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IL-21重组载体的构建及其诱导T细胞活化增殖的研究
目的：构建小鼠IL-21基因真核重组表达载体，为IL-21基因治疗肿瘤奠定基础。方法分离 BALB/c 小鼠脾细胞，提取总 RNA，经 RT-PCR 扩增 IL-21基因片段，构建重组质粒pcDNA3.1（-）-IL-21，分组免疫小鼠，检测其脾细胞膜表面 CD 分子。结果重组质粒测序结果与GenBank中序列一致，大小为490 bp。核酸疫苗免疫组小鼠脾细胞表面CD分子表达量明显高于PBS 和pcDNA3.1（-）空质粒组。结论成功的构建了重组质粒pcDNA3.1（-）-IL-21，该核酸疫苗免疫小鼠后，可有效地诱导其体内T细胞的活化增殖。
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胰腺癌相关自身抗原47原核表达、纯化及其抗体检测胰腺癌的价值初探
目的验证胰腺癌相关性自身抗原47(PAA47)的质谱鉴定结果,初探抗PAA47检测在诊断胰腺癌中的意义.方法构建pQE-30-PAA47重组表达载体;在大肠杆菌M15中诱导表达KIAA0111编码蛋白质;经纯化后用点印迹、免疫印证法验证表达产物与相应胰腺癌相关性自身抗体阳性血清的抗原反应性;建立间接酶联免疫吸附实验(ELISA),检测60名健康体检者、60例胰腺癌、20例慢性胰腺炎及120例其他肿瘤(大肠癌、肝癌、胃癌及肺癌各30例)患者血清中的抗PAA47,并与回顾性糖链抗原19-9(CA19-9)检测结果相比较.结果表达产物的序列与KIAA0111编码序列一致;点印迹法和免疫印迹法显示纯化表达产物与抗PAA47血清具有抗原反应性.ELISA结果显示,胰腺癌患者中,该抗体阳性率为31.67%(19/60),大肠癌、肝癌、胃癌分别为10.00%、3.33%、6.67%,正常人、慢性胰腺炎及肺癌患者中未见阳性.抗PAA47对胰腺癌的灵敏度为31.67%,特异性为95.89%.与慢性胰腺炎患者比较,PAA47的灵敏度为31.67%,特异性为100%,CA19-9的灵敏度为75.00%,特异性为86.96%.平行法联合检测2项指标,既保持了相同的特异性,又提高了检测的灵敏度(90%,P<0.05).采用顺序法联合检测,灵敏度和特异性分别为70%和100%.结论本研究成功克隆了人KIAA0111编码基因,并将其在大肠杆菌中成功表达;新鉴定的PAA47,其抗体血清学检测与CA19-9等肿瘤标志物联合,对提高胰腺癌诊断的灵敏度和特异性具有一定的意义.
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生物芯片技术发展现状及应用前景
21世纪是生命科学的世纪,也是一个信息爆炸的时代.2002年6月26日首张人类基因图和测序计划(HGP)完成后;科学家们开始进入功能基因组,即"后基因时代"的研究.随蛋白组学研究与疾病相关基因和功能蛋白不断发现,出现了大量的生物信息和需要解决的医学问题.随之,现代生物技术,转入基因组学技术、蛋白组学技术、生物信息学、生物芯片技术、基因克隆、重组、表达技术,动物体细胞克隆技术等方面,其中引人关注的是生物芯片技术.生物芯片技术始于20世纪80年代后期,被评为1998年度世界十大科技进展之一,其概念源于计算机芯片.其成熟标志为全球掀起至今方兴未艾的技术研究和产业化生产的热潮.
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层粘连蛋白-5γ2链Ⅳ功能区基因克隆及蛋白表达
层粘连蛋白-5(LN-5)是层粘连蛋白家族中一员,是1个α3、β3和γ2 3条多肽链经二硫键结合的"Y"字型糖蛋白分子.该蛋白在皮肤修复与移植、肿瘤发生与迁徙中起重要作用,遗传性大疱性表皮松懈症(JEB)与该多肽链结构的基因突变有关[1-3].γ2链IV功能区对LN-5分子在细胞黏附过程中起关键性作用[4].为探讨该功能区是否为LN-5小黏附功能单位,是否可替代LN-5检测指标,本研究构建含γ2链IV功能区基因克隆载体,并对该蛋白进行原核表达.
