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Balb/c 3T3细胞体外转化实验及其在环境致癌物检测上的应用
Balb/c 3T3细胞体外转化实验是利用Balb/c 3T3细胞在体外培养的环境下,模拟致癌物在动物体内致瘤过程进行致癌物筛选的一种技术,它的检测终点是正常细胞转化为恶性细胞时获得的恶性表型.本文就其方法的发展和改进,以及其在肿瘤启动剂和促癌剂检测上的应用进行了综述.
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3T3细胞光毒替代实验的建立及在化妆品评价中的应用
目的 通过建立3T3中性红成纤维细胞光毒替代实验,研究体外替代方法替代动物实验及在化妆品安全性评价中取代动物光毒性实验的可行性.方法 选用24种已知光毒性化学物质(15种阳性、9种阴性)和20种待检特殊用途化妆品,测量Bal/c3T3细胞经化学物质和紫外线照射联合作用后的平均光效应强度和光刺激因子,与整体动物皮肤光毒性结果比较.结果 3T3体外替代实验对24种已知光毒性化学物质检测结果为14种阳性和10种阴性,20种化妆品为阴性,经校正χ2检验与既往光毒性结果比较,差异无统计学意义.结论 本次研究成功建立了3T3中性红成纤维细胞光毒替代实验方法,该方法可取代豚鼠皮肤光毒性实验对化妆品终产品进行安全性评价.
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PC-1基因表达诱导NIH3T3细胞恶性转化
目的通过建立稳定表达外源PC-1基因的小鼠成纤维细胞株,初步探讨PC-1基因表达对肿瘤发生、发展的影响. 方法通过脂质体介导的方法,将真核表达载体pcDNA3.1(-)/myc-his-pc-1稳定转染NIH3T3细胞,之后利用PCR、逆转录PCR(RT-PCR)技术,确定外源PC-1基因在靶细胞染色体上的整合及在转录水平的表达.通过细胞形态学分析、MTT实验、细胞周期分析、软琼脂集落形成和裸鼠成瘤实验,观察PC-1基因表达对NIH3T3生物学特性的影响.结果建立了稳定转染PC-1基因的NIH3T3细胞株.PC-1基因表达的小鼠成纤维细胞 NIH3T3生长速度加快,在软琼脂上生长并形成集落,接种裸鼠后可成瘤(6/6).结论 PC-1基因在NIH3T3细胞中稳定表达具有诱导正常NIH3T3细胞发生恶性转化的重要生物功能.
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人趋化素样因子2对小鼠成纤维细胞BALB/c 3T3的促增殖和凋亡抑制作用
目的探讨人趋化素样因子2(CKLF2)对小鼠成纤维细胞BALB/c 3T3增殖和凋亡的影响. 方法构建pcDI/CKLF2真核表达载体;建立稳定表达人CKLF2的BALB/c 3T3(3T3/CKLF2)细胞系;以细胞计数和MTT法分析过表达人CKLF2后对3T3细胞增殖的影响;以流式细胞术检测annexin-Ⅴ阳性细胞为凋亡指标,分析3T3/CKLF2细胞和3T3/pcDI细胞对撤除血清诱导凋亡的反应情况. 结果成功地建立了稳定表达人CKLF2的BALB/c 3T3细胞系,过量表达人CKLF2的3T3细胞系增殖速度明显加快,同等接种量的细胞培养40 h以后,3T3/CKLF2细胞的数量(1.07×106)比3T3/pcDI细胞(2.54×105)及野生型3T3细胞(3.0×105)高2～3倍;流式细胞术分析表明,撤除血清后3T3/CKLF2的annexin-Ⅴ阳性细胞数(13.34%/48 h、15.44%/96 h)明显低于3T3/pcDI细胞(19.36%/48 h、39.2%/96 h). 结论人CKLF2能够促进BALB/c 3T3细胞的增殖和抵抗撤除血清诱导的细胞凋亡,这些研究为进一步探讨CKLF家族的生物学功能提供了实验依据.
