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PSMB5基因G322A突变及硼替佐米耐药的JurkatB细胞与其亲本细胞蛋白质表达谱的差异研究
本研究旨在探讨具有PSMB5基因G322A突变且对蛋白酶体抑制剂硼替佐米耐药的T淋巴母细胞淋巴瘤/白血病细胞系JurkatB与亲本Jurkat细胞的细胞生物学特性和蛋白质表达的差异,确认JurkatB5(硼替佐米筛选终浓度500 nmol/L)及JurkatB8(筛选终浓度800 nmol/L)细胞对硼替佐米的耐药性和对常规化疗药物的敏感性.采用台盼蓝拒染活细胞计数绘制生长曲线,应用软琼脂培养法观察细胞集落形成率,用流式细胞术行细胞周期分析,实时荧光定量RT-PCR检测多药耐药相关基因MDR1、LRP、MRP mRNA表达,采用含有720个蛋白抗体的Spri-ngBio抗体芯片检测细胞株间蛋白质表达差异.结果表明,JurkatB5和JurkatB8细胞与亲本Jurkat细胞相比,对硼替佐米48小时耐药倍数分别为33.52,39.04.48小时化疗药物杀伤实验表明,JurkatB5和JurkatB8细胞对柔红霉素、阿霉素、长春新碱、依托泊甙均无交叉耐药,耐药细胞株与亲本Jurkat细胞的增殖、集落形成和细胞周期分布差异无统计学意义(p>0.05).JurkatB5细胞与Jurkat细胞MDR1、LRP、MRP基因mRNA表达无显著差异(p>0.05).蛋白芯片杂交信号扫描共有264个可分析表达点,252个蛋白在3个细胞株中表达无明显差异(2倍以内),其中包括与多药耐药相关的15个蛋白.在JurkatB5或JurkatB8中较Jurkat细胞表达升高或降低2倍以上的蛋白共12个(细胞分裂周期蛋白34、细胞分裂周期蛋白37、CD34 Ⅱ型蛋白、基质金属蛋白酶-2、细胞黏合素、高尔基体复合物、内皮蛋白、组蛋白去乙酰化酶1、穿孔蛋白、促乳蛋白、维甲酸受体β、整合蛋白β1),但未发现在JurkatB5和JurkatB8中较Jurkat细胞中表达同时升高或降低2倍以上的蛋白.结论:具有PSMBS基因G322A突变且对硼佐米耐药的细胞株JurkatB与亲本Jurkat细胞相比较其常规细胞生物学特性无显著改变,无多药耐药表型及多药耐药相关基因的过表达.突变细胞株中大部分已知与耐药有关的蛋白与肿瘤细胞生长、增殖、凋亡、恶性程度、侵袭性相关蛋白表达与亲本细胞中的表达相比较均无显著差异.
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Calponin-1基因SiRNA重组腺病毒载体构建及转染子宫平滑肌细胞
我们曾采用高通量的基因芯片技术结合蛋白质组学技术,获得了人类自然临产与未临产子宫体部与子宫下段的关异基因表达谱和差异性蛋白表达谱,为子宫收缩相关药物靶点的选择提供了理论基础[1]
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胰腺癌分子标志物表达谱的研究进展
肿瘤的发生和发展是多基因参与的复杂生物学过程.从总体水平鉴定细胞癌变过程中异常变化的基因/蛋白质群,有助于全面认识肿瘤的生物学行为,同时也为寻找到有价值的肿瘤早期诊断标志物和治疗分子靶标开辟了新的途径.本文对近年来有关胰腺癌基因/蛋白表达谱的研究作一综述.