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超广谱β内酰胺酶SHV-4型基因克隆表达与纯化研究
在临床微生物学诊断、食品监测、药物生产等研究中均对超广谱β内酰胺酶(ESBL)有广泛需求,而目前市售商品酶都是从天然耐药菌提取的低纯度酶,且价格高昂.
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逆转录病毒载体介导反义K-ras基因治疗胰腺癌的实验研究
目的:分离及克隆胰腺癌细胞基因组中K-ras基因片段,构建含反义K-ras癌基因逆转录病毒载体并探讨其对胰腺癌细胞增生、凋亡的影响及可能的分子机制.方法:设计2对PCR引物,分别在上下游引物中引进BamHI和EcoRI位点,以胰腺癌细胞株BxPC-3、PC-3基因组DNA为模板扩增K-ras基因外显子1、4及侧翼序列,将目的基因克隆入逆转录病毒载体pLXSN中,构建重组质粒,经PT-67细胞包装后获得重组逆转录病毒.将该重组逆转录病毒转染上述细胞,经G418筛选获得稳定细胞,应用MTT、流式细胞仪和免疫组化法分别研究其增生、凋亡和对胰腺癌p21蛋白表达;建立胰腺癌裸鼠移植瘤模型,观察反义K-ras基因体内治疗效果.结果:成功构建含反义K-ras基因的重组逆转录病毒载体.反义K-ras基因抑制胰腺癌细胞增生,诱导细胞凋亡、下调K-rasmRNA和P21蛋白表达,并抑制裸鼠胰腺癌移植瘤的生长.结论:反义K-ras基因可使胰腺癌细胞增生受到抑制,并可诱导细胞凋亡和下调K-rasmRNA和P21蛋白表达.
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巨噬细胞金属弹力酶对小鼠原位结肠癌生长及COX-2表达的影响
目的:探讨巨噬细胞金属弹力酶(MME)对小鼠原位结肠癌生长、微血管生成及环氧合酶-2(COX-2)表达的影响.方法:扩增编码MME基因结构域Ⅰ和Ⅱ的cDNA片段,构建真核细胞表达载体pcDNA3.1-MME并转染小鼠CT-26结肠癌细胞.建立MME转染组及对照组小鼠原位结肠癌种植模型,观察重组MME对结肠癌生长的影响,采用Western blot方法检测肿瘤组织中的COX-2表达和微血管密度(MVD).结果:4 wk后,小鼠原位结肠癌的平均体积和微血管密度,空质粒转染组小鼠和未转染组显著高于MME转染组(1151.07±35.91 mm3,1201.13±42.15 mm3 vs 384.83±4.76 mm3,P＜0.001;21.87±0.47,22.56±0.71 vs 8.48±0.53,P＜0.001).COX-2蛋白水平在MME转染组中均显著低于对照组(2.766±1.22 vs 5.77±1.08,5.84±0.95,P＜0.01).结论:转染入小鼠结肠癌细胞的MME基因通过抑制新生血管的生成和COX-2表达,从而起到抑制原位结肠癌生长的作用.
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人FUT3基因真核表达载体的构建与表达
目的:构建增强型绿色荧光蛋白为报告基因的pEGFP-C1-FUT3真核表达载体,分析其在细胞系MDA-MB-231中的表达.方法:采用RT-PCR扩增FUT3全长基因片段,克隆至pMD18-T载体进行测序分析,将FUT3亚克隆至pEGFP-C1表达载体并酶切鉴定.利用脂质体将重组真核表达栽体pEGFP-C1-FUT3转染入人乳腺癌细胞MDA-MB-231中,经G418筛选获得稳定转染的细胞系,荧光显微镜观察及RT-PCR检测FUT3的表选.结果:成功获得人全长FUT3基因并构建了真核表达栽体pEGFP-C1-FUT3,体外转染MDA-MB-231细胞后荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,半定量RT-PCR检出高水平表达的FUT3.结论:成功构建了增强型绿色荧光蛋白为报告基因的FUT3真核表达载体,并在MDA-MB-231中稳定表达,为进一步研究FUT3的生物学功能提供基础.
