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艾美耳球虫转基因技术研究进展
艾美耳属球虫是一类胞内寄生原虫,其造成的球虫病对畜禽养殖造成巨大经济损失.近年来随着分子生物学的飞速发展,艾美耳球虫的转基因研究取得较大突破,使转基因技术成为推动球虫研究的有力工具.本文综合近几年转基因球虫的研究成果,对艾美耳球虫转基因技术的建立与优化以及转基因球虫的潜在应用作一综述.
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转染白细胞介素1受体拮抗剂与转化生长因子β1软骨细胞和致炎软骨块共培养后炎性因子的变化
目的 观察重组人白细胞介素1受体拮抗剂(IL-1Ra)和转化生长因子β1(TGF-β1)双基因在体外对兔骨关节炎(OA)的治疗效果.方法 取新西兰大白兔关节软骨经酶消化分离原代培养软骨细胞,并采用特异性细胞外基质Ⅱ型胶原免疫细胞染色进行鉴定.软骨细胞分为转染IL-1Ra组(A组)、转染TGF-β1组(B组)、转染IL-1Ra+TGF-β1双基因组(C组)、未转染组(D组)、空白组(E组).A、B、C 3组均以LipofectamineTM 2000 Reagent脂质体为转染媒介.各组加入软骨块与软骨细胞共培养,除E组外,其余各组均加入20 ng IL-1β,转染共培养后分别在12、24 h、2、4、6 d通过荧光显微镜观察软骨细胞转基因的表达.于共培养第2,4、6天后应用放射免疫分析(RIA)分别检测各组IL-1β和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量.结果 成功分离培养软骨细胞,Ⅱ型胶原免疫细胞染色显示细胞胞质染成棕黄色.胞核基本不着色.荧光显微镜下A、B、C组均有绿色荧光蛋白的表达,转染后24 h,3组细胞的转染率高分别为(16.16+2.71)%、(16.54±2.91)%、(17.20±2.39)%,第2天后随时间的延长转染率逐渐降低.同时间点IL-1β水平D组＞B组＞A组＞C组＞E组;而第2、6天TNF-α水平D组＞A组＞B组＞C组＞E组,第4天E组＞A组＞B组＞C组＞D组,其中A组虽然略高于B组,但差异没有统计学意义,其余各组间差异均有统计学意义.A、B、C组的IL-1β和TNF-α在第6天的水平明显低于第2、4天,D、E组IL-1β水平不随时间的延长而改变,TNF-α水平D组在第4天时低,E组则高.结论 转染IL-1Ra和TGF-β1基因均有降低炎性因子水平的作用.联合应用转染IL-1Ra和TGF-β1基因可能控制炎性反应,为体外OA的基因治疗提供实验基础.
关键词： 白细胞介素1受体拮抗蛋白质 转化生长因子β1 软骨细胞 骨关节炎 转染 -
慢病毒介导的Isl1基因在人骨髓间充质干细胞中的表达
研究慢病毒介导的Isl1基因在人骨髓间充质干细胞(hMSC)中的表达情况,并检测其下游基因Nkx2.5和Flk-1的表达。方法 多位点Gateway载体构建技术构建2K7puro/EF 1α-Isl1慢病毒表达载体(由EF1α启动子启动Isl1基因表达)。包装细胞293FT细胞获得慢病毒,再转染至hMSC。利用嘌呤霉素抗性筛选出Isll阳性细胞。应用RT-PCR、Western blotting检测hMSC中Isl1基因在转染后1～6周的mRNA和1～4周的蛋白表达情况。结果 成功构建了慢病毒载体EF1α-Isl1,转染后hMSC中检测出Isl1基因mRNA和蛋白的表达,其mRNA表达随着培养时间延长而上调,第3周表达量(0.65±0.14)较1、2周增多(0.36±0.09,0.37±0.05,均P＜0.05),3周后表达趋于稳定。转染后在无任何诱导剂的情况下,检测到Isl1下游基因Nkx2.5的表达,但尚未见Flk-1的表达。结论通过慢病毒载体将Isl1基因转染hMSC后,可获得长期稳定的表达,并在无任何诱导剂的情况下,能促进下游基因Nkx2.5的表达。