关键词： 人趋化素样因子(CKLF2) 增殖 凋亡 3T3细胞 -
APA-3T3细胞微囊的深低温保存
目的:通过优选冻存液的成份和浓度,建立低温保存APA微囊化小鼠成纤维细胞(3T3细胞)的方法.方法:用海藻酸钙-多聚赖氨酸-海藻酸钙微囊(APA)包裹3T3细胞制成APA-3T3细胞微囊.以高糖DMEM培养液为基础冻存液,分别加入不同浓度的二甲基亚砜(DMSO)或牛血清白蛋白(BSA).分别将不同的冻存液加入APA-3T3中.按程序控制降温梯度,置于液氮中保存.快速复温后,光镜下观察APA-3T3的形态、细胞活率及膜通透性.结果:①10%DMSO组的微囊内细胞活率降低少,细胞活率达(75.68±1.54)%,P＜0.01.微囊完好率达到(94.48±0.90)%,P＜0.01.②与其它组相比,4%BSA组的微囊内细胞活率降低程度小,活率达(73±1.26)%,P＜0.01.微囊完好率高,为(85.1±0.82)%,P＜0.01.③加入不同成份和浓度的冻存液对微囊的通透性没有明显影响.结论:在冻存液中加入10%DMSO和4%BSA,可在低温保存的过程中较好地保护细胞的存活及微囊的完整性.
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类胰岛素样生长因子1对3T3-L1前脂肪细胞增殖、分化的作用
目的:证实类胰岛素样生长因子1对3T3-L1前脂肪细胞增殖、分化的作用,并摸索该细胞因子对3T3-L1前脂肪细胞增殖、分化作用的佳质量浓度.方法:实验于2004-03/2004-07 在辽宁医学院科学实验中心完成.实验材料:小鼠胚胎3T3-L1前脂肪细胞株由ATCC提供,购于上海中科院生命科学院;类胰岛素样生长因子1购于美国Biological公司.实验方法:对照组为标准的高糖DMEM培养基,实验组为含有1,5,10,20,50,100μg/L类胰岛素样生长因子1的高糖DMEM培养基.用含体积分数为0.1胎牛血清的高糖DMEM培养基在37℃、体积分数为0.05 CO2的孵箱内培养3T3-L1前脂肪细胞,每48 h换液1次.实验评估:在倒置显微镜下观察类胰岛素样生长因子1作用前后3T3-L1前脂肪细胞的生长情况及形态学改变.待细胞铺满瓶底后,应用流式细胞仪检测细胞周期,应用噻唑蓝法测定3T3-L1前脂肪细胞增殖率:增殖率=实验组A值/对照组A值×100%,采用油红O染色提取法测定3T3-L1前脂肪细胞内脂肪含量增长率:增长率=实验组B值/对照组B值×100%.结果:①倒置显微镜下观察分化前3T3-L1前脂肪细胞呈梭形,胞浆内无脂滴,分化后3T3-L1前脂细胞呈圆形,胞浆内含有大量的脂滴,脂滴聚集于核周,被油红O染成橙红色,形成"戒环"样的形态.②噻唑蓝法检测结果和油红O染色提取法检测结果均显示,不同质量浓度类胰岛素样生长因子1对3T3-L1前脂肪细胞增殖、分化的作用,与空白对照组相比差异显著[培养1 d:(1.18±0.02)%,(1.29±0.01)%,(1.35±0.03)%,(1.47±0.04)%,(1.46±0.03)%,(1.47±0.05)%,(1.00±0.01)%;培养2 d:(1.40±0.03)%,(1.56±0.04)%,(1.67-+0.02)%,(1.82±0.05)%,(1.81±0.02)%,(1.82±0.09)%,(1.00±0.01)%,P＜0.05],20μg/L类胰岛素样生长因子1对3T3-L1前脂肪细胞增殖、分化的作用为明显(P=0.038 2);流式细胞仪分析结果与噻唑蓝法及油红O染色提取法基本一致.结论:体外细胞培养实验表明,类胰岛素样生长因子1对3T3-L1前脂肪细胞的增殖、分化有明显促进作用,其促进作用与质量浓度并非正比,而是达到一定的质量浓度后,其促进作用不再增加,而这个质量浓度接近本实验的佳质量浓度值,即20μg/L.
