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稳定表达膜结合型CD40配体CHO细胞系的建立和鉴定
目的 建立稳定表达膜结合型 CD40 配体 (CD40L) 的CHO 细胞系.方法 将编码膜结合型 CD40L 的重组质粒 pcDNA3.1-fCD40L 用 BgI Ⅱ和 Xho Ⅰ酶进行双酶切鉴定.电穿孔法向 CHO 细胞转染该重组质粒,G418 筛选抗性克隆,有限稀释法获取单克隆阳性细胞后扩大培养,获得 2 个整合了 fCD40L 基因的 CHO 细胞 (CHO-fCD40L) 克隆.用RT-PCR、流式细胞仪分别从 RNA 和蛋白质水平对 2 个CHO-fCD40L 克隆细胞中膜结合型 CD40L 的表达进行检测;ELISA 法检测 2 个 CHO-fCD40L 克隆细胞培养上清液中可溶性 CD40L (sCD40L) 的含量.结果 重组质粒pcDNA3.1-fCD40L 经双酶切和电泳检测到符合预期大小的基因片段.该重组质粒转染 CHO 细胞后经克隆化培养获得 2 个CHO-fCD40L 克隆,分别命名为C10、E11.RT-PCR 检测显示 C10、E11 细胞中有膜结合型 CD40L mRNA 的转录;流式细胞仪检测显示 C10、Ell 细胞表达 CD40L 蛋白达 90% 以上;ELISA 法检测到显示 C10、E11 细胞培养液上清中有 sCD40L 蛋白表达.结论 成功获得稳定表达膜结合型 CD40L 的 CHO 细胞系,为比较膜结合型 CD40L 与 sCD40L 的生物学功能奠定了良好基础.
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TCRVβ7.1基因修饰的T细胞对肝癌细胞体外杀伤及体内靶向识别作用的研究
目的 探讨 TCRVβ7.1基因修饰的T细胞对肝癌细胞的体外杀伤活性及其在体内靶向识别肝癌细胞的作用.方法 ①体外实验:以特异性识别肝癌细胞的TCRVβ7.1基因转染健康人外周血单个核细胞(PBMC),转染前和转染后24、48 h用流式细胞术检测转染基因的表达.将人肝癌 BEL-7402 细胞分为4组,其中3组分别与未经修饰的PBMC(PBMC组)、转染pcDNA3.1空质粒的PBMC(空质粒组)、转染TCRVβ7.1基因的PBMC(基因修饰组)共培养,1组作为阴性对照组.共培养前和共培养24、48 h,以噻唑蓝(MTT)法检测PBMC对人肝癌BEL-7402细胞的杀伤活性.②体内实验:用重度联合免疫缺陷小鼠建立荷肝癌动物模型,于肿瘤周围皮下注射基因修饰的PBMC,于注射后2、7、14、28、42d 各处死2只小鼠,分别取肿瘤、脾、肝、肺、肠、卵巢、心、脑、肾组织,检测基因修饰的 PBMC 在小鼠体内的存活时间及组织分布情况.结果 ①体外实验:流式细胞术检测表明TCRVβ7.1基因成功转染到T细胞并得到有效表达.MTT法检测显示,基因修饰组T细胞对肿瘤细胞的杀伤率(24、48 h分别为31.24%±2.26%、40.95%±3.45%)明显高于PBMC组(分别为6.92%±3.12%、7.84%±2.29%)和空质粒组(分别为9.23%±2.46%、10.36%±3.34%),差异均有统计学意义(P＜0.01).②体内实验:肿瘤周围注射基因修饰的PBMC后2d,小鼠肿瘤组织已经出现PBMC(8个/视野),随时间延长PBMC数量呈上升趋势,28d达大值(18个/视野).取材于不同时间的小鼠组织标本的检测显示,基因修饰的PBMC只分布于肿瘤组织,而在其他组织中没有出现.结论 TCRVβ7.1基因修饰可诱导T细胞活化并提高T细胞对肝癌细胞的杀伤活性;外源性TCRVβ7.1基因修饰T细胞在荷肝癌小鼠体内的分布具有肿瘤靶向性.
