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线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作的临床研究进展
线粒体病是一组与线粒体氧化磷酸化功能异常相关的遗传代谢性疾病.其中线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作(MELAS)是常见的类型[1].其标志性的临床表现为卒中样发作,多同时伴随其他系统损害.辅助检查可以发现血乳酸酸中毒,MRI检查多显示大脑后部皮质和皮质下白质的灶性损害.肌肉病理检查发现不整红边纤维(RRF)、琥珀酸脱氢酶深染的肌纤维(RBF)和微血管.多数患者的基因检查可以发现mtDNA A3243G点突变.
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阿尔茨海默病患者NQO1基因与apoE基因关联性分析
近年研究发现,阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)的发病可能与自由基生成增加有关.NAD(P)H:醌氧化还原酶(NQO1)是一种黄素酶,可催化醌双电子还原,使氧自由基的生产减少.NQO1基因609位点的C→T点突变可导致该酶的活性缺乏,使氧自由基生成增加.为探讨NQO1基因609位点C→T点突变产生的多态性与散发性阿尔茨海默病(SAD) 发病关系及其与apoE基因多态性的相互作用,我们对SAD患者的apoE基因、NQO1基因多态性及其相互作用进行了研究.
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细胞色素C氧化酶1基因T6253C点突变致线粒体脑肌病伴有高乳酸血症和卒中样发作综合征一例
目的 报道1例33岁男性,头痛后继以卒中样发作,影像学提示基底节区和颞枕叶缺血性改变,肌肉活检证实线粒体结构和功能异常的患者的基因突变.方法 我们应用基因分析未发现常见致病性突变,因此应用DNA芯片扫描线粒体基因全序列,寻找可能的致病突变.通过DNA芯片扫描线粒体基因全序列,应用直接测序法证实突变.结果 在线粒体DNA共发现了3个新突变,其中T6253C突变导致细胞色素C氧化酶1第117位保守的蛋氨酸被苏氨酸取代,患者的母亲也携带相同的突变,而98名健康个体无人携带此突变,我们认为T6253C是导致该患者发病的致病突变.结论 这是首例关于细胞色素C氧化酶1基因点突变导致线粒体脑肌病伴有高乳酸血症和卒中样发作综合征的报道.
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线粒体脑肌病伴高乳酸血症和脑卒中样发作综合征一家系临床特征及线粒体基因A3243G位点点突变异质性水平
目的 调查1个疑似患有母系遗传性线粒体脑肌病伴高乳酸血症和脑卒中样发作(MELAS)综合征家系的临床表现、生物化学检测数据和影像学资料,并探索其与血细胞线粒体基因突变异质性水平的关联性.方法 收集先证者和11位其母系家系成员的一般情况、抽搐及脑卒中样发作等病史,检测家系成员的血常规和运动前后血浆乳酸水平等生化指标,并做头颅磁共振检查.用聚合酶链反应(PCR)-限制性内切酶片段长度多态和DNA测序法检测其成员是否存在线粒体基因组A3243G点突变,并用荧光实时定量PCR定量该突变的水平.结果 该家系部分成员存在抽搐、脑卒中样发作和高乳酸血症等MELAS综合征典型症状,以及身材矮小、运动不耐受和发热、偏头痛等非典型症状.发作期头颅磁共振成像符合MELAS综合征的典型特点,且普遍存在小脑萎缩.母系亲属均存在线粒体基因的A3243G位点点突变,突变异质性水平越高,症状越典型且严重.结论 该调查家系确诊母系遗传性MELAS综合征,其致病基因为线粒体A3243G点突变.外周血血细胞线粒体基因突变异质性水平与亲缘关系、抽搐早现性和血乳酸值等临床表型存在相关性.