关键词： α 1 3-岩藻糖基转移酶Ⅲ 增强型绿色荧光蛋白 基因克隆 -
肿瘤相关未知功能基因MGC39325的克隆及生物信息学分析
目的:克隆与肿瘤恶性演进相关但未知功能的新基因MGC39325,构建其真核表达载体,并应用生物信息学初步探讨其功能.方法:应用RT-PCR技术从LoVo细胞中扩增MGC39325基因全长ORF,选用pGEM-T载体进行TA克隆,再将其亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)的启动子和终止子之间,通过PCR、限制性酶切分析及测序进行鉴定.应用生物信息学初步分析其染色体定位、蛋白序列、结构域及功能.结果:从LoVo细胞中扩增出1158 bp的cDNA,成功进行TA克隆并进一步亚克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体,测序证实为人MGC39325基因.生物信息学分析显示此基因定位于8q12.1,含有2个外显子(1113 bp),DNA序列含有表皮样生长因子位点标记(3-14,12-23)、整合素beta链半胱氨酸富集区位点标记(183-196)、铁氧化还原蛋白铁硫结合区位点标记(389-397,1027-1038)、第Ⅷ因子结构域位点标记(105-157,548-591)、羧基端胱氨酸结位点标记(744-782)等,编码由370个氨基酸组成蛋白质,Mr 40 727.9,pI值为9.45,疏水性平均值为-0.668,含3个低复杂性区域结构,氨基酸序列含有豆蔻酰化位点(19-24,130-135)、cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶(38-41,46-49,204-207)、酪蛋白激酶(49-52,158-161)、酪氨酸激酶(53-61)、蛋白激酶C磷酸化位点(97-99,140-142,208-210)、N-糖基化位点(97-99)等结构域,提示这一新的蛋白质可能在细胞生长、黏附及细胞信号转导方面具有重要功能.结论:成功地克隆了人MGC39325基因全长ORF,构建了其pcDNA3.1(+)真核表达载体,为进一步研究其功能及其肿瘤中的作用创造了条件.
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克隆与健脾益气法有关的大鼠肝癌新基因
目的: 克隆健脾益气法明显下调基因中EsT片段cDNA的完整表达序列.方法: 从689个健脾益气法明显下调的基因中.采用电子克隆与PCR相结合的方法,克隆出有关EsT片段的cDNA完整表达序列.结果: 成功筛选出11个EsT片段的cDNA序列(G2、G4、G5、G6、G11、G14、G15、G16、G17、G18、G20),经进一步BLAST对比分析,证明G14、G15、G20 3个基因为新基因,并进行GenBank登录,登录号分别为DQ480745、DQ480746、DQ480747.结论: 本研究成功克隆出3个中医健脾益气法能明显调控的新基因cDNA序列.这为今后进一步深入观察这些基因的功能以及探讨不同中医治法的作用机制提供了良好的研究基础.
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肝癌差异表达基因EEG1的克隆和鉴定
目的:筛选和克隆肝癌和正常肝组织差异表达的基因片段,以探讨肝癌的发病机制.方法:应用mRNA差异显示技术(mRNA-DD),比较肝癌及正常肝组织基因表达的差异,对获得的差异基因片段进行克隆、测序,测序结果提交GenBank数据库中进行同源性分析,并对其中一条有明显差异的基因用半定量RT-PCR分析该基因在正常肝组织及肝癌组织中的表达情况.结果:凝胶扫描显示在500-600 bp处有一条差异片段,差异条带经酶切图谱分析证实重组质粒是目的克隆,将片段测序结果与GenBank数据库进行同源性比较发现该片段与已知基因EEG1高度同源(99%).RT-PCR结果显示在肝癌组织中EEG1 mRNA的表达水平明显低于正常肝癌组织(P=0.001).结论:EEG1基因在肝癌组织中的表达明显低于正常肝组织,提示EEG1基因的表达下调可能与肝癌的发病有关.
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真核绿色荧光蛋白表达载体pEG FP-C1/PAK-1的构建及其在结直肠癌SW480细胞内的表达
目的:构建重组p21-activated kinase-1(PAK1)基因绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C l/PAKl,并转染入结直肠癌细胞SW480中表达.方法:在南方医科大学附属南方医院消化研究所实验室,从人类结直肠癌细胞株SW620细胞提取总RNA,经逆转录聚合酶链式反应获得人PAK1 cDNA片段,经过限制性内切酶进行酶切,T4连接酶进行连接,将目的基因克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-Cl上,然后转染结直肠癌细胞株SW480,观察其在细胞中表达.结果:重组载体经限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列分析验证,显示插入载体的序列与目的基因一致,而且该重组载体能够在SW480细胞中表达.结论:成功构建了真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-Cl/PAKl,为研究PAK1在结直肠癌中的生物学功能奠定了基础.