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超声靶向微泡破坏技术介导报告基因对骨骼肌基因转染及不同给药途径的作用评价
目的 探讨超声靶向微泡破坏(UTMD)对小鼠骨骼肌基因转染的有效性,比较不同给药途径及报告质粒转染效率的差异.方法 实验随机分为单纯质粒注射组(P)、质粒+微泡组(P+MB)、质粒+超声辐照组(P+US)、质粒+微泡+超声辐照组(P+UTMD)4组.将绿色荧光蛋白(GFP)质粒或红色荧光蛋白(RFP)质粒分别与微泡(或生理盐水对照)混合,将混合物分别予以局部注射(单侧鼠胫骨前肌)和尾静脉注射,进行或不进行超声辐照,辐照频率为3 MHz、声强为1.0 W/cm2,辐照2 min,7d后处死小鼠,分别取各组小鼠的肝、心、骨骼肌组织制备冰冻切片.应用激光共聚焦显微镜检测各组小鼠骨骼肌组织荧光蛋白质粒GFP、RFP的转染效率；分析P+UTMD组小鼠肝脏、心脏组织中的荧光素酶活性；苏木精-伊红(HE)染色观察P+UTMD组小鼠肝、心、骨骼肌组织的病理学改变；对比P+UTMD组小鼠局部肌肉注射和尾静脉注射时不同的给药途径下肝、心、骨骼肌组织基因转染的效果.结果 单纯质粒注射组骨骼肌组织每个视野只有少数细胞表达RFP和GFP,表达率为(1.83±1.21)％、(1.18±0.25)％,P+MB组和P+US组的RFP、GFP表达率与单纯质粒注射的效果相当[(2.33±1.39)％、(3.42±1.09)％和(3.48±0.18)％、(2.52±0.33)％]；而P+UTMD组RFP、GFP的表达率为(23.96±2.13)％、(25.69±1.98)％,显著高于其他3组(P＜0.05).P+UTMD组小鼠部分肝脏和心脏中均有较微弱的荧光表达,HE染色未发现UTMD对肝、心、骨骼肌组织造成明显的损伤,完整性良好,无感染、出血、水肿及细胞死亡.直接肌肉局部注射质粒联合UTMD能显著增强小鼠骨骼肌局部的基因转染,显著优于尾静脉注射(P＜0.05).结论 UTMD可有效促进基因转移,局部注射联合UTMD能显著增强骨骼肌局部基因转染,是一种安全、高效的基因转染新技术.
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小分子干扰RNA对新生鼠肺成纤维细胞转化生长因子β1的干预效果及意义
目的 探讨转化生长因子β1(TGF-β1)小分子干扰RNA(siRNA)体外转染新牛鼠肺成纤维细胞的干预效果,研究TGF-β1 siRNA的佳干预剂量及维持时间. 方法 首先采用化学合成TGF-β1 siRNA对新生鼠肺成纤维细胞进行干预,通过实时定量PCR检测技术筛选出有效干扰片段;然后构建TGF-β1 siRNA腺病毒载体,体外转染新生鼠肺成纤维细胞,半定量PCR检测体外转染后TGF-β1基因的抑制效果,确定其佳干预剂量及维持时间. 结果 (1)化学合成siRNA抑制TGF-β1基因表达的效果:siRNA剂量为20 pmol,转染后24 h检测抑制效果,第2、3、4条siRNA均有不同效果,其中第3条siRNA抑制效率>70%;(2)TGF-β1 siRNA腺病毒载体转染细胞,观察20、50μl不同剂量转染后24 h抑制情况,并与20μl阴性和空白对照比较,结果显示20、50μl均有明显抑制效果;观察转染后24、48、72 h的抑制效果,比较显示转染后24 h有明显抑制效果,72 h抑制效果强,说明随着转染时间延长,抑制作用越明显. 结论 TGF-β1 siRNA腺病毒载体体外转染新生鼠肺成纤维细胞对TGF-β1的表达均有明显抑制效果.