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线粒体DNA A3243G点突变在成年患者中的临床特点
目的 探讨mtDNA A3243G点突变在成年患者的临床表现特点.方法 对发病年龄在18岁以上的36例患者的临床资料进行分析(5个家系28例,散发8例),其中23例行mtDNAA3243G点突变检查(5个家系15例,散发8例),14例行头颅影像学检查,10例进行了骨骼肌病理检查.结果 5个家系的28例患者中出现糖尿病17例(60.7%)、耳聋16例(57.1%)、卒中样发作9例(32.1%),三者可以并存或单独出现,少见表现包括心肌病和肾脏损害.23例mtDNA A3243G点突变患者中线粒体脑肌病伴随乳酸血症和卒中样发作(MELAS)14例(61.0%),其主要表现为认知功能障碍、言语障碍和头痛;其余9例包括无症状的基因突变携带者3例(13.0%)、线粒体糖尿病和(或)神经性耳聋2例(8.7%)、自主神经功能异常2例(8.7%)、糖尿病伴不孕症1例(4.3%)和心肌病1例(4.3%).14例MELAS患者的头颅影像学检查显示以枕叶和颞叶受累为主,额叶少;10例肌肉病理检查发现9例存在不整红边纤维.mtDNA A3243G点突变比例均值在MELAS患者为28.75%±13.69%,非MELAS患者为25.08%±11.54%,两者差异没有统计学意义.结论 mtDNAA3243G点突变在成年患者主要累及中枢神经、胰岛以及听神经.认知功能障碍、言语障碍和头痛是成年MELAS的主要临床表现.家族中多例患者出现糖尿病和耳聋,提示该突变并非MELAS突变,应当关注mtDNA A3243G点突变家系中非MELAS患者的存在.
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散发性帕金森病Parkin基因突变检测
日本学者发现家族性青少年型帕金森病(AR-JP)存在Parkin基因外显子缺失,其他学者相继报道了AR-JP及早发帕金森病(EOPD)家族存在Parkin基因新的外显子缺失及点突变.Parkin基因及蛋白功能研究表明,Parkin基因突变可能在部分家族性帕金森病发病中发挥重要作用.
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五例狭颅症患儿的基因学研究
目的 对中国籍汉族狭颅症患儿进行临床分子诊断,以发现相关致病基因.方法 运用高通量测序技术对2014年2月到2015年1月上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心神经外科收治的5例狭颅症患儿进行外周血有核细胞基因全外显子组测序(WES),对所得数据进行生物信息学分析,并使用Sanger测序对WES发现的基因相关突变进行验证.结果 2例患儿上皮-间充质转变调控因子TWIST1基因的1号外显子分别存在一个杂合的错义变异:c.528C＞G,p.Ser176Arg和c.487C＞T,p.Leu163Phe;而另外3例患儿各存在1个成纤维细胞生长因子Ⅱ型受体(FGFR2)基因的杂合错义变异,其中2个位于7号外显子(c.755C ＞G,p.Ser252Trp和c.833G＞T,p.Cys278Phe),1个位于8号外显子(c.1 012G＞C,p.Gly338Arg).结论 借助于高通量DNA测序技术并结合临床特征,2例被诊断为TWIST1基因突变导致的Saethre-Chotzen综合征,2例被诊断为FGFR2基因突变导致的Crouzon综合征,另1例被诊断为FGFR2基因突变导致的Apert综合征.基因学研究有助于临床特征不显著的狭颅症患儿的确诊,可为狭颅症的诊断及分型提供依据.
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线粒体DNA突变与非综合征感音神经性聋
目的分析非综合征感音神经性聋(non-syndromic sensorineural hearing loss,NSSNHL)患者及听力正常者中3种线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)突变的发生频率,探寻mtDNA突变在NSSNHL发病中的可能作用.方法收集年龄从3～84岁的61例散发的NSSNHL病例,6～68岁的19例听力正常人外周血,提取白细胞DNA,结合应用中断法聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)及引物交换PCR方法检测mtDNA4977缺失,应用PCR方法及限制性片段长度多态性分析检测mtDNA1555A→G和mtDNA3243A→G点突变, PCR产物以全自动激光荧光测序仪做序列分析.结果①耳聋组及对照组的mtDNA4977缺失检出率(缺失例数/总例数)分别为68.85%(42/61)及5.26%(1/19);②所有样本均未检出mtDNA1555A→G 及mtDNA3243A→G点突变.结论 NSSNHL组mtDNA4977缺失发生频率明显高于听力正常组,提示mtDNA4977缺失可能是NSSNHL患者发病的一个重要的作用因素;mtDNA1555A→G点突变、mtDNA3243A→G点突变在NSSNHL患者中不常见.
