明显高于B组(均P＜0.01).转染后4周,A组心肌毛细血管新生效应、心肌血流灌注以及心功能均高于B组(均P＜0.01).结论 阳离子微泡能显著提高基因携带效率,增加体内转染效率,为基因治疗提供了一种简便高效的微泡载体.
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纳米级阳离子脂质微泡的制备与评价
目的 制备纳米级阳离子脂质微泡,并评价其理化特性及体内显影效果.方法 选用氨基甲酰基胆固醇(DC-chol)作为微泡阳离子成分,通过薄膜水化法及机械振荡法制备纳米级阳离子脂质微泡,以SonoVue为对照对自制微泡形态分布、平均粒径、表面电荷、浓度进行评测,并观察其在动物体内显影效果.结果 光学显微镜及电子显微镜下微泡分散性好、形态规则呈球形;马尔文电位仪测得平均粒径(442.6±58.75) nm,平均表面电位为+(41.8±10.2)mV,连续观察1周内稳定性好;动物体内显影效果强度略低于SonoVue,但增强持续时间较长.结论 自制纳米级阳离子脂质微泡具有粒径更小、带正电荷可携载基因及体内显影效果良好的特点,具有作为基因载体进行体内转染的巨大潜力.
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中性微泡、阳离子微泡及靶向阳离子微泡携内皮抑素基因经超声转染治疗裸鼠乳腺癌种植瘤的实验研究
目的：研究中性微泡（NMB）、阳离子微泡（CMB）及靶向阳离子微泡（CMB105）携内皮抑素（ES）质粒在超声作用下转染治疗 MDA-MB-231细胞裸鼠种植瘤，观察其对肿瘤模型生长的影响及治疗作用。方法18只裸鼠均注射 MDA-MB-231细胞悬液建立种植瘤模型，随机分为3组（NMB 组、CMB 组及 CMB105组），每组6只。 NMB、CMB 及CMB105携 ES 质粒在超声作用下转染 MDA-MB-231种植瘤，每只裸鼠左侧肿瘤接受治疗，右侧肿瘤为对照。治疗前和治疗后每3 d 观察记录肿瘤生长情况，绘制肿瘤生长曲线；治疗后15 d 处死裸鼠，剥取肿瘤计算抑瘤率，行荧光定量聚合酶链反应和蛋白质免疫印迹法分别检测 Endostatin mRNA 及蛋白表达情况。结果于转染后12 d 开始，CMB 组和 CMB105组治疗侧肿瘤生长均受到抑制。转染后15 d，CMB105组治疗侧抑瘤率为（53.18±5.69）%，明显高于 CMB 组治疗侧[（27.57±3.02）%]和NMB 组治疗侧[（10.63±1.47）%]，差异均有统计学意义（均 P<0.05）。 CMB 组和 CMB105组 ES mRNA及蛋白表达增加，两组比较差异有统计学意义（P<0.01）。结论携载 ES 质粒的 CMB105在超声作用下其抗肿瘤治疗效应明显优于携载 ES 质粒的 CMB 及 NMB，可在一定程度上延缓裸鼠种植瘤生长。
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超声靶向破坏阳离子微泡介导SDF-1α基因转染提高外源性血管新生效应的研究
目的 通过证实超声介导阳离子微泡能显著提高微泡的携基因量及体内转染后的血管新生效应来探讨阳离子微泡作为基因载体的价值.方法 紫外分光光度法检测阳离子微泡与声诺维微泡在体外的基因携带效率.构建兔子急性心肌梗死模型并分组:阳离子微泡组(超声靶向破坏携SDF-1α基因的阳离子微泡并进行转染)、声诺维微泡组(超声靶向破坏携SDF-1α基因的声诺维微泡并进行转染)和对照组(不进行转染).转染后3d后3组各取3只兔子处死,ELISA检测目的基因蛋白表达情况;转染后4周行超声心动图和心肌超声造影,检测兔子心功能及心肌灌注情况,之后全部处死,免疫组化检测心肌血管新生效应.结果 阳离子微泡组基因携带率是声诺维微泡组的11倍.阳离子微泡组SDF-1α蛋白表达是声诺维微泡组的4倍,对照组的9倍.阳离子微泡组在心肌毛细血管新生效应、心肌血流灌注和心功能方面均优于声诺维微泡组和对照组(P＜0.05).结论 阳离子微泡能明显提高在体外的基因携带效率,从而使体内转染效率增强,更好地促进心肌血管新生,是一种高效的基因载体.