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核心结合因子α1基因转染NIH3T3成纤维细胞成骨表型转化
目的:观察细胞因子诱导成骨的共同信号分子核心结合因子α1基因转染NIH3T3成纤维细胞,其成骨表型转变的可能性.方法:实验于2003-10/2004-10在解放军第三军医大学新桥医院骨科中心实验室完成.采用脂质体转染技术行核心结合因子α1基因转染NIH3T3成纤维细胞,成骨标志基因Ⅰ型胶原、骨钙素、骨唾液蛋白、碱性磷酸酶、核心结合因子α1 mRNA的表达采用反转录-聚合酶链反应检测,骨钙素的表达采用免疫细胞化学染色检测,Cbfa蛋白的表达采用Westernblot检测.结果:①NIH3T3成纤维细胞经核心结合因子α1基因转染后出现骨钙素、骨唾液蛋白、碱性磷酸酶的表达,Ⅰ型胶原表达增强,说明在转录水平有成骨标志基因的表达.②免疫细胞化学染色检测到了骨钙素的表达,显示NIH3T3细胞已发展为成骨细胞.③Westernblot检测到了核心结合因子α1蛋白的表达,证实了成纤维细胞发生了表型的改变.结论:核心结合因子α1基因转移NIH3T3成纤维细胞改变了成纤维细胞向成骨表型转化,增加了成骨细胞数量,使成骨能力增强成为可能.
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抗G418小鼠胚胎干细胞饲养层的制备
目的:建立具有G418抗性的3T3细胞系,用于转染pTet-on基因的ES阳性克隆筛选的饲养层.方法:通过脂质体转染的方法,将含有neo基因的质粒pWL/neo导入3T3细胞中,利用G418的药物选择特性,对转染细胞进行压力筛选,并对其进行PCR鉴定.结果:经500μg/ml的G418压力筛选后,获得了抗G418细胞克隆.抗性3T3细胞的形态和生长速度与正常3T3细胞没有差异,用特异性核苷酸引物检测抗性细胞基因组DNA,可以扩增出对应的核苷酸片段,Southern blot鉴定结果表明neo基因片段已整合入G418抗生3T3细胞中.结论:成功地培育了G418抗性的3T3细胞,为进行pTet-on基因转染ES细胞的阳性细胞克隆筛选奠定了基础.
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hIGF-1基因转染对成纤维细胞增殖的影响
目的:探讨人胰岛素样生长因子1(hIGF-1)基因转染对成纤维细胞增殖的影响.方法:用脂质体转染法将pcDNA3.1-hIGF-1质粒转染鼠成纤维细胞NIH3T3,经G418筛选抗性NIH3T3细胞并继续培养4周,进行原位杂交和免疫细胞化学检测hIGF-1的表达,MTT方法和流式细胞仪检测NIH3T3细胞增殖能力.结果:转染pcDNA3.1-hIGF-1后的NIH3T3细胞内有大量hIGF-1 mRNA和蛋白质的表达;MTT检测显示转染pcDNA3.1-hIGF-1的NIH3T3细胞光吸收值增大,与未转染的NIH3T3细胞组比较,差异具有显著性(P＜0.01);流式细胞仪检测显示转染组细胞,S期比例增加(59.3%),G1期比例减少(27.2%).结论:pcDNA3.1-hIGF-1质粒转染成纤维细胞后,可以获得稳定表达,并能明显促进成纤维细胞的增殖.