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SLC26A4基因IVS7-2A＞G突变在中国不同地区和民族重度感音聋患者中分布频率的观察
目的 进行全国范围的SLC26阿A4基因IVS7-2 A＞G突变的分子流行病学调查,为大前庭水管综合征的快速筛查和临床基因诊断提供证据.方法 应用自主研制的SLC26A4基因IVA7-2A＞G突变检测试剂盒对来自全国不同省市的1979例散发的非综合征性聋患者进行IVS7-2A＞G突变筛查,比较不同地区、民族的IVS7-2 A＞G突变携带频率.结果 在中国大陆不同地区1979例耳聋患者中发现SLC26A4 IVS7-2A＞G纯合突变90例,杂合突变155例,总的携带率12.38%.不同地区间的携带率比较差别有统计学意义(χ2=34.4899,P＜0.05),华中地区高,西南地区低;不同民族比较差别有统计学意义(χ2=35.4456,P＜0.05),汉族携带率高为13.88%,藏族低携带率为0.不同民族间的两两比较汉族与我国西部地区的少数民族比较差别有统计学意义,西部地区少数民族之间比较差别无统计学意义.结论 中国非综合征性聋患者中IVS7-2A＞G突变携带率相当高,中国不同地区、民族间SLC26A4基因IVS7-2 A＞G突变可能存在明显的差异,SLC26A4的基因诊断可作为大前庭水管综合征的快速筛查方法.
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Pendred综合征基因热点突变筛查赤峰市聋哑学校大前庭水管综合征患者
目的利用基因筛查方法调查赤峰地区聋哑儿童Pendred综合征(Pendred's syndrome,PDS)基因(SLC26A4基因)热点突变的发生频率,并通过颞骨CT检查证实基因筛查诊断大前庭水管综合征的可行性.方法调查对象来自赤峰市聋哑学校学生141例.所有受检患者均采集外周血并提取DNA,以序列分析方法检测PDS基因IVS7-2位点的A-G突变情况,发现PDS基因IVS7-2 A-G纯合或杂合突变均回访,进一步行颞骨CT检查以及甲状腺B超和甲状腺功能检查,进行基因筛查结果和颞骨CT检查结果的比较分析.结果PDS外显子7+8序列分析结果显示共有20例聋哑学生具有IVS 7-2 A-G突变.9例为纯合突变,1例为杂合突变.回访时除2例患者因健康原因未进行复查,其余18例聋哑学生接受颞骨CT检查,其中16例患者CT证实为典型的前庭水管扩大.16例患者甲状腺B型超声波显示6例患者甲状腺略大于正常,但无明显临床意义,甲状腺功能检查均未见明显异常.结论通过PDS基因热点突变的筛查可以发现大前庭水管综合征患者,基因筛查是辅助此病诊断的新型手段,此项技术在大规模耳聋患者的病因学筛查方面具有一定的优势.