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子宫肌瘤组织差异蛋白表达谱的研究
由于从基因水平研究机体并不能完全阐明机体动态的变化,蛋白质组学应运而生.蛋白质组是指基因组所表达的全套蛋白质,其实质是从蛋白水平研究认识生命活动和疾病发生的分子水平机制.双向凝胶电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)作为蛋白质组学研究的核心技术之一,能从复杂的细胞内混合物中将成千上万个蛋白分离显示出来[1].我们建立并优化用于子宫肌瘤的2-DE技术,通过比较子宫肌瘤和周围正常肌层组织的蛋白表达谱差异,以探讨子宫肌瘤蛋白质的整体变化规律,为研究子宫肌瘤的发病机制和特异性标志蛋白提供基础.
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肿瘤标志蛋白质组学研究及展望
蛋白质组学的概念早由澳大利亚学者Wilkins和Williams于1994年提出,其从整体水平对特定时间和环境下组织或细胞的蛋白构成进行高通量研究.特异性的蛋白标志对于早期肿瘤的诊断具有重要的临床应用价值,蛋白质组学技术可以在总体上比较肿瘤样本(组织、体液和细胞株)和非肿瘤样品的蛋白表达谱差异,为新的肿瘤标志的发现提供有力的工具.
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鼠疫耶尔森菌201株和201△pCD1株蛋白表达谱比较研究
目的：分析缺失编码Ⅲ型分泌系统的大质粒pCD1对鼠疫耶尔森菌蛋白质表达谱的影响，探索鼠疫菌的潜在致病机制，为鼠疫疫苗研制提供新线索。方法通过双向电泳与质谱分析相结合的方法，比较鼠疫菌在26℃和37℃不同培养温度下，全菌蛋白表达谱差异，鉴定差异蛋白并对其功能进行初步分析。结果成功分离并鉴定了鼠疫菌201株和201△pCD1缺失突变株中的差异蛋白，其中26℃条件下鉴定到24个差异蛋白，37℃条件下鉴定到25个差异蛋白，内含7个由pCD1质粒编码的蛋白。结论通过比较蛋白质组学研究，发现大质粒pCD1缺失后，多种染色体编码蛋白的丰度发生了显著变化，暗示大质粒能调控染色体编码基因的表达。
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几种不同提取方法对Hela细胞总蛋白双向电泳结果的影响
目的 比较几种不同的提取方法对Hela细胞总蛋白双向电泳图谱的影响.方法 采用反复冻融裂解法、超声加冰浴裂解法、室温振摇及试剂盒纯化法提取Hela细胞总蛋白,进行双向凝胶电泳(2-DE).以7 cm pH 3-10NL固相pH梯度胶条做一向等电聚焦,上样量为300 μg,SDS-PAGE做二向垂直电泳,改进的胶体考马斯亮蓝染色,ImageMaster 2D Platinum软件分析电泳图谱.结果 反复冻融裂解法得到的2-DE图谱条纹很多,蛋白点数较少(400±);超声加冰浴裂解和室温振摇法得到的2-DE图谱横向条纹明显减少,蛋白点数明显增加(分别为700±和800±);进一步用试剂盒纯化法得到的2-DE图谱基本上没有蛋白拖尾现象,且加Destreak试剂后蛋白点数有所增加(由800±→900±),但纯化的同时有低丰度蛋白的丢失.结论 超声加冰浴裂解和室温振摇法处理细胞,可得到条纹较少、蛋白点数较多较全的2-DE图谱;进一步用蛋白纯化试剂盒和Destreak试剂纯化样品能更好地解决碱性端的横向拖尾,得到较多的蛋白点.
