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HBV全基因核心蛋白变异株稳定表达载体的构建及其抗原表达
通过定点突变技术将HBV质粒p3.8Ⅱ构建成核心蛋白变异株V60和L97.经序列测定和生物学活性检测后,亚克隆入EB病毒稳定表达载体.重组载体分别作内切酶酶切鉴定和序列测定证实,用脂质体介导转染HepG2细胞稳定传代,定量测定各株培养上清HBV抗原表达.结果发现,3株HBsAg含量S/N值接近,变异株HBeAg含量S/CO值低于野生株.上述3种重组载体的构建可为体外研究HBV核心蛋白热点变异与致病的关系提供基础.
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乙型肝炎病毒C基因G87变异对宿主细胞HLA-Ⅰ表达的影响
目的探讨HBV C基因G87变异对宿主细胞表面HLA-I表达的影响. 方法采用定点突变技术和亚克隆技术,将HBV野生型基因组质粒构建为C基因G87变异株表达载体(EBO-G87)和野生株表达载体(EBO-WT),以脂质体技术分别转染HepG2细胞,转染细胞经 FITC标记的鼠抗HLA-ABC mAb染色,流式细胞术测定细胞表面HLA-I的表达.结果构建的EBO-G87和EBO-WT重组载体经内切酶双酶切鉴定及核苷酸序列测定证实.HepG2细胞表面HLA-I表达的平均荧光强度,EBO空载体转染的细胞为2.3,EBO-WT转染的细胞明显增强至18.8,EBO-G87转染的细胞增至10.5. 结论 2株HBV上调HLA-I表达强度不同,C基因G87变异可使宿主细胞表面的HLA-I表达水平发生改变.
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改良法对NSCLC患者癌组织及外周血K-ras基因常见突变位点的检测
目的 建立改良的酶切富集PCR-焦磷酸测序技术,检测非小细胞肺癌(NSCLC)患者癌组织与血浆中K-ras基因的突变情况.方法 配对提取43例NSCLC患者的癌组织和血浆DNA,采用酶切富集PCR-焦磷酸测序技术检测K-ras基因第2外显子12及13密码子点突变,利用混合突变/野生型K-ras基因的细胞系(A549/HCC827)测定该方法的灵敏度.结果 NSCLC患者癌组织中K-ras突变率为9.3％(4/43),血浆中K-ras突变率为7.0％(3/43),均为12密码子突变,突变一致性达75％.混合细胞系检测显示,酶切富集PCR-焦磷酸测序技术的检测灵敏度达0.1％.结论 酶切富集PCR-焦磷酸测序技术具有快速、准确、灵敏度高等优点,可用于临床NSCLC患者K-ras突变的筛查.
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PRL-3基因C104S位点突变体和CAAX缺失体的构建及表达
目的:分别构建肝再生磷酸酶-3(phosphatase of regenerating liver 3,PRL-3)基因C104S位点突变和C端CAAX缺失的myc标签和GFP荧光标签重组质粒pcDNA3-myc-PRL-3(C104S)、pEGFP-PRL-3(C104S)、peDNA3-myc-PRL-3(△CAAX)和pEGFP-PRL-3(△CAAX),并进行真核表达,为PRL-3的后续功能研究提供有效的工具.方法:设计PRL-3基因C104S点突变、c端CAAX缺失的特异性引物,以peDNA3-myc-PRL-3质粒为模板,通过基因克隆、一步法点突变的方法构建各重组质粒,通过酶切和测序鉴定后转染真核细胞,检测其在细胞中的表达并观察定位情况.结果:成功构建了4种重组质粒,并能在结肠癌细胞LoVo中表达.用激光共聚焦扫描显微镜对细胞中绿色荧光融合蛋白的定位观察发现,当PRL-3的CAAX位点缺失后,PRL-3由内膜系统大量入核,与理论预期相符.结论:获得了PRL-3基因C104S位点突变体和CAAX缺失体重组真核表达质粒并能在细胞中表达,为进一步研究PRL-3的功能提供了条件.