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淮阴A1555G突变相关耳聋核心家系成员的连接蛋白26基因突变分析
目的探讨连接蛋白26(connexin 26, Cx26)基因是否是江苏淮阴A1555G突变相关母系遗传聋家系的核修饰基因.方法采用聚合酶链反应-限制片断长度多态性分析 (PCR-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP) 和测序技术,对江苏淮阴A1555G突变相关母系遗传非综合征型聋核心家系中的26例母系成员和62例对照(包括2例父系亲属、10例配偶对照和50例当地无关对照)的Cx26基因编码区序列进行了研究,并根据孟德尔遗传规律构建了家系成员Cx26基因的单体型图.结果在26例母系成员中共发现4处杂合性碱基变化,分别为79G→A 、109G→A、341G→A 和235delC.其中,前3种为已知多态性差异,而235delC为已知的可引起常染色体隐性聋的致病突变.但235delC突变仅存在于1例具有中度聋表型的母系成员和其2例听力正常的子女中,并不与耳聋表型共分离.而根据遗传规律,推测该突变来源于1例配偶对照,为外来突变;同时,根据4个位点变化构建的Cx26基因单体型图也未揭示Cx26基因与A1555G突变致聋有任何相关性;另外,在62例对照中也发现1例235delC杂合性缺失突变.结论 235delC 杂合性突变并不加重A1555G突变的致聋效应;Cx26基因也不是江苏淮阴母系遗传聋家系A1555G突变的核修饰基因.
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中国Y连锁遗传性聋DFNY1家系POU3F4基因突变的检测
目的进行Y连锁遗传性聋(Y-linked hereditary hearing impairment)家系的候选基因--POU3F4基因的突变分析.方法在POU3F4基因的全部编码序列设计5对引物进行聚合酶链反应 (polymerase chain reaction,PCR)扩增反应.应用PCR-单链构像多态性(single-strand conformation polymorphism SSCP)方法对DFNY1家系中的43名成员进行突变检测及鉴定.结果POU3F4基因的5对引物均有较好的扩增效果,PCR-SSCP的多态性分析显示所有家系成员在POU3F4基因中均未检测到多态及突变. 结论本研究通过对一个位于X染色体与Y染色体存在同源交换区域的耳聋基因POU3F4基因的检测排除了该基因易位到Y染色体导致DFNY1家系耳聋的可能性,说明中国Y连锁遗传性聋家系的致病基因更多可能是位于Y染色体上的基因突变所致.
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中国不同地区和种族重度感音神经性聋群体热点突变的分布和频率研究
目的 调查中国各地区聋哑人群的缝隙连接蛋白β2基因(gap junction beta-2 gene,GJB2)235delC突变的流行和分布情况,为在中国进行准确有效的耳聋基因诊断工作提供流行病学数据和经验.方法 收集来自中国26个地区的3004例非综合征型聋患者以及368例汉族健康对照和98例维吾尔族健康对照,应用多聚酶链扩增-限制性酶长度多态性技术进行235delC突变筛查.结果 总计有488例(16.3%)患者带有至少一个235delC突变等位基因,其中233例(7.8%)纯合突变,255例(8.5%)杂合突变,比较各地区耳聋人群的情况,235delC纯合突变的频率从0%到14.7%,235delC杂合突变的频率从1.7%至16.1%.结论 调查结果显示,相对于其他亚洲人群,中国的非综合征型聋人群具有较高的235delC突变频率.本研究结果显示针对GJB2 235delC突变简易快速的检测方法将可以为广大的中国耳聋群体服务,仅通过扫描这一常见突变,在某些地区高达15%的患者可以因鉴别为纯合突变型获得确诊,而235delC杂合型患者和阴性患者则应进一步进行GJB2全部编码序列和其他耳聋相关基因分析.
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Leber遗传性视神经病少见mt-DNA原发突变位点研究
目的 探讨中国人Leber遗传性视神经病(LHON)患者少见线粒体DNA(mt-DNA)原发性突变位点.设计临床研究.研究对象 常见线粒体DNA原发突变位点阴性的可疑LHON患者和正常人.方法 采集临床诊断LHON患者的外周血,提取总DNA,聚合酶链反应(PCR)扩增和DNA直接测序的方法,进行mt-DNA G11778A、G3460A和T14484C突变位点筛查,对于以上3个突变位点均阴性的患者和正常对照组进行mt-DNA片段3962～4356和11320～11789扩增、测序,采用NCBI的BLAST服务,与剑桥标准序列进行比对,分析LHON患者是否携带C4171A或G11696A突变位点.主要指标 mt-DNA测序结果.结果 共收集临床诊断LHON患者56例,44例患者为3个常见位点之一为阳性(G11778A阳性36例,G3460A阳性3例,T14484C阳性5例),3个常见原发突变位点均为阴性患者12例,其中1例患者携带C4171A突变,未发现G11696A突变位点.正常对照组25例,未发现G11696A、C4171A突变位点.结论 C4171A突变位点可能是中国人LHON患者少见原发突变位点.