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肾阳虚证血浆蛋白质表达谱的研究
目的 观察肾阳虚证血浆蛋白质表达谱的变化,为肾阳虚证的客观化研究提供依据.方法 分别选取典型的肾阳虚证5例、正常健康人6例纳入研究,以抗体芯片分析2组人群血浆蛋白质表达谱的差异.结果 肾阳虚证组与正常对照组之间存在差异表达上调的蛋白共14条,其中与生长发育生殖能力相关的为Src蛋白酪氨酸激酶(Csk)、卷曲蛋白1和4(FZD-1,FZD-4)、脑源性神经营养因子(BDNF)、激活素A受体ⅡA型(ActRⅡA)、骨形态发生蛋白-5(BMP-5)、潜在转化生长因子β结合蛋白1(LTBP-1)、成纤维细胞生长因子样受体1(FGFRL1),与免疫系统相关的为CXC趋化因子受体3(CXCR3)、白细胞介素27受体α(IL-27Rα)、脂多糖结合蛋白(LBP)、白细胞介素13受体Ⅱα(IL-13Rα2)、集落刺激因子-1(CSF-1)、血小板内皮细胞黏附分子1(PECAM-1)、ActRⅡA.结论 肾阳虚证血浆蛋白质表达谱的变化涉及生长发育生殖能力、免疫应答、细胞凋亡等,与中医肾阳虚证所表现的腰膝痠软、耳鸣耳聋、发脱齿松、性欲减退等症状相符.
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用蛋白质组学技术探讨补肾生精法对老龄大鼠睾丸生精功能影响的机制
目的:应用蛋白质组学技术研究补肾生精法对老龄大鼠睾丸生精功能影响的机制.方法:20只22月龄老龄雄性SD大鼠随机分为2组,每组10只,分别为老龄组(SC)和补肾生精组(KT).KT组灌胃给药补肾生精颗粒,连续用药60d.取附睾尾精子应用精子运动CASA分析技术,研究补肾生精法对衰老大鼠精子运动能力的影响.应用流式细胞仪检测技术,观察补肾生精颗粒对老龄大鼠睾丸生殖细胞凋亡率的影响.取大鼠右侧睾丸,应用双向凝胶电泳分析老龄组和补肾生精组大鼠睾丸表达差异蛋白.结果:与老龄组相比,补肾生精组大鼠精子密度明显增加(P<0.05):活动率和直线活动率显著上升(P<0.001);补肾生精组生殖细胞凋亡率明显下降(P<0.05).与老龄组相比,补肾生精组大鼠睾丸中有7种蛋白表达发生了显著变化,其中4种蛋白表达上调,3种下调.对7种差异表达蛋白点胶内酶切后进行质谱分析,其中5种蛋白分别鉴定为磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP),热休克蛋白8(HSP7C),磷酸丙糖异构酶(Triose-phosphateisomerase,TPIS),3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH),谷胱苷肽转移酶1(GSTMl-1).结论:补肾生精法对老龄大鼠睾丸功能具有提高精子运动能力及减少其生殖细胞凋亡的作用.运用蛋白质组学技术,研究补肾生精法对衰老过程睾丸蛋白表达的影响,有助于在蛋白质组水平阐释中医肾主生殖,延缓睾丸衰老,改善睾丸生精功能的机制.
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隐睾小鼠与正常成年小鼠睾丸蛋白表达谱的差异分析
为使精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)在体外大量扩增,需要阐明SSCs自增殖机制.为筛选SSCs自增殖相关因子,探索SSCs自增殖机制,本研究选取10日龄昆明乳鼠行隐睾手术,术后35d分别取小鼠两侧睾丸.组织学分析结果显示,实验性隐睾中生殖细胞的分化停滞在精母细胞阶段,且只有少量的精母细胞出现,精原细胞的比例高于正常成年雄性小鼠(45日龄).应用双向凝胶电泳分析隐睾小鼠与正常成年小鼠睾丸差异表达蛋白.结果显示,与正常成年小鼠相比,隐睾小鼠睾丸中有9种蛋白表达发生了显著变化,其中6种蛋白表达下调,3种上调.对9种差异表达蛋白点胶内酶切后进行质谱分析,其中4种蛋白分别鉴定为磷脂酰乙醇胺结合蛋白1(phosphatidylethanolamine-binding protein1,PEBP1),HES-related basic helix-loop-helix protein (HERP),Stathmin蛋白和一种未命名蛋白.本研究通过制作有效的隐睾动物模型,运用蛋白组学的技术方法,成功筛选并鉴定了4种隐睾相关蛋白,有助于探讨SSCs自增殖及隐睾引起雄性不育的机制.