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K-ras 基因第1外显子点突变与37例子宫内膜癌临床情况的关系
目的:研究中国子宫内膜癌患者的瘤组织中K-ras基因第1外显子(含第12,13密码子)的突变率,以及突变与子宫内膜癌临床情况的关系,探讨K-ras基因突变在子宫内膜癌发生中的作用.方法:37例子宫内膜癌的石蜡和部分冰冻标本行PCR扩增K-ras基因第1外显子(含第12,13密码子),经PCR-SSCP银染法检测突变.结果:37例子宫内膜癌患者中有12例存在K-ras基因突变,突变率为32.4%(12/37例).FIGO分期Ⅲ期、组织类型为腺鳞癌的患者突变率较高,在细胞低分化、侵肌1/2以上和绝经后的患者中突变比例也较高.石蜡和冰冻组织标本结果一致.结论:K-ras基因突变率在日、美两国内膜癌患者中不同.该组患者中的突变率与日本相似,高于美国.说明此种差异不仅存在于日本和美国患者之间,可能也存在于亚洲人与北美洲人之间.不同的基因背景,生活条件及内源性和外源性雌激素作用可能对K-ras基因突变率有影响,并引起了不同的临床表现.
关键词： 子宫内膜肿瘤/遗传学 K-RAS 点突变 基因 RAS -
TNFβ的基因多态性在汉族SLE病人中的分布特点及与其他不同种族人群的比较
系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是一种较为常见的自身免疫性疾病,包括遗传因素在内的多种因素与SLE的发病相关.TNFβ的基因定位于MHCⅢ类基因座位内,它的第一内含子中含有单碱基点突变造成的基因多态性.由于转录起始位点下游第252位点的鸟嘌呤核苷酸G被腺嘌呤核苷酸A替代,使限制性内切酶NcoⅠ的识别序列发生变化,致使被腺嘌呤核苷酸A所替代的序列不能被NcoⅠ识别并切断.鸟嘌呤核苷酸G存在的基因称为TNFβ*1,腺嘌呤核苷酸A存在的基因称为TNFβ*2[1].由于TNFβ的重要生物学作用及其基因的特殊位置,TNFβ的基因多态性与SLE的发病之间的关系受到普遍的重视.
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肿瘤的遗传方式及基本研究策略
肿瘤与遗传是一个古老而复杂志的话题。当回答“肿瘤是否遗传”这一问题时，人们在认识上始终存在一些混淆。
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人重组粒细胞集落刺激因子突变体rhG-CSF-Ala-17的纯化及部分理化性质
目的:建立高效简便的人重组粒细胞集落刺激因子突变体rhG-CSF-Ala-17纯化工艺,并对其进行鉴定.方法:大肠杆菌表达的rhG-CSF-Ala-17经包涵体洗涤、变性复性后,采用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和Superdex75凝胶过滤层析分离纯化.经SDS-PAGE和FPLC检测纯度,并进行N端氨基酸序列分析、比活性分析、紫外大吸收光谱分析、内毒素检测等指标对其进行鉴定.结果:纯化后的rhG-CSF-Ala-17纯度可达99.64%,比活为1×108 U*mg-1.其N端19个氨基酸分析与预期序列一致,紫外大吸收光谱位于280 nm,氨基酸的组成与预期结果一致,内毒素含量低于部颁标准.结论:两步层析即可获得高纯度的rhG-CSF-Ala-17重组蛋白质,为进一步的rhG-CSF-Ala-17临床前和临床研究打下了基础.
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人TFAR19的定点突变及其重组蛋白的表达、纯化和功能分析
目的:了解凋亡相关新基因TFAR19编码蛋白分子中潜在的Ser100磷酸化位点与其促凋亡效应的关系.方法:利用重叠延伸PCR定点突变技术构建TFAR19 Ser100→Ala100突变体,用DNA测序技术验证,大肠杆菌表达,离子交换技术纯化重组突变蛋白,将其加入培养的白血病细胞株HL-60,通过PI染色,流式细胞仪分析,观察突变重组蛋白的促凋亡效应.结果:构建成TFAR19 Ala100突变体,并经DNA测序所证实,在大肠杆菌中获得了高水平表达,Western blot表明突变型重组蛋白与野生型具有相同的免疫学活性,流式细胞仪分析发现突变蛋白对撤除血清的HL-60细胞具有与野生蛋白相似的剂量依赖性促凋亡效应. 结论:TFAR19 分子中潜在的Ser100磷酸化位点对其促凋亡效应无影响,提示TFAR19发挥其生物学活性时无需cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶活化.