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骨形态发生蛋白2基因转染人羊水干细胞复合β-磷酸三钙支架促进骨再生
目的 研究重组腺病毒介导的骨形态发生蛋白2(BMP-2)基因转染人羊水干细胞(hAFSC)的体外成骨分化,评价基因修饰的hAFSC负载于β-磷酸三钙(β-TCP)多孔支架后体内成骨能力.方法 收集人工破膜后的中段羊水原代培养hAFSC,免疫磁珠分选CD117/c-kit阳性的hAFSC,分别转染腺病毒介导的BMP-2或增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因,转染组转染BMP-2和EGFP基因、对照组转染无BMP-2编码序列的EGFP基因,空白组不做病毒转染.48 h后荧光显微镜下观察细胞荧光表达及生长状况,应用流式细胞仪检测转染率.转染第7、14、21、28天采用ELISA检测各组hAFSC培养液中的BMP-2分泌量以确认转染后目的蛋白表达效果.各组hAFSC成骨诱导14d后进行碱性磷酸酶(ALP)染色,28 d后进行茜素红染色评价成骨能力;成骨诱导3、7、14d后定量检测各组细胞ALP活性.20只8周龄裸小鼠随机分为Adv-hBMP-2-hAFSC-β-TCP组、Adv-EGFP-hAFSC-β-TCP组、hAFSC-β-TCP组和β-TCP组,每组5只,将细胞载体复合物植入各组裸小鼠股骨,8周后观察异位成骨组织学情况.结果 hAFSC生长良好,Adv-hBMP-2或Adv-EGFP基因转染48 h后荧光显微镜下见细胞贴壁良好,发出强绿色荧光,无死细胞产生,转染阳性率达(89.00±4.25)％.转染Adv-hBMP-2组hAFSC培养液上清中BMP-2第7、14、21、28天分别为(3.405±0.229)μg/L、(4.575±0.179)μg/L、(3.910±0.175)μg/L、(2.694±0.205)μg/L,第14天蛋白BMP-2分泌已达到高峰且第28天仍有蛋白表达,各时间点均明显高于对照组与空白组(均P＜ 0.05).hAFSC成骨诱导14d后细胞相连成片,与对照组及空白组比较,ALP染色转染组染色阳性面积更大、阳性细胞数量更多.成骨诱导28 d后茜素红染色见转染组细胞多中心聚集,伴大量红色钙结节形成,结节数量与大小明显优于对照组与空白组.成骨诱导3、7、14 d后各组ALP表达均升高,其中转染组ALP分泌逐渐增多,各时间点均高于空白组及对照组(均P＜0.05);对照组及空白组ALP分泌在成骨诱导3、7、14 d后均升高,各时间点ALP定量差异无统计学意义.体内植入8周后,Adv-hBMP-2-hAFSC-β-TCP组较其余3组材料降解更快,骨形成更多,未见纤维组织产生;Adv-EGFP-hAFSC-β-TCP和hAFSC-β-TCP组出现少量新生骨,材料降解较慢;β-TCP组单独植入后无明显降解,少量新生骨形成.结论 BMP-2基因转染的hAFSC有利于加强骨再生.
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核因子κB p65反义寡核苷酸对大鼠肝星状细胞增殖和I型胶原表达的影响
目的 探讨核因子κB(NF-κB)p65反义寡核苷酸(ASOND)对大鼠肝星状细胞(HSC)增殖和I型胶原表达的影响.方法 Ⅳ型胶原酶消化密度梯度离心法分离培养大鼠HSC;脂质体介导的不同浓度的NF-κB p65 ASOND(0.001、0.01、0.1和1μmol/L)进入HSC;台盼蓝染色排斥法检测NF-κBp65 ASOND对HSC的毒性实验并检测各组乳酸脱氢酶(LDH)活性;MTT法测定NF-κB p65 ASOND对1mg/LTNF-α刺激后HSC增殖影响;RT-PCR法和ELISA法检测不同浓度NF-κB p65 ASOND对1mg/LTNF-α刺激后HSC I型胶原表达的影响.结果 转染NF-κB p65 ASODN后,HSC细胞NF-κB蛋白的表达下降,不同浓度(0.001、0.01、0.1和1 μmol/L)的NF-κB p65 ASOND对于体外培养HSC的存活率和LDH无明显影响(P>0.05),0.01～μmol/L的NF-κB p65 ASOND抑制HSC的增殖,lmg/L TNF-α刺激HSC的I型胶原蛋白和mRNA的表达,且随浓度的增加作用增强(P<0.05).结论 NF-κB p65 ASOND可通过抑制NF-κB活性减少HSC活化增殖及Ⅰ型胶原生成,从而减少细胞外基质的产生.