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重组人表皮生长因子生物活性检测方法的建立及与其他显色方法的比较
目的 建立重组人表皮生长因子(recombinant human epidermal growth factor,rhEGF)生物学活性的检测方法,并与其他4种常见显色方法进行比较.方法 参考《中国药典》三部(2015版)附录3528中3T3细胞/MTT显色法,建立rhEGF生物学活性的检测方法,去除细胞饥饿的步骤,并用10％ SDS代替DMSO,同时对培养3T3细胞的PRIM 1640培养液的胎牛血清浓度(0、2％、5％、10％)进行优化.采用优化方法及药典方法同时检测rhEGF标准品,对灵敏度、信噪比、线性及孔间变异度进行比较.分别采用优化方法、MTS显色法、CCK-8显色法、结晶紫显色法、CellTiter-Glo显色法检测同批rhEGF供试品,比较各方法的检测结果.结果 优化方法的灵敏度(半数有效浓度为2.84 IU/mL)、信噪比(1.40)、线性(R2＞0.99)和孔间变异度(95％可信区间为1.576％ ～3.334％)均优于药典方法,且实验周期由6d缩短为5d.5种显色方法对rhEGF供试品的检测结果差异无统计学意义(P＞0.05),CCK-8显色法检测结果的变异系数(CV)小(16.8％),结晶紫显色法的CV值大(23.3％).结论 优化方法更适用于rhEGF制品的常规生物学活性检测,且与其他4种显色方法等效.
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红景天苷对3T3-L1脂肪细胞糖代谢及细胞分化的影响
目的:观察红景天苷对脂肪细胞糖代谢和细胞分化的影响,分析其改善糖代谢的可能机制.方法:检测红景天苷干预的脂肪细胞对 3H-葡萄糖的摄取,对红景天苷干预分化的细胞进行油红O染色后通过比色法分析脂肪细胞分化程度.逆转录多聚酶联反应(RT-PCR)检测脂肪细胞分化相关基因过氧化物体增殖剂活化受体-γ(PPAR-γ)、CAAT/增强子结合蛋白-α(C/EBP-α) mRNA的表达. 结果:红景天苷组葡萄糖摄取率为110.4%,明显高于正常对照组 (P<0.01);红景天苷明显抑制细胞分化及PPAR-γ、C/EBP-α mRNA表达,与对照组比较,P<0.01.结论:红景天苷促进3H-葡萄糖摄取,可抑制脂肪细胞分化,下调分化相关基因的表达.
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人垂体瘤转化基因1对NIH3T3细胞无直接肿瘤转化作用
目的克隆人垂体瘤转化基因1(hPTTG1)cDNA并确定其在不同细胞内的分布和其在体外是否具有直接的肿瘤转化作用.方法 (1)用快速扩增(RACE)克隆hPTTG1 cDNA;(2)用Northern印迹检测hPTTG1 mRNA在肿瘤细胞的表达水平;(3)构建pCMX-GFP-hPTTG1表达质粒并转染HeLa等6种细胞,用荧光共聚焦显微镜观察GFP-hPTTG1的细胞内分布;(4)构建pIRESneo-hPTTG1表达质粒并转染NIH3T3细胞,经G418选择后检测hPTTG1是否有直接的致肿瘤作用.结果(1)hPTTG1与大鼠PTTG的同源性为79%.开放可读框架由609bp组成,编码202个氨基酸;(2)hPTTG1在血液系统肿瘤细胞表达水平较其它肿瘤细胞为高,其表达水平由强到弱依次为THP-1,Raji,CEM,AR230,DLD-1,H1299,HeLa,HepG2和A549肿瘤细胞;(3)hPTTG1的细胞内分布在HeLa、Cos-7和DU145细胞主要位于细胞核,在A549、DLD-1和NIH3T3细胞则呈胞浆和胞核的弥漫性分布;(4)hPTTG1明显抑制NIH3T3细胞的生长,降低[3H]胸腺嘧啶脱氧核苷的掺入率.hPTTG1单独不具有细胞肿瘤转化作用.结论 (1)hPTTG1在血液系统肿瘤细胞表达水平较其它肿瘤细胞为高;(2)hPTTG1的细胞内分布与细胞类型有关;(3)hPTTG1单独不具有细胞肿瘤转化作用.