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滋阴清热方对阴虚内热证型系统性红斑狼疮患者外周血单一核细胞蛋白表达谱的影响
目的:观察滋阴清热方对SLE阴虚内热证患者外周血单一核细胞(PBMC)蛋白表达谱的影响.方法:用滋阴清热含药血清与阴虚内热型SLE患者的PBMC共孵育,用表面增强激光解析电离-飞行时间-质谱(SELDI-TOF-MS)检测检测孵育后PBMC蛋白表达谱.结果:滋阴清热含药血清和空白对照比较,3个蛋白峰表达有统计学差异；滋阴清热含药血清和大鼠空白血清比较,1个蛋白峰表达有统计学差异.结论:滋阴清热含药血清对阴虚内热证型系统性红斑狼疮患者外周血单一核细胞蛋白表达谱的具有影响,SELDI-TOF-MS是寻找SLE患者PBMC表达差异蛋白的有效方法,结果对SLE研究具有积极意义.
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SHR高血压进程中肾脏蛋白表达谱的变化
目的 探讨SHR大鼠在高血压发展进程中,肾脏蛋白表达谱的变化.方法 将SHR随机分为3组:18、24和32周龄,每组各6只,相同周龄的WKY作为对照,两周尾动脉测一次血压,肾脏组织蛋白提取、纯化后做双向电泳分析,图谱经PDQuest软件分析后得到的差异蛋白点用串联飞行时间质谱仪(MALDI-TOF/TOF MS)分析鉴定.Western blot测定肾脏铜锌超氧化物歧化酶、过氧化物酶2蛋白的表达.结果 SHR从6周开始血压持续上升,20周后血压值稳定.双向电泳显示,存在11个差异确定蛋白,其中5个变化蛋白涉及氧化应激方面,分别是NADH脱氢酶[辅酶]黄素蛋白2、过氧化物酶2、铜锌超氧化物歧化酶、谷胱甘肽硫转移酶ω-1、肝再生相关蛋白LRRG07.SHR随着周龄的增加,铜锌超氧化物歧化酶和肝再生相关蛋白LRRG07降低,谷胱甘肽硫转移酶ω-1在18周时就基本消失,而过氧化物酶2及NADH脱氢酶[辅酶]黄素蛋白先下降后上升.存在两个变化蛋白涉及细胞凋亡方面,分别是谷胱甘肽硫转移酶ω-1和α-B晶状体.SHR中α-B晶状体随着周龄的增加,先增加后保持一致.存在3个变化蛋白涉及能量代谢方面,分别是H+ATP运输合酶、V型质子ATP酶亚基E1和ATP合酶(α亚基).SHR在3个不同周龄都是先升高后下降.二氢喋啶还原酶涉及生物蝶呤代谢,而3-羟基蒽醌3,4-双加氧酶参与喹啉酸自环化,随着周龄的增加,SHR中二氢喋啶还原酶下降.Western blot显示SHR肾脏中铜锌超氧化物歧化酶的含量均呈不断下降状态,而过氧化物酶2是先下降后上升.结论 在高血压的进程,我们推测所引起的肾脏损伤与氧化应激、细胞凋亡、生物蝶呤代谢和能量代谢有关.体内调节其相关物质可使高血压恢复到一个动态平衡之中,为不同时期治疗高血压肾损伤提供了一个新的思路.