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人类脂肪来源成体干细胞体外定向成软骨的诱导实验
目的 评价人类脂肪来源成体干细胞(hADASc)体外培养转基因定向成软骨诱导的可行性.方法 hADASc体外培养后行PGL3.转化生长因子β1(TGF-β1)基因转染并鉴定,检测转染细胞Lueiferase活性相对光读数(RLU),再行反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测和抗Ⅱ型胶原免疫组织化学染色(实验组:转染的hADASc,同比对照组:加入软骨细胞定向诱导培养基的未转染hADASc;阴性对照组:未转染的hADASc),自动图像分析系统分析免疫染色图片并计算阳性颗粒(PU)值.结果 人类皮下脂肪体外分离培养出具有干细胞特征的有核组织细胞.hADASc转染后,实验组测得RLU值(9 212.583±315.240)高于阴性对照组(317.000±20.710,P＜0.01).RT-PCR结果显示转染的hADASc表达TGF-β1;免疫染色结果显示,实验组与同比对照组呈阳性反应,且两组PU值(13.864±2.416,13.637±2.548)均与阴性对照组的PU值差异有统计学意义(6.013±0.827,P＜0.05).结论 人类皮下脂肪体外分离培养出具有干细胞特征的有核组织细胞.PGL3-TGF-β1基因转染的hADASc可表达TGF-β1.内源性TGF-β1可诱导hADASc分泌Ⅱ型胶原蛋白,与外源性TGF-β1作用相类似.
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经冠状动脉注射超声靶向微泡破坏促进犬急性心肌梗死后血管新生
目的 探讨经冠脉注射超声靶向微泡破坏(intracoronary ultrasound targeted microbubble destruction,IC-UTMD)促进血管新生治疗心肌梗死的疗效.方法 37只杂种犬随机分成4组:对照组(n=7,经冠脉注射生理盐水),冠脉注射组(IC组,n=10,经冠脉注射血管生成素Ang1质粒),IC-UTMD组(n=10,经冠脉注射Ang1质粒+UTMD)和IV-UTMD组(n=10,经静脉注射Ang1质粒+UTMD).心梗治疗前后均行常规超声和心肌灌注造影.12h后治疗组各取3只检测FITC荧光标记的Ang1在心肌组织中分布情况.1个月后心肌取材,Masson染色比较梗死心肌纤维化程度,Ⅷ因子和a-SMA定位新生血管,RT-PCR和Western blotting检测Ang1 mRNA和蛋白表达量.结果 12h后,绿色荧光在IC-UTMD组多(30.0％±3.5％),较IC组(15.2％±2.5％)和IV-UTMD组(20.9％±3.1％)明显增加(P＜0.05);1个月后,IC-UTMD组左室舒张末期内径(LVEDD)增大较其他组缓慢,左室射血分数(LVEF)显著改善;IC-UTMD组心肌灌注强度比和灌注速率较其他组增高(P＜0.05);Masson染色胶原纤维在对照组多(60.0％±6.1％),IC-UTMD组(35.2％±5.0％)明显减少;Ⅷ因子和α-SMA提示IC-UTMD组新生血管较其他组增加(P＜0.05);Ang1 mRNA和蛋白表达在IC-UTMD组较IC组和IV-UTMD组增多(P＜0.05).结论 IC-UTMD能提高Ang1质粒在梗死周边含量,从而增强基因转染效率,促进血管新生,改善左室重构;与IV-UTMD相比,IC-UTMD是一种更有效的转染方式.