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小RNA转染人外周血原代T淋巴细胞的转染试剂筛选
目的探讨人工合成 RNA转染人外周血原代 T淋巴细胞的有效方法。方法从人外周血分离原代 T淋巴细胞，采用 Lipofectamine 2000、Lipofectamine RNAiMAX、FuGENE6、Hiperfect和 EntransterTM-R 5种不同转染试剂介导荧光标记的 RNA转染原代 T淋巴细胞，通过荧光显微镜观察及流式细胞术检测进行转染效率评价。结果分离的人外周血原代 T淋巴细胞的纯度达到87.4%。采用上述5种转染试剂介导荧光标记的 RNA转染 T淋巴细胞，24 h后转染效率分别为（14.81±1.03）%、（14.33±1.24）%、（2.10±0.16）%、（1.69±0.08）%、（72.24±1.26）%。采用 EntransterTM-R转染100及50 nmol/L对照 RNA，24 h后转染效率分别为73.7%和56.0%；EntransterTM-R转染100 nmol/L对照 RNA后48、72 h荧光标记细胞阳性率分别为62.0%、56.6%。结论转染试剂 EntransterTM-R可有效介导人工合成 RNA转染人外周血原代 T淋巴细胞。
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NDRG1基因与乳腺癌转移的关系及其转染对乳腺癌细胞株增殖及侵袭力的影响
目的探讨NDRG1基因与乳腺癌转移的关系及其转染对乳腺癌细胞株增殖及侵袭力的影响.方法免疫组织化学SP法、即时荧光定量逆转录聚合酶链反应(real time RT-PCR)检测10例新鲜乳腺浸润性导管癌和27例石蜡包埋乳腺癌组织中NDRG1蛋白和mRNA的表达.脂质体介导NDRG1基因瞬时转染高侵袭高转移性人乳腺癌细胞株MDA-MB-231;用5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)掺入法、流式细胞术观察NDRG1基因转染后对细胞增殖和细胞周期的影响;细胞体外侵袭实验和迁移实验观察转染后细胞侵袭和迁移能力的变化.结果NDRG1蛋白和mRNA表达分别为:无转移的乳腺癌组织阳性率为100%(14/14)和0.82±0.14,而有转移的乳腺癌组织中为69.2%(9/13)和0.17±0.11,均明显降低;对两株细胞的检测中,高侵袭高转移的MDA-MB-231细胞株中NDRG1mRNA的表达水平(0.14±0.02)明显低于低侵袭低转移的MCF7细胞株(1.51±0.11).NDRG1基因瞬时转染MDA-MB-231细胞后,与未转染组和pEGFP-N3组相比,pEGFP-NDRG1-N3转染组中,细胞BrdU掺入率降低,细胞周期Go/G1期比例增高,S期比例明显减低;同时细胞体外侵袭能力下降,而体外迁移能力则差异无统计学意义.结论NDRG1基因的表达与乳腺癌的转移呈负相关关系,提示该基因可望成为早期预测乳腺癌转移的分子生物学标记物之一;NDRG1基因通过脂质体转染高侵袭高转移性人乳腺癌MDA-MB-231细胞株,可抑制肿瘤细胞增殖、降低其侵袭能力,提示其可作为一个候选的肿瘤转移抑制基因,并有望成为乳腺癌基因治疗的新的候选基因.