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小鼠过氧化物酶体增殖体激活受体γ2重组逆转录病毒载体在NIH3T3细胞中的表达
目的通过应用重组逆转录病毒介导小鼠过氧化物酶体增殖体激活受体γ2(mPPARγ2)基因整合入MH3T3细胞基因组中并进行表达.方法从经测序证实含正确序列mPPARγ2的重组质粒pcDNA3/mPPARγ2中,双酶切下约1.5 Kb的mPPARγ2全长cDNA编码序列,亚克隆入逆转录病毒载体pGCEN中构建重组逆转录病毒载体pGCEN/mPPARγ2.pGCEN/mPPARγ2及pGCEN经LipofectAMINE感染病毒包装细胞系PA317细胞,通过筛选PA317细胞G418抗性克隆,收集病毒上清,然后用其感染靶细胞NIH3T3细胞,用免疫荧光染色及Westem印迹方法鉴定mPPARγ2在NIH3T3细胞中的表达情况.结果构建了含mPPARγ2全长cDNA重组逆转录病毒载体,获得了滴度分别为5×104CFU/ml和6×105 CFU/ml的pGCEN/mPPARγ2及pGCEN的病毒上清.经鉴定pGCEN/mPPARγ2能有效地感染靶细胞NIH3T3细胞并表达mPPARγ2.结论本研究结果为在体外建立脂肪细胞分化模型及为进一步研究PPARγ2在诱导脂肪细胞分化中的分子机制奠定了基础.
关键词： 3T3细胞 表达 过氧化物酶体增殖体激活受体γ2 逆转录病毒科 -
酸性成纤维细胞生长因子的分离纯化及活性鉴定
目的:从牛脑中分离纯化酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)并鉴定生物活性.方法:根据Denis GOSPODAROWICZ的方法,新鲜牛脑匀浆,三步硫酸铵盐析,后沉淀物溶解透析后予离子交换层析及琼脂糖凝胶亲和层析.促3T3细胞DNA合成率鉴定生物活性.结果:用1.0 mol/L NaCl的缓冲液洗脱得到分子量为13 600的多肽,得率为610 μg/kg牛脑.氨基酸组成分析与已知的aFGF相同.促3T3细胞DNA合成的低浓度为0.5 ng/ml,大效应浓度50 ng/ml,ED50值为8 ng/ml.结论:aFGF具有强烈的促细胞增殖作用.
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3T3细胞中性红光毒性试验方法的建立与验证
目的 采用Balb/c小鼠成纤维细胞3T3建立新药体外3T3细胞中性红光毒性试验方法,并验证该方法的可靠性.方法 利用盐酸氯丙嗪作为阳性药物,建立体外3T3细胞中性红光毒性试验方法;然后基于上述试验方法检测6个已知光毒性物质的光毒性,对方法的灵敏度和特异性进行验证.结果 在本试验条件下,盐酸胺碘酮、诺氟沙星、蒽和原卟啉均表现出潜在光毒性;而六氯酚和L-组氨酸均无光毒性,试验结果与相关文献报道一致.结论 在本试验条件下,本研究成功建立并验证了体外3T3细胞中性红光毒性试验方法,可用于新药的光毒性评价.
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兔口腔黏膜细胞与灭活的3T3成纤维细胞的体外共培养
目的 探讨口腔黏膜细胞的培养方法,为进一步以口腔黏膜细胞为种子细胞构建组织工程化尿道提供实验依据.方法 体外分离口腔黏膜细胞,取部分细胞与经丝裂霉素灭活的3T3成纤维细胞进行共培养(共培养组),定期观察细胞形态变化及生长增殖情况.以非共培养的口腔黏膜细胞作为对照(非共培养组).同时,对体外培养获得的口腔黏膜细胞进行广谱角蛋白抗体(AE1/AE3)和K19免疫荧光染色鉴定;流式细胞仪检测第2代共培养组细胞的AE1/AE3阳性细胞百分比.结果 共培养组口腔黏膜细胞,呈现典型的"铺路石"状,细胞形态均一,可传代至7～8代.非共培养组口腔黏膜细胞则形态多样,传至第2代时,即开始出现老化,细胞贴壁及增殖能力均明显减弱.免疫荧光染色显示,体外培养获得的口腔黏膜细胞AE1/AE3免疫荧光染色阳性,40%细胞K19染色阳性.流式细胞仪检测结果表明,第2代共培养组口腔黏膜细胞AE1/AE3阳性细胞百分比》95%.结论 口腔黏膜细胞在有灭活的3T3成纤维细胞存在时可成功培养和扩增,为进一步将其作为种子细胞构建组织工程化尿道奠定了良好的基础.