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携带靶向干扰小鼠早期生长反应基因1短发夹RNA的慢病毒载体转染小鼠视网膜的干扰效率研究
目的 构建携带绿色荧光蛋白(GFP)和靶向干扰早期生长反应基因1(Egr-1)短发夹RNA(shRNA)共表达的慢病毒载体,转染小鼠视网膜组织,观察其对Egr-1基因的干扰效率.方法 针对已经筛选确定的Egr-1基因shRNA有效靶序列,构建携带GFP和靶向干扰Egr-1 shRNA的慢病毒载体LV-shRNA(Egr-1).15日龄C57BL/6小鼠完全随机法分为实验组和阴性对照组,每组10只.LVshRNA(Egr-1)慢病毒载体经玻璃体腔注射转染至实验组小鼠右眼内,不针对任何特异基因的LV-NC 慢病毒载体通过同样的转染途径转染至阴性对照组小鼠右眼内,实验组及阴性对照组小鼠左眼不做任何处理设为空白对照组.2周后荧光显微镜下观察转染情况,实时定量PCR(RQ-PCR)、免疫印迹(Western blot)、免疫荧光检测Egr-1的表达,观察Egr-1基因的干扰效率.结果 慢病毒载体经玻璃体腔注射途径转染小鼠视网膜后,GFP广泛分布于视网膜全层,包括视网膜色素上皮层.与空白对照组和阴性对照组注射眼比较,RQ-PCR检测显示实验组注射眼Egr-1 mRNA表达明显下调(0.290+0.074比1.006±0.033、1.010±0.086,均P＜0.001),抑制率为71.29%;免疫印迹显示实验组注射眼内Egr-1蛋白表达明显下调(0.224±0.035比0.674±0.050、0.688±0.049,P＜0.001),抑制率为67.44%.免疫荧光检测发现实验组注射眼在视网膜除内核层有少许Egr-1阳性细胞分布外,没有荧光表达.结论 成功构建携带绿色荧光蛋白和靶向干扰Egr-1基因shRNA的慢病毒载体,经玻璃体腔注射转染小鼠眼内其转染效率高,分布范围广,且对小鼠视网膜Egr-1基因抑制效率高.
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葡萄球菌肠毒素A真核表达质粒的构建及其在喉癌Hep-2细胞来源exosomes中的表达
目的 构建葡萄球菌肠毒素A(SEA)与糖基化磷脂酰肌醇(GPI)的真核表达质粒pmiR-RB-REPORT-SEA-GPI并转染人喉癌细胞株Hep-2细胞,检测Hep-2细胞分泌的exosomes中SEA的表达.方法 利用NOT I酶切原核生物质粒pGSI-SEA-GPI粘性末端,琼脂糖凝胶电泳分离、提纯目的基因SEA-GPI,利用T4连接酶连接真核表达质粒pmiR-RB-REPORT与SEA-GPI构建真核表达质粒pmiR-RB-REPORT-SEA-GPI.脂质体法转染pmiR-RB-REPORT-SEA-GPI至Hep-2细胞,荧光定量实时PCR(qRT-PCR)检测Hep-2细胞SEA-GPI mRNA的表达.提取Hep-2细胞分泌的exosomes,免疫印迹测定SEA在exosomes中的表达.结果 琼脂糖凝胶电泳显示成功构建真核表达质粒pmiR-RB-REPORT-SEA-GPI.qRT-PCR检测显示,pmiR-RB-REPORT-SEA-GPI转染的Hep-2细胞SEA-GPI mRNA显著表达.免疫印迹显示Hep-2细胞分泌的exosomes中存在SEA蛋白表达.结论 SEA可能通过GPI结构锚定于exosomes膜上,为制备含有SEA-GPI锚定蛋白的SEA-eoxsomes瘤苗提供了依据.
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构建光遗传学方法调控纹状体神经元活性的实验研究
目的 构建光遗传学方法特异性调控纹状体神经元活性的方法.方法 通过氯化钙转染方法包装慢病毒,通过慢病毒介导光敏感蛋白在小鼠脑内表达,利用免疫荧光的方法确定光敏感蛋白的定位,采用在体电生理记录系统确定光遗传方法的有效性.结果 免疫荧光显示慢病毒定位注射两周后能稳定将光敏感蛋白转入纹状体神经元内,不在其它细胞中表达,在体电生理显示激光能够显著的增加纹状体神经元的活性.结论 光遗传学方法能够有效的调节纹状体神经元的活性.