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食管鳞状上皮癌中表达失调蛋白的研究
背景与目的:食管鳞状上皮癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是一种具有高发性和高死亡率疾病,本研究应用蛋白质组学方法分析 ESCC中异常表达的蛋白.方法:对 ESCC/癌旁组织标本的冰冻切片进行显微切割,分别分离肿瘤细胞和癌旁上皮细胞,提取细胞总蛋白,通过双相电泳得到 ESCC及癌旁上皮的蛋白表达谱,采用质谱技术鉴定肿瘤表达异常的蛋白.结果:比较 7对食管癌 /癌旁组织的蛋白表达谱,并对差异的蛋白进行质谱分析发现:11个蛋白在食管癌中表达明显异常,其中热休克蛋白 27(HSP27)在 3例 ESCC中表达上调,钙依赖磷脂结合蛋白 ANNEXIN I在正常食管粘膜存在分子量基本相同、等电点彼此相差约为 1的 3种变体(isoforms),3种 ANNEXIN I变体均在 5例食管癌中表达下调.结论:双相电泳连接质谱的蛋白质组学方法是快速筛选肿瘤异常表达蛋白的有效手段,HSP27和 ANNEXIN I的表达失调是食管癌发生过程中的频发事件.
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大鼠空白血清对阴虚内热型SLE患者外周血单核细胞蛋白质表达谱的影响
目的:在蛋白表达谱水平探讨大鼠空白血清作为含药血清空白对照的价值.方法:收集SLE阴虚内热证患者外周血单核细胞,分为实验组和对照组,实验组按孵化液量的20%加入大鼠空白血清,对照组按孵化液量的20%加入RPMI 1640培养液,收集孵化后细胞进行PMBC的蛋白表达谱检测.结果:实验组和对照组比较,外周血单核细胞的32个蛋白峰表达有差异,其中11个蛋白峰表达有统计学差异;建立了质荷比(m/z)为7027、5270、2908、4128、2311Da模式来判别大鼠空白血清和对照之间的差别.应用生物信息学方法分析7027Da模式蛋白,可知其对应的蛋白为HLADRB1,相应的基因为HLADRB1.结论:大鼠空白血清本身对SLE阴虚内热证患者外周血单核细胞具有明确的调节作用,因此分析含药血清作用时应考虑到此作用.
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氯化两面针碱对肝癌细胞蛋白表达谱的影响研究
目的 通过分析氯化两面针碱(NC)对体外培养肝癌细胞蛋白表达谱的影响,探讨其对肝癌细胞抑制的作用机制.方法 应用蛋白芯片飞行时间质谱技术测定NC作用前后肝癌细胞蛋白的表达谱,在蛋白质专家网站(ExPASy)上进行比对,采用单因素方差分析比较不同组中相同质荷比的蛋白质含量,对处理前后的质谱变化进行配对t检验分析.结果 采用NC处理人肝癌细胞SMMC-7721后,应用蛋白芯片飞行时间质谱技术共筛选出有统计学意义的差异表达蛋白质峰14个,这些差异蛋白主要跟细胞凋亡、细胞周期、信号转导、转录、DNA复制及修复、代谢、免疫等通路有关.结论 氯化两面针碱对肝癌细胞的抑制作用,可能是通过免疫、代谢等多条通路综合作用的结果.
关键词： 氯化两面针碱 肝癌细胞 SELDI-TOF-MS技术 蛋白表达谱 -
红芪多糖对老年性痴呆细胞模型损伤保护作用的差异蛋白质研究
目的:研究红芪多糖对Aβ1-42诱导的AD细胞模型保护作用及差异蛋白质的影响.方法:采用Aβ1-42建立AD细胞模型,HRP作用48h后,收集细胞,提取细胞总蛋白.采用双向电泳方法建立SH-SY5Y细胞的蛋白表达谱,银染后扫描凝胶获得蛋白图谱.使用PD Quest软件分析找出模型组和HRP处理组间的差异蛋白点,计算差异蛋白的等电点和理论分子量,对差异明显的蛋白点进行质谱鉴定.采用生物信息学方法对鉴定成功的蛋白质进行蛋白-蛋白相互作用网络分析.结果:建立了SH-SY5Y神经细胞的双向电泳蛋白表达谱.差异分析结果显示,模型组与HRP处理组间有22个差异蛋白点.应用质谱方法成功鉴定了4个差异蛋白质,分别为胆碱激酶a、Rag调节蛋白复合体LAMTOR1、转录因子蛋白AP-2-δ和铁蛋白,且Rag调节蛋白复合体LAMTOR1与铁蛋白存在相互作用关系.结论:红芪多糖对AD细胞模型的保护作用与其能够调节胆碱激酶a、Rag调节蛋白复合体LAM-TOR1、转录因子蛋白AP-2-delta和铁蛋白的表达密切相关.