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胭脂红对3T3细胞DNA损伤的SCGE检测
目的 研究人工合成偶氮类色素胭脂红对体外培养小鼠胚胎成纤维细胞株(NIH3T3)DNA的损伤作用.方法 单层培养的3T3细胞中加入不同浓度胭脂红培养4 h,用碱性单细胞凝胶电泳技术(single cell gel electrophoresis, SCGE)检测3T3细胞DNA的单链断裂(single-strand breaks,SSBs)情况.结果 各染毒组彗星细胞率、彗星细胞的尾长、尾部DNA含量及尾矩与胭脂红浓度正相关,呈剂量-反应关系.结论 胭脂红对体外培养3T3细胞DNA具有损伤作用,浓度越大,损伤越严重.
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2种光源对体外3T3细胞光毒性试验结果的比较
目的 比较2种光源对体外3T3细胞光毒性试验结果的影响.方法 参照化学品体外3T3中性红摄取光毒性试验指导原则(OECD 432),采用模拟阳光光源和紫外光源对6种参考物质进行试验.结果 6种参考物质在2种光源照射后其光刺激因子和平均光效应均接近OECD 432中的参考值,各个物质在无光和有光下的IC50值也相近.结论 2种光源对体外3T3细胞光毒性试验结果基本无影响.
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VEGF165和VEGF121在MC3T3-E1细胞中的表达及生物学功能
目的:构建一个能在MC3T3-E1细胞中稳定表达,并具有生物学活性的VEGF165和VEGF121基因表达载体.方法:采用RT-PCR技术从HL-60细胞中扩增人VEGF165和VEGF121基因,将获得的基因定向插入pcDNA3.1(+)真核表达质粒中,测序正确后用脂质体将表达质粒转染入MC3T3-E1细胞.细胞经G418加压有限稀释筛选,采用ELISA法、Western blot法及免疫荧光法检测VEGF蛋白表达,并用MTT法检测表达的蛋白对血管内皮细胞株(HUECV304)的增殖活性影响.结果:通过基因测序表明获得的VEGF165和VEGF121与GeneBank登录的序列一致,构建的质粒分别为VEGF165/pcDNA3.1(+)质粒和VEGF121/pcDNA3.1(+)质粒,ELISA及Western blot检测结果均表明VEGF165和VEGF121基因转染MC3T3-E1后能在细胞中稳定表达,表达产物能明显促进HUECV304细胞生长.结论:基因转染的MC3T3-E1细胞能稳定、高效表达具有生物学活性的VEGF165和VEGF121重组蛋白.
关键词： 血管内皮生长因子类/代谢 血管内皮生长因子类/遗传 3T3细胞 基因表达 转染 质粒 -
Piwil2基因表达诱导NIH3T3细胞恶性转化
目的 通过建立稳定表达外源Piwil2基因的NIH3T3细胞,初步探讨Piwil2基因对NIH3T3细胞生物学特性的调控作用.方法 通过脂质体介导的方法和G418的筛选,建立稳定表达Piwil2基因的NIH3T3细胞株,之后利用细胞集落形成实验、细胞增殖实验、细胞周期分析和裸鼠成瘤实验,观察Piwil2基因表达对NIH3T3细胞的生物学特性的影响.结果 建立了稳定过表达Piwil2基因的NIH3T3细胞株.与对照组空白载体细胞系相比,过表达Piwil2基因的NIH3T3细胞增殖和集落形成能力增强;细胞周期G0/G1期减少、S期明显升高;接种裸鼠后形成的肿瘤体积显著大于对照组.结论 Piwil2基因在NIH3T3细胞中稳定表达具有诱导正常NIH3T3细胞发生恶性转化的重要生物功能.