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Tet-On系统调控的人骨形态发生蛋白2基因的表达
目的 在骨髓间充质干细胞(BMSC)水平上构建调控表达人骨形态发生蛋白2(hBMP-2)基因的Tet-On系统,在低剂量强力霉素(DOX)诱导下测定其表达水平.方法 将hBMP-2的cDNA亚克隆至穿梭载体pTRE-Shuttle2,再定向克隆到腺病毒,构建重组的Adeno-X-hBMP-2载体后,将线性化后的Adeno-X-hBMP-2与携带Tet-On转录活化因子的腺病毒载体BD Adeno-X Tet-On virus Stock分别转染人胚肾293(HEK293)细胞扩增,再共转染小鼠BMSC.在DOX诱导下用RT-PCR检测hBMP-2 mRNA的表达,并用ELISA检测DOX诱导浓度与hBMP-2蛋白表达量之间的关系.结果 在BMSC水平上成功构建能诱导表达hBMP-2的Tet-On调控系统,RT-PCR可以检测到hBMP-2 mRNA显著表达;ELISA检测到浓度为0.01 mg/L的DOX,hBMP-2含量为(165.677±0.008)ng/L;高于该浓度时,hBMP-2分泌量对DOX有浓度依赖性(R2=0.892 4,P<0.05).结论 表达hBMP-2的Tet-On调控系统在低剂量DOX诱导后能够显著表达hBMP-2,并在DOX>0.01 mg/L时有浓度依赖性.
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pEGFP-C2-hTim-3真核表达载体的构建和hTim-3质粒稳定转染16HBE细胞株的建立
目的 筛选表达Tim-3的人呼吸道相关细胞株,为进一步阐明Tim-3可能与人呼吸道疾病相关奠定基础;构建pEGFP-C2-hTim-3真核表达载体,以期用于hTim-3的功能研究.将测序正确的重组质粒pEGFP-C2-hTim-3转染入人支气管上皮细胞株16HBE中,筛选出阳性细胞克隆,为后续实验提供理论基础. 方法 用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基于37℃5％CO2饱和湿度培养箱中体外培养人呼吸道相关细胞株16HBE、A549和GLC-82,调整细胞到佳状态,对数生长期时收集细胞,抽提总RNA,逆转录为cDNA.参照人GenBank中Tim-3基因的全长序列,使用Primer5.0设计并合成其引物,采用PCR检测以上3种细胞Tim-3的mRNA.将健康人外周血Tim-3基因全长cDNA片段克隆入真核表达载体pEGFP-C2,经菌落PCR、双酶切及测序鉴定,构建包含目的基因Tim-3的重组质粒pEGFP-C2-hTim-3.利用脂质体介导pEGFP-C2-hTim-3质粒和pEGFP-C2质粒分别转染16HBE细胞,荧光显微镜下观察16HBE细胞的瞬时转染效率,并采用含G418的培养基筛选以获得整合pEGFP-C2-hTim-3和pEGFP-C2的阳性细胞克隆,用荧光显微镜观察pEGFP-C2-hTim-3和pEGFP-C2在16HBE细胞上的定位表达. 结果 1)PCR显示人呼吸道相关细胞株16HBE、A549和GLC-82均表达Tim-3 mRNA;2)构建了具有筛选特征和能够稳定表达的pEGFP-C2-hTim-3质粒载体,测序结果与预期设计完全一致;3)瞬时转染后经荧光显微镜检查可见表达pEGFP-C2-hTim-3绿色荧光蛋白的16HBE细胞不足8％,表达pEGFP-C2绿色荧光蛋白的16HBE细胞不足15％o.采用G418筛选后获得表达野生型hTim-3和外源性pEGFP-C2-hTim-3的16HBE细胞及转染pEGFP-C2空质粒的16HBE细胞,经荧光显微镜观察前者定位在胞膜上,后者定位于胞质中. 结论 人呼吸道相关细胞株16HBE、A549和GLC-82均表达Tim-3 mRNA,Tim-3可能与人类呼吸道疾病的发生和发展相关.成功构建了真核表达载体pEGFP-C2-hTim-3并获得了高表达pEG-FP-C2-hTim-3的16HBE阳性克隆细胞,可供后续研究使用.