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BRAF 野生型及 BRAFV600 E 突变型的黑色素瘤细胞中 Mps1基因对 BRAF WT／MEK／ERK 通路的影响
目的：研究野生型BRAF及突变型BRAFV600E背景下Mps1激酶对BRAFWT／MEK／ERK通路的影响。方法（1）在BRAF野生型背景的黑色素瘤细胞中单独或联合转染pBabe－puro－GST－BRAF－WT／pBabe－puro－GST－BRAFV600E、pBabe－puro－GFP－Mps1－WT 及空载体，应用 Western blot方法来检测 Mps1及 p－ERK 表达水平。（2）用 pSUPER－Mps1反转录病毒感染 BRAF 野生型及BRAFV600E突变型背景黑色素瘤细胞，敲低内源性Mps1，Western blot法检测Mps1及p－ERK表达水平。（3）在BRAFV600E突变型背景的黑色素瘤细胞中转染pBabe－puro－GFP－Mps1，Western blot法检测Mps1及p－ERK表达水平。结果（1）在BRAF野生型背景的黑色素瘤细胞中转染pBabe－puro－GST－BRAF－WT及pBabe－puro－GFP－Mps1－WT，与未处理组及转染空载体组相比，p－ERK水平显著降低（ P＜0．01）；在BRAF野生型背景的黑色素瘤细胞中转染pBabe－puro－GST－BRAFV600E及pBabe－puro－GFP－Mps1－WT，与未处理组及转染空载体组相比，p－ERK表达水平未发生明显变化。（2）在BRAF野生型背景的黑色素瘤细胞中敲低内源性Mps1后，与对照组相比p－ERK含量增多；而在BRAFV600E突变型黑色素瘤细胞中敲低内源性Mps1后，与对照组相比p－ERK含量未发生明显变化。（3）转染Mps1的BRAFV600E突变型细胞中 p－ERK 水平较对照组及空载体组没有发生显著变化。结论Mps1激酶和BRAFWT／MEK／ERK通路之间存在一条自动调节的负反馈回路，而癌基因BRAFV600E表现出对该负反馈回路的抵抗作用。
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Calponin-1基因SiRNA重组腺病毒载体构建及转染子宫平滑肌细胞
我们曾采用高通量的基因芯片技术结合蛋白质组学技术,获得了人类自然临产与未临产子宫体部与子宫下段的关异基因表达谱和差异性蛋白表达谱,为子宫收缩相关药物靶点的选择提供了理论基础[1]
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Kail/CD82基因转染对结肠癌细胞株LoVo生物学特性的影响
目的探讨Kail/CD82对LoVo细胞株生长、黏附、分离与侵袭能力的影响.方法转染Kail cDNA,建立稳定Kail表达克隆株.采用体外实验的方法,绘制转染细胞与对照细胞的生长曲线,并检测其黏附、聚集、分离与侵袭能力,对比有无差别. 结果与对照细胞相比,转染对LoVo细胞的生长无明显影响;震荡10、20、30、40 min时,转染细胞与空白对照细胞的黏附细胞数(×105)分别为0.08、0.63、0.83、0.91和0.04、0.48、0.71、0.82,其中震荡20、30与40 min时二者差异有显著性(P<0.05);震荡5、10、15 min时,转染细胞与空白对照细胞的脱落率分别为13%、20%、53%和11%、28%、60%,其中震荡10与15 min时二者的差异有统计学意义(P<0.05);5 h的温和震荡后,转染细胞的聚集体形成率较空白对照细胞为高(64.8%和58.6%,P<0.05);1 d共培养后,转染细胞穿过内皮细胞的数目较空白对照细胞的少(6.33/视野和17.67/视野,P<0.05);总之,转染可以增强细胞的黏附与聚集能力,降低其分离与侵袭能力. 结论 Kail/CD82对结肠癌细胞的转移力具有抑制作用.