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丙型肝炎病毒锤头结构核酶的细胞内免疫
目的:探讨预先转染丙型肝炎病毒(HCV)核酶(Rz213)的人肝癌细胞对HCV再转染的抑制作用.方法:应用从前构建的HCV锤头结构Rz(Rz213),通过脂质体介导的基因转染方法,转染人肝癌细胞(HHCC),经G418筛选转染Rz213的基因克隆,应用luc报告基因的表达活性,观察该细胞克隆对靶基因(pCMVNCRluc)转染的抑制作用.结果:G418 筛选能使 Rz213 在转染细胞内有效表达 RzRNA,转染Rz的多克隆细胞能有效地阻断靶基因的再转染.结论:我们构建的Rz213真核表达载体能在HHCC细胞内有效表达,预先转染发挥细胞内免疫作用,可防止HCV感染.
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乙型肝炎病毒全S蛋白反式激活蛋白1基因的克隆化
目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆乙型肝炎病毒(HBV)全S反式激活新型靶基因,进一步阐明HBV感染相关疾病的发病机制.方法:以HBV全S蛋白表达质粒pcDNA3.1(-)-全S转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA逆转录为cDNA,经RssI酶切后将实验组cDNA分成2组,分别与2种不同的接头衔接,与对照组cDNA进行二次杂交和二次PCR.并结合生物信息学技术,克隆HBV全S反式激活作用的新型靶基因.结果:对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段.成功克隆出他的全长序列并测序证实,其可以被全S蛋白反式激活,故命名为全S反式激活蛋白1(CSTP1),已在GenBank中注册,注册号:AY553877.CSTP1基因的编码序列全长为945个核苷酸(nt),编码产物由315个氨基酸残基(aa)组成.结论:HBV全S蛋白具有反式激活蛋白l基因克隆成功.HBV全S反式激活新靶基因的发现,为进一步研究HBV全S的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础.
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HCV干扰素敏感决定区"基因盒"的构建,体外表达及功能探讨
目的:构建对干扰素敏感和不敏感的丙型肝炎患者的干扰素敏感决定区(ISDR)基因;在体外表达含ISDR的丙型肝炎病毒(HCV)NS5A蛋白,探讨表达的NS5A蛋白是否通过ISDR与干扰素诱导的RNA蛋白激酶(PKR)结合来影响干扰素的抗HCV作用.方法:采用合成寡核苷酸,PCR,分子克隆等方法构建ISDR基因"盒",包括3个对干扰素敏感的丙肝患者ISDR及1个对干扰素耐受的丙肝患者ISDR,将含不同ISDR的NS5A基因克隆进原核表达载体PRSET,转染BL21(DE3)细胞后由IPTG诱导表达,获得蛋白过柱纯化及透析去掉高盐后,与经体外转录和翻译系统获得的PKR进行蛋白结合试验.结果:经测序证实获得4个不同ISDR基因,包括1个对干扰素不敏感基因和3个对干扰素敏感基因;体外表达的含ISDR的NS5A蛋白约58 000,体外试验初步证实,无论对干扰素敏感或不敏感的ISDR均可与PKR结合.结论:体外构建的含不同ISDR的NS5A蛋白能在原核细胞系统中获得较好表达;研究显示,ISDR影响干扰素抗病毒作用可能不是由ISDR与PKR直接结合导致的.
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人源性大肠癌抗原基因的SEREX筛选
目的:寻找人源性大肠癌相关抗原基因.方法:构建3个以入Tripl Ex2噬菌体作载体的大肠癌抗原cDNA表达文库,用自体或异体大肠癌患者血清应用SEREX方法进行免疫筛选.用平板法扩增阳性克隆噬菌体,提取纯化DNA,用SfiI酶切和PCR鉴定插入片段的大小.结果:构建成3个大肠癌抗原cDNA噬菌体表达文库,滴度分别为2.39×106nfu/L,2.07×106nfu/L和1.86×106nfu/L,插入片段长度为0.5-4kb,平均分别为1.4kb,1.6kb和1.3kb.筛选发现4个阳性克隆,插入cDNA片段大小分别为2.4 kb,1.8 kb,2.3 kb和2.2 kb.结论:用SEREX方法筛选大肠癌抗原cDNA表达文库,可获得有价值的大肠癌的重组抗原基因克隆,将有利于大肠癌的早期诊断和重组疫苗的研究.