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线粒体遗传病
线粒体病(mitochondriopathy)是指因遗传缺损引起线粒体代谢酶的缺陷，导致ATP合成障碍、能量来源不足而出现的一组多系统疾病，也被称为线粒体细胞病(mitochondrial cytopathy)［1，2］。 一、病因和发病机制 线粒体病主要由mtDNA(mitochondrial DNA)的突变造成，包括点突变、缺失、重复及丢失等。迄今为止，共发现50余种病理性mtDNA点突变及数百种重排方式，同一种mtDNA突变对于不同患者可造成不同的临床表现［3］。与线粒体疾病相关的核DNA损害包括：编码线粒体蛋白质的基因突变；蛋白质进入线粒体的障碍；基因组间的通讯障碍。 二、临床表现 从遗传学角度看，由于线粒体基因组只控制线粒体中一部分蛋白质的合成，而大多数蛋白质的合成由核DNA调控，因此线粒体疾病的遗传方式有2种，即母系遗传和孟德尔遗传。另外，尚有许多病例为散发性。 线粒体病的病变如以侵犯骨骼肌为主，称为线粒体肌病；如病变除侵犯骨骼肌外，尚侵犯中枢神经系统，则称为线粒体脑肌病；如病变以侵犯中枢神经系统为主，则称为线粒体脑病。另外，尚有大量中间类型。目前还发现帕金森病、2型糖尿病、心肌病及衰老等也与线粒体功能障碍有关。随着检查技术的进展，将会发现更多的线粒体病。
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人类血型（第3版）
自诺贝尔奖得主卡尔·兰德斯坦纳在上世纪初发现ABO血型系统以来，人们对于血型的探索从未止步。近年来分子生物学和遗传学的进展，更是将人类对于自身血型的认识推至了一个全新的高度：截至今日，绝大多数决定血型的基因都已被克隆并测序；对于血型的诸多复杂血清学表现已有了基因层面的理解，诸如点突变等。
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福建畲族男性线粒体DNA11719遗传多态性
为研究福建畲族男性线粒体DNA11719遗传多态性,用聚合酶链式反应和DNA测序等方法对30例福建畲族男性线粒体DNA进行检测分析,结果表明30例线粒体DNA均存在11719位点G→A变异,由此推论线粒体DNA11719G→A变异可能是福建畲族常见的一种遗传多态性.
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WWOX基因、p53基因与食管癌的研究现状
许多研究表明WWOX(WW domain containing ox-idoreductase)基因,与p53基因的点突变、缺失与下调及蛋白表达异常在多种肿瘤,如乳腺癌、多发骨髓瘤、前列腺癌、卵巢癌、肺癌及食管癌中频发出现,对这些肿瘤的发生和进展过程中起着关键性的作用.因此探讨WWOX、p53基因的结构及功能对阐明肿瘤的发病机制具有重要的意义.本文就WWOX基因、p53基因与食管癌的研究现状做一综述.
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白色念珠菌对氟康唑的耐药性研究进展
近10余年来,随着器官移植的普遍开展,恶性肿瘤,艾滋病(AIDS)的不断增多,大量使用广谱抗生素,免疫抑制剂,类固醇药物,抗癌的放疗与化疗,深部真菌病,尤其是因白色念珠菌感染所致的深部真菌病逐年增加.氟康唑是目前用于治疗深部真菌病的重要抗真菌药之一,从1988年上市以来,因具有吸收好,抗真菌谱广及毒性小等特点,在临床上得到了广泛应用并取得了良好的治疗效果,但因氟康唑仅具抑菌作用,因此疗程需较长,渐导致耐药真菌的增多,造成了沉重的经济负担及资源浪费.许多学者对此进行了深入研究,现将白色念珠菌对氟康唑的耐药性研究综述如下.
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基因打靶技术研究及其应用
基因打靶技术是20世纪80年代发展起来的新技术,是一种利用DNA同源重组原理和胚胎干细胞(embryonic stemcells,ESCs)技术按定向组合的方式改变生物活体遗传信息的实验手段,具有定位性强、打靶后新的基因随染色体DNA稳定遗传的特点[1],其方法包括基因敲除、基因敲入、点突变、缺失突变、染色体组大片段删除等,相关的基因工程技术包括转基因、基因沉默和基因捕获等.