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Tiam1对结直肠癌细胞生物学特性的影响
目的探讨Tiam1(T lymphoma invasion and metastasis)对结直肠癌细胞株生物学特性的影响.方法用逆转录聚合酶链反应方法检测Tiam1基因在结直肠癌细胞株中的表达,筛选Tiam1不表达的细胞株;将Tiam1/C1199HA cDNA导入内源性不表达Tiam1基因的人结直肠癌HT29细胞株中,G418筛选抗性克隆,免疫组织化学和Western 蛋白印迹法鉴定转染后Tiam1基因在细胞中的表达,利用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测Tiam1对细胞增殖的影响,体外侵袭实验检测Tiam1对结直肠癌侵袭转移的影响.结果 Tiam1基因在高转移的LoVo和SW620中高表达,在低转移的HT29中不表达,在SW480和HCT116细胞表达相应较低.通过7 d的连续比较,HT29/mock和HT29/ Tiam1两组的细胞增殖能力差异有统计学意义(F=10.512,P=0.003).Tiam1基因的导入使结直肠癌细胞的增殖能力明显增强,体外侵袭转移能力显著增加,HT29/ Tiam1穿过细胞为(88.6±9.2)个/200倍视野,HT29/mock为(46.8±3.4)个/200倍视野,二者的差异具有统计学意义(t=9.54,P<0.01).结论 Tiam1基因具有促进结直肠癌细胞增殖的能力,Tiam1与结直肠癌的侵袭转移密切相关,Tiam1表达可作为结直肠癌侵袭转移过程中一个有价值的指标.
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体外转染KISS-1基因对食管鳞癌细胞EC-1侵袭及增殖能力的影响
目的 观察KISS-1基因对食管鳞癌细胞EC-1侵袭及增殖能力的影响,探讨KISS-1基因与食管鳞癌生物学行为的关系.方法 检测KISS-1在EC-1、Eca109、EC9706和TE-1四种食管癌细胞株中的表达;利用脂质体介导在体外将KISS-1基因转染人食管鳞癌细胞EC-1,利用Western blot和RT-PCR方法检测转染之后KISS-1表达的改变,并采用Boyden小室体外侵袭实验及MTT、软琼脂克隆形成实验,观察KISS-1对食管鳞癌细胞侵袭及增殖能力的影响.结果 4种食管癌细胞株的Western blot和RT-PCR检测结果显示:EC-1中KISS-1蛋白(0.715±0.109)及mRNA(0.670±0.176)表达均低;转染之后Western blot和RT-PCR结果显示:KISSS-1蛋白和mRNA在转基因组的表达分别为1.143±0.218和0.877±0.162,均显著高于转空质粒组(0.745±0.130,0.685±0.128;t=3.850,2.481,P均<0.05)和对照组EC-1细胞(0.855±0.184,0.677±0.138;t=2.275,2.306,P均<0.05);Boyden小室检测细胞体外侵袭力实验发现转基因组在培养24、48和72 h后的穿膜细胞数分别为91.8±11.7,117.8±11.1和139.2±11.8,均显著低于转空质粒组(118.1±14.7,141.7±13.2,162.2±22.7;t=3.153,4.215,3.569,P值均<0.01)和对照组EC-1细胞(112.2±15.6,138.1±13.0,162.3±14.0;t=4.154,3.797,2.702,P值均<0.05).MTT检测结果显示,转基因组细胞在培养48 h和72 h后的增殖能力分别为0.517±0.127和0.394±0.137,与转空质粒组(0.636±0.186,0.513±0.150;t=2.054,2.709,P值均<0.05)和对照组(0.646±0.135,0.511±0.153;t=2.276,2.205,P值均<0.05)相比,细胞生长受到明显抑制;克隆形成实验结果显示,转基因组细胞的克隆形成数为157.2±36.4,明显低于转空质粒组(236.3±78.1;t=3.441,P<0.01)和对照组(242.5±48.6;t=2.250,P<0.05).结论 KISS-1基因在食管癌细胞株EC-1中可抑制细胞的体外侵袭能力及细胞的增殖能力.