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凝胶内长片段基因克隆的实验方法研究
目的 量少、片段长的目的基因受纯化回收效率低的影响而难于克隆,本实验的目的是探索快速高效克隆量少,片段长DNA的实验方法.方法 以lncRNAAL110200 5'RACE大片段PCR产物为目的基因,应用高纯度、高分辨率的低熔点琼脂糖,分离得到含5.0 kb和2.0 kb的凝胶,直接用于连接和转化反应,通过克隆PCR和Sanger测序法鉴定克隆的正确性.结果 经测序验证了5.0 kb和2.0 kb重组克隆的正确性,说明应用高纯度的低熔点琼脂糖凝胶可以快速克隆长达5.0kb基因片段.结论 该方法是一种省时、高效、易行的长片段基因克隆方法.
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细胞色素P450 4F2基因的克隆、突变、表达和纯化
目的 构建人细胞色素P450 4F2基因野生型、V81G和V433M突变型表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化出CYP4F2蛋白.方法 用RT-PCR方法从人肾脏总RNA中逆转录扩增CYP4F2,将其插入克隆载体pMD18-T Simple Vector中,将测序鉴正确的CYP4F2基因N、C端改造,克隆构建重组表达载体pCWori+-CYP4F2(His)4-WT.同时采用重叠PCR定点突变法构建pCWori+-CYP4F2 V81G(His)4和pCWori+-CYP4F2 V433M(His)4表达载体,分别转化至E.Coli XL-Blue中表达.结果 经IPTG诱导可有效表达CYP4F2和突变体V81G与V433M,经Western blot分析可以观察到分子量为57 kD的诱导表达条带,该表达蛋白可与His-Probe多克隆抗体起特异反应.用His-bind亲和层析纯化得到了纯度较高的His融合蛋白.结论 用基因工程技术在大肠杆菌中有效表达人CYP4F2基因野生型、V81G和V433M突变型蛋白、并得到了纯度较高的CYP4F2蛋白,为进一步研究其生物学功能及研制相应抗体奠定了基础.
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人Calcineurin B基因克隆、表达和纯化
目的:构建人Calcineurin B(CnB)基因表达载体,在大肠杆菌中高效表达并纯化Calcineurin B蛋白.方法:用RT-PCR方法从人胎脑总RNA中反转录扩增Calcineurin B,将其插入克隆载体pGEM-T-easy中,测序鉴定阳性克隆,并将鉴定正确的Calcineurin B亚克隆至表达载体pET-32b(+),构建重组表达载体pET-CnB.结果:阳性重组子在大肠杆菌BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS中,经IPTG诱导可高效表达Calcineurin B,经15%SDS-PAGE分析可观察到分子量与理论值相符(39kD)的诱导表达条带,并发现Calcineurin B主要以可溶性形式表达.Western blot结果证实,39kD的表达条带可与抗硫氧还蛋白的单克隆抗体起特异反应.用His-bind亲和层析纯化得到了纯度较高的calcineurin B融合蛋白.结论:用基因工程技术在大肠杆菌中高效表达人calcineurin B,并得到了纯度较高的calcineurin B融合蛋白,为进一步研究其生物学功能及研制calcineurin B单克隆抗体奠定了基础.
关键词： Calcineurin 基因克隆 表达 纯化 -
结核分支杆菌Hsp70和Hsp 65 DNA疫苗免疫原性比较研究
分支杆菌热休克蛋白(Hsp)既有增强免疫应答的作用,又保持了分支杆菌本身的抗原特性.我们采用分子生物学技术,将结核分支杆菌Hsp70基因克隆到真核表达质粒pcDNA3中,构成裸露DNA疫苗(DNA70).采用英国Lowrie教授赠送的Hsp65 DNA疫苗和本室构建的Hsp70 DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,然后观察其对小鼠免疫应答的影响,探讨两种疫苗的抗感染机制及比较两种疫苗的免疫原性.
