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抗G418小鼠胚胎干细胞饲养层的制备
目的:建立具有G418抗性的3T3细胞系,用于转染pTet-on基因的ES阳性克隆筛选的饲养层.方法:通过脂质体转染的方法,将含有neo基因的质粒pWL/neo导入3T3细胞中,利用G418的药物选择特性,对转染细胞进行压力筛选,并对其进行PCR鉴定.结果:经500μg/ml的G418压力筛选后,获得了抗G418细胞克隆.抗性3T3细胞的形态和生长速度与正常3T3细胞没有差异,用特异性核苷酸引物检测抗性细胞基因组DNA,可以扩增出对应的核苷酸片段,Southern blot鉴定结果表明neo基因片段已整合入G418抗生3T3细胞中.结论:成功地培育了G418抗性的3T3细胞,为进行pTet-on基因转染ES细胞的阳性细胞克隆筛选奠定了基础.
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表达肾癌G250基因和hGM-CSF基因HEK293细胞系的建立
目的 建立稳定表达肾癌G250基因与基因佐剂hGM-CSF基因编码蛋白的的HEK293细胞系.方法 通过脂质体转染的方法,将表达肾癌G250基因与细胞因子GM-CSF基因的双顺反子pIG250-GM真核表达质粒导入HEK293细胞中;经持续G418压力选择和有限稀释法获得稳定转染的细胞系;用免疫组化、ELISA和Western Blot方法,检测目的 蛋白在HEK293细胞中的表达.结果 经600 μg/mL的G418压力筛选后,获得了抗性细胞克隆;免疫组织化学方法检测到表达G250的阳性细胞；ELISA方法检测到pIG250-GM转染组细胞培养上清中hGM-CSF的表达与空载体对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05)；Western Blotting方法检测到G250蛋白的表达,分子量约54Ku,与预期大小相符.结论 成功建立可稳定表达肾癌G250基因与细胞因子GM-CSF基因的HEK293细胞系,为研究防治肾癌疫苗的免疫应答机制提供了实验基础.
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WDR5真核表达载体的构建及其在LNCaP细胞中的稳定表达
目的 构建人源WDR5全长结构基因真核表达载体,建立稳定表达WDR5的LNCaP细胞株.方法 PCR扩增WDR5基因,将WDR5插入pCI-neo载体中,酶切及测序鉴定重组质粒.利用脂质体转染法将重组质粒转染LNCaP细胞,Real Time-PCR检测转染细胞WDR5的mRNA表达水平.结果 经酶切及测序证实真核表达载体pCI-neo-WDR5构建正确.重组质粒转染到LNCaP细胞后,用G418筛选获得稳定表达的细胞株,Real Time-PCR方法检测到WDR5基因在转录水平的表达.结论 PCI-neo-WDR5成功转染LNCaP细胞株中并稳定表达,为下一步WDR5的深入研究及应用奠定了基础.