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PC-1基因表达诱导NIH3T3细胞恶性转化
目的通过建立稳定表达外源PC-1基因的小鼠成纤维细胞株,初步探讨PC-1基因表达对肿瘤发生、发展的影响. 方法通过脂质体介导的方法,将真核表达载体pcDNA3.1(-)/myc-his-pc-1稳定转染NIH3T3细胞,之后利用PCR、逆转录PCR(RT-PCR)技术,确定外源PC-1基因在靶细胞染色体上的整合及在转录水平的表达.通过细胞形态学分析、MTT实验、细胞周期分析、软琼脂集落形成和裸鼠成瘤实验,观察PC-1基因表达对NIH3T3生物学特性的影响.结果建立了稳定转染PC-1基因的NIH3T3细胞株.PC-1基因表达的小鼠成纤维细胞 NIH3T3生长速度加快,在软琼脂上生长并形成集落,接种裸鼠后可成瘤(6/6).结论 PC-1基因在NIH3T3细胞中稳定表达具有诱导正常NIH3T3细胞发生恶性转化的重要生物功能.
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Bcl-2过表达抑制乙醇诱导的HCC-9204肝癌细胞凋亡
目的探讨凋亡相关基因bcl-2过表达对乙醇诱导的肝细胞癌(HCC)细胞凋亡的影响.方法将含有人bcl-2 cDNA的逆转录病毒表达载体pDOR-SB质粒转染到不表达bcl-2蛋白的人肝癌细胞系HCC-9204细胞中,用免疫组织化学ABC法检测bcl-2蛋白的表达情况.连续克隆化直至获得100%表达bcl-2蛋白的单克隆细胞株,并进行流式细胞术检测.用6%乙醇分别作用于上述细胞6 h后,用MTT法和TUNEL法和流式细胞仪检测细胞凋亡发生程度.结果转染pDOR-SB的细胞大部分为bcl-2蛋白表达阳性,而转染pDOR空载体或未转染的HCC-9204细胞均为bcl-2蛋白阴性.连续3次克隆化后,流式细胞检测表明所获得的单克隆细胞株100%稳定表达bcl-2蛋白,命名为HCC-bcl-2.6%乙醇作用后,HCC-bcl-2细胞和未转染的HCC-9204细胞经MTT法检测的吸光度值分别为0.519±0.053和0.366±0.046,前者明显高于后者(P<0.01);TUNEL指数分别为0.387和0.613,亚二倍体凋亡峰比例分别为3.8%和10.7%,前者均明显低于后者(P<0.05).结论 bcl-2蛋白过表达能够抑制乙醇诱导的HCC-9204肝癌细胞凋亡.
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DPC4基因转染对结肠癌细胞生长的抑制作用及其作用机制
目的研究DPC4基因转染对结肠癌细胞生长及p21WAF1 mRNA表达的影响.方法构建pcDNA3.1-DPC4真核表达质粒,利用脂质体转染技术将pcDNA3.1质粒和pcDNA3.1-DPC4质粒分别导入结肠癌细胞系SW620;采用免疫细胞化学和Western蛋白印迹检测细胞中DPC4基因的表达;通过检测细胞生长曲线、克隆形成实验研究DPC4基因转染对SW620细胞生长的抑制作用.通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组细胞内p21WAF1 mRNA的表达.结果转染DPC4基因后,在SW620细胞中可检测到高表达的DPC4蛋白;细胞生长倍增时间(74 h)明显延长;细胞克隆形成率(21%)明显降低.DPC4基因转染后SW620细胞p21WAF1mRNA含量增加.结论 DPC4基因的高表达能够抑制结肠癌细胞的生长,DPC4基因可能通过诱导p21WAF1基因的表达而抑制结肠癌细胞的生长.