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3种转染试剂介导siRNA转染蚊细胞的比较研究
目的 比较3种不同转染试剂介导siRNA转染蚊细胞的优缺点,选择优方法 用于转染后细胞存活率检测试验.方法 分别用FuGENE HD,X-tremeGENE和siPORT Amine 3种转染试剂介导特定siRNA转染蚊细胞,转染48 h后采用实时荧光定量PCR检测目的 基因的表达.比较3种方法 的干涉效率,转染试剂对细胞的毒性和不同方法 的操作步骤对实验结果 的影响.结果 FuGENE HD、X-tremeGENE和siPORT Amine转染后的干涉效率分别为70%、85%和29%;FuGENE HD和siPORT Amine对蚊C6/36抗性细胞毒性较小,X-tremeGENE对蚊细胞毒性较大;FuGENE HD的转染过程需要更换一次细胞培养液,X-tremeGENE的转染过程需要更换2次细胞培养液,siPORT A-mine的转染过程不需要更换培养液.结论 转染试剂的转染效果对于实验结果 有显著影响.在蚊细胞转染siRNA的实验中,FuGENE HD转染效率尚可,对细胞毒性小,转染过程只需1次换液操作;X-tremeGENE转染效率较高,对蚊细胞毒性较大,有2次换液操作;siPORT Amine毒性小且不需换液操作,但转染效率较低.综合评价:FuGENE HD更适用于转染siRNA后细胞存活率实验.
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天然免疫分子LILRB5慢病毒稳定转染THP-1细胞系的构建
目的 构建天然免疫分子LILRB5的慢病毒表达载体,获得稳定转染LILRB5的单核细胞系. 方法 将LILRB5构建入真核表达载体pEGFP-flag,瞬时转染293T细胞系,通过免疫荧光和流式细胞术检测LILRB5-GFP和LILRB5-flag在293T细胞中的表达.构建慢病毒表达载体pHR-LILRB5,与p8.91和pMD共同转入293T细胞,产生标记有绿色荧光的LILRB5慢病毒,感染单核细胞系THP-1后通过流式细胞术检测LILRB5的表达. 结果 测序显示真核表达载体pEGFP-LILRB5-flag的序列与预期相符,瞬时转染pEGFP-LILRB5-flag的293T细胞可检测到绿色荧光蛋白的表达,流式细胞术检测显示LILRB5-flag在细胞膜表面有表达;构建亚克隆慢病毒载体pHR-LILRB5,经测序验证后,转染293T细胞,产生LILRB5的慢病毒,并感染THP-1细胞,流式细胞术检测LILRB5在THP-1细胞稳定表达. 结论 构建LILRB5的慢病毒载体,通过LILRB5慢病毒感染建立LILRB5的稳转THP-1细胞系.
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霍乱肠毒素ctxA基因真核表达重组质粒的构建及表达
目的 构建霍乱肠毒素A亚单位基因(ctxA)真核表达重组质粒,并在NIH3T3细胞中进行表达.方法 用限制性核酸内切酶从重组质粒pET32a-ctxA上切下ctxA基因,导入真核表达载体pcDNA3.1(+),重组子pcDNA3.1-ctxA经限制性酶切分析、PCR鉴定和序列测定正确后,用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-ctxA转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法和Western blot对pcDNA3.1-ctxA的瞬时表达产物和稳定表达产物进行鉴定.结果重组质粒pcDNA3.1-ctxA成功转入NIH3T3细胞,利用免疫荧光技术在NIH3T3细胞膜和细胞浆中检测到了瞬时表达,用Western blot检测到转染的阳性细胞克隆稳定表达出约29 ku的蛋白.结论 成功构建霍乱肠毒素A亚单位基因真核表达重组质粒pcDNA3.1-ctxA,并在NIH3T3细胞中表达出29 ku的CTA蛋白.