关键词： Leber遗传性视神经病 线粒体DNA 点突变 -
两个慢病毒真核表达载体pEGFP-N1-HIF-1α和pEGFP-N1-muHIF-1α的构建及检测
目的 构建低氧诱导因子1 α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)基因(野生、点突变)的两个慢病毒真核表达载体pEGFP-N1-HIF-1α和pEGFP-N1-muHIF-1 α,以期为后续干细胞的基因转染提供适宜载体.方法 根据野生型人源HIF-1α基因序列信息和确定酶切位点的点突变型序列信息,设计引物,进行聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增、然后对目的基因PCR产物及目的载体进行酶切、后用重组PCR方法将目的片段与目的载体连接的产物转化至DH-5α感受态细胞,挑选阳性克隆进行测序及序列比对,验证重组克隆中插入片段序列与设计的寡核苷酸(oligo)序列是否一致.结果 重组克隆的菌落PCR、重组克隆的酶切结果和质粒克隆测序结果均表明,克隆中插入片段序列与设计的oligo序列一致,HIF-1α基因(野生、点突变)的两个真核表达载体pEGFP-N1-HIF-1α和pEGFP-N1-muHIF-1α构建成功.结论 本项研究成功构建了HIF-1α基因pEGFP-N1-HIF-1α和pEGFP-N1-muHIF-1 α两个慢病毒真核表达载体,为转染骨髓间充质干细胞等后续实验奠定了基础.
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肿瘤抑制基因XAF1启动子序列中活性IRF-1作用元件的鉴定
目的 在XAF1的转录起始序列中鉴定一具有高度活性的IRF-1作用元件.方法 通过生物信息学分析发现XAF1转录起始处(-30～-38nt)有一潜在的干扰素(IFN)调节因子1结合元件(IRF-E),与同义IRF-E序列同源性达76.2%,命名为IRFE-XAF1.应用凝胶电泳迁移实验(EMSA)检测IRFE-XAF1的核蛋白结合活性,并分别定点突变其核心序列内-34nt和序列旁-28nt,检测突变后XAF1启动子活性变化及对IFN-α作用的影响.结果 EMSA实验发现32P标记的含IRFE-XAF1的双链寡核苷酸DNA探针可与细胞核蛋白结合,且可被IRF-E同义探针阻断,定点突变后结合活性丧失,证实该IRFE-XAF1位点具有与转录因子结合的活性.含该IRFE-XAF1位点的XAF1启动子序列具有启动子活性且可被IFN-α诱导,IRFE-XAF1序列定点突变后启动子活性明显降低,其中-34nt突变后完全消除了IFN-α上调启动子活性的作用.结论 XAF1的转录起始序列具有一高度活性的IRF-E,其序列为-38nt GAAACGAAA-30nt,这一发现提示XAF1是IFN-α诱导肿瘤细胞分化的作用基因.
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乳腺癌组织PTEN基因突变的PCR-SSCP分析
目的 了解抑癌基因PTEN在乳腺癌组织中的突变频率和突变类型,探讨PTEN突变与散发性乳腺癌的关系.方法 应用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)方法以及DNA测序技术,扩增45例散发性乳腺癌PTEN基因的9个外显子,根据构象改变检测其基因突变情况.结果 45例乳腺癌组织中检测到1例外显子2第24位密码子由A→C的错义突变,突变使蛋白结构由甲硫氨酸突变为亮氨酸.结论 散发性乳腺癌中存在PTEN抑癌基因的突变,但突变率很低.