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载BDNF基因阳离子超声微泡联合超声靶向微泡破裂技术治疗大鼠急性不完全脊髓损伤的实验研究
目的:探讨超声靶向破裂技术介导载脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)基因阳离子微泡(brain-derived neurotrophic factor-loaded cationic nanobubbles,BDNF/CNBs)治疗大鼠急性不完全脊髓损伤的可行性及效果.方法:96只成年雄性SD大鼠构建急性不完全脊髓损伤模型(Allen法)后随机分为4组:生理盐水(normal saline,NS)组;载BDNF基因阳离子微泡(BDNF/CNBs)组;BDNF基因+超声(brain-derived neurotrophic factor+ ultrasound,BDNF+US)组;载BDNF基因阳离子微泡+超声(BDNF/CNBs+ US)组,每组24只.经大鼠尾静脉注射药物后再按上述分组进行处理,在不同时间点采用HE染色观察脊髓损伤后的病理变化;Nissl染色观察神经元存活及再生情况;TUNEL染色法检测神经元凋亡情况;采用RT-PCR和Western blot检测BDNF基因和蛋白的表达情况;通过倒置荧光显微镜观察偶联绿色荧光蛋白的表达情况;终采用BBB法(Basso,Beattie,and Bresnahan test,BBB)评估大鼠神经功能恢复情况.结果:本实验所制备的BDNF/CNBs阳离子超声微泡的平均粒径为(339.8±210.3) nm,Zeta电位为(24.30±6.24)mV.BDNF/CNBs+ US治疗组能有效减轻脊髓组织损伤,明显增加BDNF基因及BDNF蛋白的表达(0.61±0.10 vs.0.70±0.13 vs.0.83±0.15 vs.1.55±0.19,P=0.000;31.65±1.30 vs.45.62±1.50 vs.49.55±1.20 vs.75.83±2.10,P--0.000);与对照组相比,BDNF/CNBs+US治疗组尼氏小体数量明显增多(51.00±4.95vs.90.80±6.87 vs.99.60±7.50 vs.159.40±8.56,P=0.000),神经元凋亡数明显减少(60.19±1.84 vs.54.97±2.40 vs.36.70±2.23 vs.17.08±1.42,P=0.000);且终促进脊髓损伤后神经功能的恢复,即表现为明显增高的BBB评分(10.10±0.33 vs.10.60±0.43 vs.11.70±0.36 vs.17.20±0.45,P=0.000).结论:载BDNF阳离子超声微泡联合超声靶向微泡破裂治疗能有效地将BDNF基因转染入损伤脊髓组织,并能促进脊髓损伤的功能恢复.以BDNF/CNBs为基础的超声辐照联合基因治疗在治疗脊髓损伤及其他中枢神经系统疾病方面有广阔的应用前景,为脊髓损伤的治疗提供了一种新型、安全的方法.