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转基因内皮细胞的构建及其在复合血管上种植的初步研究
目的:为了解决小口径(直径7mm以下)人造血管术后通畅率低下的问题,利用生物-人工复合血管,结合分子生物学手段,将转入血管内皮生长因子(VEGF165)基因的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)种植于复合血管内腔面,为解决此临床难题提供新的思路和手段.材料方法:构建VEGF165真核表达质粒pCI-neo-VEGF165,获得正确的质粒用于转染HUVEC.从中科院购买HUVEC(代号:ECV-304),用脂质体介导法将pCI-neo-VEGF165转入细胞,经G418筛选后,计数阳性克隆,以比较脂质体和质粒在不同比例情况下转染效率的高低.实验组按质粒和脂质体比例的不同分为4组:1 μg/3 μl;2 μg/6μl;2 μg/8μl;3μg/12μl.ELISA检测瞬时转染后HUVEC培养上清中VEGF的表达.再将VEGF165基因瞬时转入HUVEC,利用自己设计的旋转培养装置,将细胞均匀地粘附、种植于复合血管内腔面.复合血管是人工材料(聚酯)和生物材料(成纤维细胞长入,胶原形成)有机结合而成,是将包有聚酯网的硅胶棒埋入绵羊背部皮下组织,3个月后取出,抽去硅胶棒而得到的.结果:脂质体转染效率以2μg/8μl组阳性克隆数多;ELISA测定瞬时转染后HUVEC培养上清中VEGF的表达量为532.5±43.1pg/ml.使用旋转培养装置的细胞均匀地粘附于复合血管,未使用者细胞积聚于血管腔面下部;转入和未转入VEGF165基因的HUVEC在复合血管内腔面覆盖面积百分比分别为69.9%±3.5%、43.7%±2.5%,有明显改善.结论:转入VEGF后可促进HUVEC在复合血管上生长,旋转培养装置有利于细胞的均匀粘附.
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Foxp3转染小鼠CD4+CD25-T细胞抑制树突状细胞功能
为了研究Foxp3基因表达与CD4+T细胞免疫活性的关系,用逆转录病毒转染Foxp3基因,在幼稚CD4+CD25-T细胞内强制性表达FOXP3蛋白,进而研究转染后的CD4+CD25-T细胞对树突状细胞的免疫共刺激分子和免疫功能的影响,并通过Transwell试验研究转染Foxp3的CD4+CD25-T细胞对树突状细胞的作用是否依赖于细胞之间的直接接触.结果表明:通过逆转录病毒载体转染,成功建立了表达Foxp3的CD4+CD25-T细胞模型,转染后1周Foxp3阳性表达的T细胞比例为38%.强制性表达Foxp3的CD4+CD25-T细胞可以在体外发挥免疫抑制作用,可以诱导树突状细胞表面免疫共刺激分子CD80和CD86表达水平的下调.体外淋巴细胞增殖试验结果表明,Foxp3转染小鼠CD4+CD25-T细胞可以抑制树突状细胞对异基因淋巴细胞的活化.结论:转染Foxp3的CD4+CD25-T细胞对树突状细胞发挥的作用依赖于细胞之间的直接接触.
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肽核酸阻断PYR复合体与DNA位点结合对γ-珠蛋白基因表达的影响
目的:探讨肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)阻断PYR复合体(polypyrimidine complex)与DNA序列结合对γ-珠蛋白基因表达的影响.方法:设计并合成PYR-PNA、β-PNA和RS-PNA(随机序列PNA),以阳离子脂质体lipofectamine 2000为载体,将PNA转染到K562细胞中.用RT-PCR和Western blot技术分别在转录水平和蛋白翻译水平检测K562细胞在转染24、48和72 h后γ-珠蛋白基因的表达情况.结果:PYR-PNA组在转染24、48和72h后γ-珠蛋白基因mRNA和蛋白表达水平均显著高于RS-PNA组和空白对照组(P＜0.05),其中以转染48h后的表达上调为明显,分别为空白对照组的2.0和2.5倍.结论:PYR-PNA可显著上调K562细胞中γ-珠蛋白基因的表达;本研究为β-地中海贫血基因治疗提供了新的研究思路.