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红芪多糖对人肺腺癌A549细胞蛋白表达图谱影响的研究
目的:研究红芪多糖(Hedysari Radix polysaccharide,HRP)对人肺腺癌A549细胞蛋白双向电泳图谱的影响.方法:以300μg／ml红芪多糖体外作用于A549细胞后提取细胞总蛋白,使用丙酮沉淀法和2-DE Cleanup Kit对蛋白进行纯化.采用双向凝胶电泳分离纯化后的细胞总蛋白,银染显色并扫描凝胶图片,使用PDQuest 8.0图像分析软件对不同处理组双向凝胶电泳图谱进行对比分析,筛选出差异蛋白点,并分析差异蛋白的理论等电点和分子量.结果:应用双向电泳方法建立了A549细胞分辨率较高和重复性较好的蛋白表达图谱.红芪多糖处理可使A549细胞2-DE图谱中35个蛋白点发生明显变化,其中24个表达上调,8个表达下调,3个仅在对照组中表达,并分析得出了35个蛋白点的理论等电点和分子量.结论:红芪多糖可使人肺腺癌蛋白表达图谱发生明显改变,应用蛋白质组学筛选出的35差异蛋白点可能是红芪多糖抑制人肺腺癌A549细胞增殖及凋亡的关键调控蛋白质.
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Cpne5蛋白在新生及成年小鼠各组织及其在不同胎龄胎鼠脑组织中的表达
目的:检测小鼠Cpne5蛋白在脑发育过程及不同组织中的表达水平,为Cpne5基因的功能研究提供线索.方法:提取新生、成年小鼠多种组织蛋白及11.5,12.5,13.5,14.5,15.5,17.5 d胎鼠脑组织蛋白,用免疫印迹法检测Cpne5蛋白表达量.结果:Cpne5蛋白表达于新生4d小鼠的全部受检组织,大、小脑表达量少,眼和肺的表达量高.成年小鼠检测结果相似,Cpne5蛋白的组织分布广泛,但脑组织含量低,表达量以卵巢、睾丸为高,其次为肺和心脏.胎脑的Cpne5蛋白表达量在胎鼠11.5、12.5 d较高,13.5 d降低,14.5至17.5 d再次升高,出生后又降低.结论:Cpne5蛋白在新生和成年小鼠广泛表达于各种受检组织,脑组织表达量低;小鼠胎脑发育过程中Cpne5蛋白表达呈现先高后低,再升高再降低的变化趋势.
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纳升级反相液相色谱串联质谱法分析海马蛋白质组
目的:为了全面了解海龙的蛋白质成分,对其蛋白表达谱进行蛋白质组学分析.方法:应用三氯乙酸/丙酮沉淀法提取海马药材的蛋白质,经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离分析,将聚丙烯酰胺凝胶电泳条带切下进行胶内酶解处理后,应用纳升级反相液相色谱串联质谱(nanoRPLC-MS/MS)法系统分析海马提取蛋白质胶内酶解产物,并进行数据库检索鉴定蛋白质.结果:共鉴定到海马蛋白192种,等电点范围为4.06～12.18,相对分子质量范围为3.06×103～3.52×106,多肽10 680个;通过生物信息学方法分析了海马提取蛋白质的分子功能.得到海马提取物中的蛋白质具有结合、酶催化、肌动、ATP酶等功能活性,其中结合活性的蛋白质占的比例较大.结论:本研究建立了海马的蛋白质表迭谱,可为海马药材中蛋白质的深入研究奠定基础,对海马药材有效成分的分析和海马药材鉴别具有重要意义.