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九个苯丙氨酸羟化酶基因单点突变重组质粒的构建和鉴定
目的 构建Y154H、R157I、Y206C、G247R、D282G、G346R、S349A、A389G、R400K 9个PAH基因突变型重组质粒,为下一步研究这些PAH突变体在哺乳动物细胞中表达蛋白功能奠定基础.方法 [1]选择错义突变位点.结合突变位点所在酶蛋白的结构域(如催化结构域或与辅因子BH4结合位点)及患儿相关临床表型进行了9个突变位点的选择.[2]构建PAH基因突变型重组质粒.以野生型PAH真核表达载体pcDNA3.0-PAH-wt为模板,应用Primer Premier 5.0软件自行设计了9对突变引物,并在Platinium Taq DNA高保真聚合酶的作用下直接利用体外PCR定点突变法构建PAH基因突变型重组质粒.[3]初筛PAH基因突变型重组质粒.氨苄抗性初步筛选:利用重组基因含氨苄青霉素抗性基因的特点,可筛选出阳性克隆;CR及酶切技术筛选:根据野生型与突变型靶序列酶切片段的差异进行筛选,其中S349A、D282G、G247R、Y206C、Y154H这5种突变存在Mva Ⅰ、MvaⅠ、Hind Ⅲ、RsaⅠ、RsaⅠ的天然酶切位点,而R157I、G346R、A389G、R400K与其相应的野生型所在位点周嗣并不存在天然的酶切位点,需要在目的 位点的上/下游设计引物,即人工构建DdeⅠ、Hind Ⅲ、PstⅠ、MvaⅠ酶切位点,然后利用上述限制性内切酶进行突变体的酶切鉴定.[4]验证PAH基因突变型重组质粒,突变体终由DNA测序加以验证.结果 这9个突变型PAH cDNA序列除特定碱基位点被突变的碱基替换外,其他序列和野生型的完全保持一致.结论 成功构建了9个PAH基因突变型重组质粒.体外定点突变技术准确、实用.
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一种用于上调内源性人SOD1表达多肽筛选的随机文库及细胞系的构建
目的 以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为示踪物,建立一种简便、经济、有效的随机多肽文库,为进一步筛选出可上调内源性人SOD1表达多肽的药物奠定基础.方法 采用点突变技术,在pET-14b-His-Tat-EGFP载体多克隆位点Xho I之后插入12个随机多肽的36个随机碱基序列.用阳离子脂质体Lipofectamine~(TM) 2000包裹已构建的重组质粒pDsRed1-1-SOD1p后.转染NIH/3T3细胞,荧光显微镜观察SOD1启动子驱动的红色荧光蛋白的表达.用G418筛选稳定表达SOD1启动子驱动的红色荧光蛋白的细胞系,荧光显微镜检测红色荧光蛋白的表达及定位.结果 在示踪载体的基础上构建的随机多肽文库理论上至少包含了107个独立克隆,且几乎所有克隆插入的随机片段都是36个碱基.稳定转染3个月后,重组质粒转染的细胞质及细胞膜上均有携带SOD1启动子的红色荧光蛋白的表达.结论 成功建立随机多肽表达文库,获得了稳定表达SOD1启动子驱动的红色荧光蛋白的NIH3T3细胞系.
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人心肌肌钙蛋白I第2和第4个密码子同义突变对其在大肠埃希菌中表达的影响
目的 对人心肌肌钙蛋白I(cTnI)基因实行定点突变并进行原核表达,观察此突变对cTnI表达量的影响.方法 利用RT-PCR方法从人心肌细胞的总RNA中克隆出编码人心肌肌钙蛋白Ⅰ的cDNA片段,设计引物将其第2和第4个密码子突变后插入原核表达载体形成重组体,并导入宿主菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,Ni-NTA树脂纯化后行Western blot鉴定,观察突变对cTnI表达的影响.结果 突变后的cTnI基因与对照组相比在大肠埃希菌中得到高效表达,经纯化可获得电泳单点纯的cTnI蛋白.结论 成功克隆了cTnI基因,所设计的同义突变可促进cTnl在大肠埃希菌中的高效表达.