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成人线粒体神经胃肠型脑肌病2例护理
线粒体脑肌病（ME）是一组因线粒体DNA发生缺失或点突变，线粒体结构或功能异常导致呼吸链乃至整个能量代谢过程紊乱的临床异源性多系统疾病，以脑和肌肉受累严重[1]。根据不同的临床表现将其分为不同的临床综合征。线粒体神经胃肠型脑肌病（MNGIE）是一组以胃肠道症状、恶病质、周围神经病、眼外肌麻痹、白质脑病为表现的线粒体病[2]。目前，ME伴高乳酸血症、卒中样发作和Leigh型线粒体脑肌病国内常有报道，但MNGIE报道少见。我院2013年1月至2015年2月诊治MNGIE 2例，报道如下。
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小鼠模型与人类疾病(续)
小鼠基因组的控制改造：基因敲除 由于建立小鼠疾病模型的能力在技术开发方面有了很大的进展，使我们能够向内源基因引入特定的突变，并通过小鼠的生殖系传递下去[2,32]。所需变异首先通过同源重组，引入胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)，然后将ES细胞注射到胚囊中。ES细胞在注入胚囊后可形成各种细胞谱系。几乎所有的变异都可引入小鼠基因，包括将基因功能全部去除的全突变(null)，或其他点突变。此还可造成复杂的染色体重组如大区域缺失、转位及倒位[33-38]。一旦某个人类疾病基因被克隆得到，很容易组建一个在相应基因中有相同突变的小鼠。这样组建的许多小鼠，它们与病人的表型虽然未必完全一样，但非常相似。这些小鼠即可作为人类疾病很好的模型。
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10例MELAS综合征中线粒体DNA A3243G点突变的检测
目的对10例MELAS型线粒体脑肌病患者进行线粒体DNA A3243G点突变的检测。方法 用PCR-限制性内切酶分析法(restriction analysis)，检测10例MELAS患者及其8名母系亲属的肌肉和/或外周血细胞中有无mtDNA的A3243G点突变，并进行突变型mtDNA的定量。结果 在10例患者的肌肉和/血细胞中，均检测到A3243点突变。突变型mtDNA的比例在血细胞(7例)中为10.8%-47.8%，在肌肉(5例)中为39.4%-67.7%。有2例患者同时进行了肌肉和血细胞标本的检测，突变型mtDNA的比例肌肉组织均高于血细胞。在血细胞中，年轻患者的突变型比例通常较高。在1个家系中可证实为母系遗传。但在3例先证者的母亲及2例先证者的同胞均未检测到此突变。 结论 10例MELAS综合征患者均携有mtDNA A3243G点突变。在6个家庭中，只有1个家庭可证实为母系遗传，另外5个家庭中此突变可能为散发性，提示在中国人MELAS的发病机制中，mtDNA A3243G点突变为新生突变的居多。
关键词： MELAS型线粒体脑肌病 线粒体疾病 点突变 -
线粒体脑肌病患者骨骼肌mtDNA点突变与临床类型的研究
目的探讨线粒体脑肌病患者骨骼肌mtDNA在3243及8344位点点突变与发病类型的关系。方法提取患者骨骼肌中的DNA，以两对寡核苷酸为引物行PCR扩增，分别应用BglⅠ和ApaⅠ酶切后，琼脂糖电泳判定。结果 2例患者nt3243位点出现A→G点突变，其中为MELAS和MERRF各一例；2例MERRF患者nt8344位点出现A→G点突变，其中1例同时存在着3243位点突变。结论 nt3243及nt8344位点突变分别与MELAS 和MERRF的发病有关。1例MERRF患者同时存在上述2个位点的突变,这可能与线粒体脑肌病临床表现多样化有关。
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MELAS综合征线粒体基因组G14453A突变分析
目的 分析1例MELAS综合征线粒体基因组突变情况.方法 2012年11月北京大学第一医院儿科临床拟诊为MELAS的1例男性患儿,详细收集该患儿临床资料,排除常见线粒体点突变(如A3243G、A8344G、T8993G/C、G13513A等)后,应用聚合酶链式反应-直接测序法分析16.6 kb的线粒体基因组全序列,并应用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)对突变进行验证.结果 经线粒体基因组全测序后,在患者的外周血和尿沉渣线粒体DNA (mtDNA)均检测出G14453A点突变,父母及100名健康对照的外周血mtDNA未发现携带此突变.经PCR-RFLP方法验证,患者外周血mtDNA中G14453A突变比例为56.8％,尿沉渣mtDNA中G14453A突变比例为72.5％.患者线粒体呼吸链复合物Ⅰ活力降低,为67.6 nmol·min-1·mg-1.参考www.mitomap.org网站及NCBI数据库,本例mtDNA G14453A突变所致MELAS综合征为国内首次报道.结论 G14453A突变是导致MELAS综合征的致病突变之一,发病机制有待进一步研究.