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野生型PTEN转染对胶质母细胞瘤基因表达的影响
目的研究野生型PTEN对胶质母细胞瘤基因表达的影响及意义.方法用表达野生型PTEN的载体转染PTEN失活的胶质母细胞瘤细胞系U87MG,筛选出稳定表达野生型PTEN的细胞克隆,然后用cDNA微阵列技术找出野生型PTEN转染后mRNA表达改变的基因.结果转染的野生型PTEN可以明显抑制U87MG肿瘤细胞的增殖.用cDNA微阵列技术分析后,共有89个cDNA克隆在PTEN转染细胞与对照组细胞之间差异有显著性(P＜0.01).其中,76个为已知基因,包括胶质纤维酸性蛋白、p21/WAF1、转化生长因子β诱导的早期蛋白、 DNA碎裂因子45等;13个为未知基因.结论野生型PTEN可以影响多种基因的表达,从而调控胶质母细胞瘤细胞的增殖、分化、凋亡等过程.
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转染结缔组织生长因子基因的大鼠肾系膜细胞纤连蛋白和Ⅳ型胶原表达的改变
目的 观察大鼠肾系膜细胞(MsC)转染结缔组织生长因子(CTGF)基因转染阳性细胞克隆中纤连蛋白(FN)和Ⅳ型胶原(ColⅣ)表达的改变,探讨CTGF在肾小球硬化发生中的作用.方法 经脂质体介导将含有CTGF的重组表达质粒转染至大鼠MsC,用G418筛选及Western blot和半定量逆转录聚合酶链反应作鉴定;检测阳性克隆FN、Col Ⅳ蛋白及其mRNA表达的改变.结果 成功建立高表达CTGF的阳性MsC克隆(MCT-1,2),并证实其与对照组相比,阳性MsC克隆FN、ColⅣ的表达均有上调,其FN蛋白及其mRNA表达分别增高2.9倍和3.2倍,Col Ⅳ蛋白和mRNA表达分别增高为2.4倍和3.8倍.结论 CTGF可促进MsC的FN、Col Ⅳ的表达,表明其在肾小球硬化发生中起促进作用.
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醛糖还原酶对大鼠肾脏系膜细胞表达纤连蛋白和Ⅳ型胶原蛋白的影响
目的探讨醛糖还原酶(AR)对大鼠肾脏系膜细胞(MsC) 表达细胞外基质成分纤连蛋白(FN)和Ⅳ型胶原(Col Ⅳ)蛋白的影响,以及AR在肾小球硬化病变过程中的可能作用及其机制.方法采用酶切、连接方法构建真核表达质粒pCDNA3-AR,采用脂质体介导以及G418筛选的方法,将pCDNA3-AR稳定转染至MsC中,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western印迹法和免疫荧光检测转染MsC表达AR情况; 以Western 印迹法检测正常MsC、AR转基因MsC、应用AR抑制剂Sorbinil和Zopolrestat的正常MsC、转化生长因子-β1(TGF-β1)作用后的正常MsC的FN和Col Ⅳ蛋白表达情况. 结果与正常MsC相比,TGF-β1作用后的正常MsC FN和Col Ⅳ蛋白表达水平分别增高1.6和1.7倍(P<0.01);AR转基因MsC的FN、Col Ⅳ表达分别增加1.8倍和1.5倍;应用Sorbinil时,FN和ColⅣ分别降低1.8倍和1.4倍(P<0.05);应用Zopolrestat时,FN和Col Ⅳ分别降低1.7倍和1.4倍(P<0.05).结论 AR高表达或活性受抑制时可以明显影响MsC FN、ColⅣ的蛋白表达,提示AR可能与肾小球硬化的病理过程有关.