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阳离子微泡提高超声波靶向击碎微泡技术体内基因靶向转染效率及治疗效果的实验研究
目的 构建一种阳离子微泡(cationic microbubble,CMB),通过与传统微泡(definity microbubble,DMB)比较,探讨其提高超声波靶向击碎微泡(ultrasound-targeted microbubble destruction,UTMD)技术介导的体内基因转染效率及治疗效果.方法 体外实验:应用薄膜水化法制备CMB,观察其形态、测量其粒径、zeta电位以及基因携带能力,以DMB作为对照.体内实验:首先取16只大鼠以生物荧光素酶质粒作为报告基因,分别应用CMB和DMB进行心脏的靶向转染,动态观察转染效率及靶向性.随后取64只大鼠制备心肌缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)模型,第5天彩色超声检查明确60只大鼠成功制备I/R模型;随机分为3组(n=20),其中对照组大鼠接受DMB携带空质粒转染,DMB组接受DMB携带AKT质粒转染,CMB组接受CMB携带AKT质粒转染.治疗后心脏彩色超声以及组织学观测各组大鼠心肌灌注、心脏功能、梗死区面积和梗死区组织厚度;免疫组织化学染色检测毛细血管及小动脉密度,TUNEL染色观察心肌细胞凋亡;Western blot检测心肌AKT、磷酸化AKT (phospho-AKT,P-AKT)、生存素(Survivin)和磷酸化BAD (phospho-BAD,P-BAD)表达.结果 实验制备的CMB形状均一,其zeta电位显著高于DMB(t=28.680,P=0.000);DNA携带百分比显著高于DMB (P＜0.05).无论在体检测还是离体检测均显示,应用CMB转染后的荧光素酶活性均显著高于DMB转染后,差异有统计学意义(P＜0.05).I/R模型术后第5天,各组前、后壁信号强度比值以及心脏射血分数、左室短轴缩短率比较,差异均无统计学意义(P＞0.05);第21天,CMB组及DMB组以上指标较对照组增加,且CMB组高于DMB组,差异均有统计学意义(P＜0.05).术后第21天,CMB组梗死区域长度小、厚度大,其次为DMB组、对照组;CMB组及DMB组毛细血管、小动脉血管密度均较对照组明显增大,CMB组较DMB组增大,组间差异均有统计学意义(P＜0.05).基因转染后第3天,对照组凋亡细胞多,其次为DMB组、CMB组;CMB组及DMB组AKT、P-AKT、Survivin和P-BAD蛋白相对表达量均明显高于对照组,CMB组高于DMB组;组间比较差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 CMB在保留了普通微泡理化性质的同时,显著提高了携带质粒DNA的能力,提高了超声微泡靶向转染效率;应用CMB进行超声靶向AKT基因转染治疗大鼠心肌I/R损伤时,显著提高了基因转染率,改善了大鼠心脏功能.
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超声微泡联合核定位信号促进SDF-1a基因转染治疗兔心肌梗死
目的 探讨超声辐照下携基质衍生因子1(SDF-1α)基因的胞膜核膜双靶向阳离子微泡载体系统促进内源性干细胞归巢的机制.方法 构建双靶向阳离子微泡载体系统及携SDF-1a阳离子微泡载体系统,分别于体外转染人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)并检测SDF-1α质粒入胞率、入核率及SDF-1a基因表达;进而构建心梗兔模型,造模成功后随机分为三组进行SDF-1a基因转染:A组:携SDF 1α双靶向阳离子微泡载体组;B组:携SDF-1α阳离子微泡载体组;C组:对照组.分别于基因转染后3天和4周后检测SDF-1α基因表达、干细胞标志物和血管新生效应.结果体外实验中,超声辐照下,与携SDF-1α阳离子微泡载体系统比较,携SDF-1α双靶向阳离子微泡载体系统SDF-1α质粒入胞率与其无显著差异(P＞0.05),但入核率和SDF-1α蛋白表达显著增高(P＜0.01);体内实验显示,与阳离子微泡载体组及对照组比较,双靶向阳离子微泡载体组家兔心肌组织中SDF-1α蛋白显著增高、干细胞标志物阳性染色显著增强、毛细血管密度显著增加(P＜0.01).结论 超声辐照下携SDF-1a的胞膜核膜双靶向阳离子微泡载体系统能有效提高SDF-1α基因载体转染效率,表达足量的SDF-1α蛋白并发挥其干细胞诱导剂作用,从而促进内源性干细胞归巢并促进局部血管新生.