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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3对端粒酶活性的影响
目的研究丙型肝炎病毒非结构区3(HCV NS3)蛋白对端粒酶活性的影响,以探讨HCV NS3蛋白在HCV致癌中的作用,并观察端粒酶活性原位检测法的应用价值.方法利用HCV NS3真核细胞表达质粒pRcHCNS3-5′(表达HCV NS3 N端多肽),pRcHCNS3-3′(表达HCV NS3C端多肽)和空白质粒pRcCMV转染NIH3T3细胞,分别获得11、11和8个阳性克隆;采用链霉素抗生物素-过氧化物酶法(SP)免疫组织化学方法检测转染的NIH3T3细胞中HCV NS3蛋白表达,并通过端粒酶活性原位检测法和端粒酶聚合酶链反应(PCR)酶联免疫吸附反应(ELISA)技术分别检测转染前后NIH3T3细胞端粒酶活性的定位和定量变化.结果 HCV NS3表达质粒pRcHCNS3-5′或pRcHCNS3-3′转染的NIH3T3细胞均表达HCV NS3蛋白,HCV NS3蛋白阳性信号均位于细胞质中,并以前者表达的阳性信号为强(χ2=6.667,P<0.05),各组细胞端粒酶活性存在显著差异(F=143.083,P<0.01),其中质粒pRcHCNS3-5′转染的NIH3T3细胞端粒酶活性强,11个克隆均呈阳性,质粒pRcHCNS3-3′转染的细胞次之(P<0.05),空白质粒pRcCMV转染细胞和未转染NIH3T3细胞弱;HCV NS3蛋白的表达水平和端粒酶活性强度之间具有显著相关性(rs=0.808 4,P<0.01);采用端粒酶活性原位检测方法和端粒酶PCR ELISA技术检测结果具有较好的一致性(rs=0.501 96,P<0.01).结论 (1) HCV NS3蛋白可能是通过内源性机制激活细胞端粒酶导致宿主细胞恶性转化;(2) HCV NS3蛋白 N端多肽对宿主细胞端粒酶的激活作用强于C端多肽;(3) 进一步证实端粒酶活性原位检测法是一种适合于病理形态与功能研究的技术.
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转染Smad7基因的大鼠肾系膜细胞基质金属蛋白酶2及其组织抑制因子2表达的改变
目的通过对大鼠肾小球系膜细胞(mesangial cell,MsC)转染Smad 7基因,观察转染阳性细胞克隆基质金属蛋白酶2(MMP-2)及其组织抑制因子2(TIMP-2)表达的改变,以进一步阐明Smad 7阻断肾组织纤维化过程的作用机制.方法经脂质体介导将含有Smad 7重组表达质粒转染大鼠MsC,用G418筛选及Western印迹分析、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法鉴定;又分别采用Western印迹分析、酶谱分析法和RT-PCR法,检测转染阳性细胞克隆MMP-2和TIMP-2表达改变.结果成功建立高表达Smad 7的阳性MsC克隆(S-22,S-26),并证实其MMP-2蛋白分泌和酶活性均明显升高,而TIMP-2 mRNA及其蛋白的表达则被明显抑制.阳性MsC克隆S-22,S-26细胞分泌MMP-2比对照组高约3.8倍(P<0.01);S-22与S-26细胞TIMP-2蛋白表达约为对照组48%(P<0.05).结论 Smad 7可能通过增强肾组织内MMP-2酶活性和抑制TIMP-2的生成而起到减轻肾组织纤维化进展的作用.
关键词： 转染 明胶酶A 金属蛋白酶2组织抑制剂 肾小球膜 DNA结合蛋白质类 -
转染Smad 2基因的大鼠肾系膜细胞纤连蛋白和Ⅳ型胶原表达的改变
目的通过对大鼠肾小球系膜细胞(MsC)转染Smad 2基因,观察转染的阳性细胞克隆纤连蛋白(FN)及Ⅳ型胶原(ColⅣ)表达的改变,以探讨转化生长因子β(TGF-β)/Smad信号转导通路引起细胞外基质积聚导致肾小球硬化发生的分子机制.方法经磷酸钙介导将含有Smad 2重组表达质粒转染大鼠MsC,用G418筛选及Western印迹分析法鉴定,又分别采用Western印迹分析法和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染阳性细胞克隆FN及ColⅣ表达的改变.结果成功建立高表达Smad 2蛋白的阳性MsC克隆(T-12、T-31、T-35、T-40),并证实其FN及ColⅣ的mRNA和蛋白的表达水平均明显上调.阳性MsC克隆FN蛋白为对照组2.4倍(P<0.05),mRNA为对照组的2.7倍(P<0.05);阳性MsC克隆ColⅣ蛋白为对照组2.9 倍(P<0.01);mRNA为对照组的3.3倍(P<0.01 ). 结论 TGF-β/Smad信号转导途径中的Smad 2可能是促进FN及ColⅣ在肾小球中积聚,是导致肾小球硬化发生的重要信号转导分子.
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人肿瘤转移抑制基因1转染对人乳腺癌细胞MDA-MB-231体外生物学行为的影响
目的 研究人肿瘤转移抑制基因1(TMSG-1)转染引起人乳腺癌细胞MDA-MB-231体外生物学行为的改变及对肿瘤转移表型的影响.方法 构建TMSG-1全长编码序列真核表达载体,稳定转染人乳腺癌MDA-MB-231细胞系,G418筛选挑取TMSG-1过表达阳性克隆.通过MTT比色实验、软琼脂集落形成实验检测体外细胞生长能力;Matrigel穿膜实验检测肿瘤细胞体外侵袭能力.TMSG-1瞬时转染24、48 h,分别用Annexin-Ⅴ碘化丙啶(PI)双标流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡情况.结果 从稳定转染TMSG-1的MDA-MB-231细胞中挑取3个TMSG-1-FLAG融合蛋白表达量较高的阳性克隆株用于下游生物学行为实验.MTT比色实验及软琼脂集落形成实验结果显示,TMSG-1正义转染各组(S1、S2、S3)细胞增殖速度及克隆形成数与未转染组及转染空载体组相比均明显减低(P＜0.05);Matrigel穿膜实验显示,正义转染各组的穿膜细胞数[(72.3±8.1)个、(85.0±4.2)个、(73.5±7.8)个]与未转染组[(187.5±2.1)个]和转染空载体组[(162.3±6.8)个]相比均明显减少(P＜0.01).TMSG-1瞬时转染MDA-MB-231细胞,转染24和48 h均可引起细胞凋亡率的增加(P＜0.05).结论 TMSG-1表达上调可使人乳腺癌细胞MDA-MB-231体外生长速度、锚着不依赖性生长能力及侵袭能力明显降低,细胞凋亡增加.该实验为TMSG-1是一个新发现的肿瘤转移抑制基因提供了证据.
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转染抗mdr-1核酶基因逆转肿瘤细胞耐药性的研究
目的研究转染抗mdr-1核酶基因能否实现对乳腺癌细胞多药耐药(MDR)的持久逆转.方法构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因的核酶表达质粒并转染耐阿霉素的人乳腺癌细胞株MCF-7/ADR和敏感株MCF-7,激光共聚焦显微镜观察EGFP的表达,流式细胞术检测细胞转染率和P-糖蛋白含量,逆转录(RT)-聚合酶链反应(PCR)检测细胞的mdr1 mRNA,罗丹明123(Rh123)外排实验检测细胞的P-糖蛋白转运功能.加入阿霉素48 h后,常规MTT法检测细胞存活率.结果转染抗mdr-1核酶质粒RZ196和RZ179后,两组实验细胞的mdr-1指数由2.20分别降为0.76和1.40,P-糖蛋白表达率由55.0%降为4.6%和18.2%,Rh123荧光强度由22.0%升为46.2%和70.1%,细胞存活率由75%降为28%和43%.并且核酶质粒可在细胞内稳定表达,转染RZ196、RZ179的实验细胞经G418筛选完成2个月后,细胞质中仍可见明显的EGFP表达,细胞的mdr-1指数分别为0.81、4.17,P-糖蛋白表达率分别为5.2%、19.5%,Rh123荧光强度分别为51.4%、71.6%,与刚完成筛选时的差异无显著性(P>0.05).结论转染抗mdr-1核酶质粒RZ196和RZ179均可持久逆转肿瘤细胞MDR,其中RZ196的逆转效果更好.
