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重组人IFNα1c/86D/22R/27F在大肠杆菌中的表达及活性研究
利用重组PCR点突变技术将人IFNα1c/86D的第22、27位的Ser编码序列突变为Arg和Phe,DNA测序正确,并在大肠杆菌BL21中表达,表达量为19%.采用CM-Sepharose、DEAE-Sepharose FF纯化后Western Blot检测为单一条带.细胞病变抑制法测定其比活为3.51×107 U/mg,较IFN α 1b(1.55 107U/mg)略高.抗A549细胞的增殖活性与IFN α 1b相当.
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Rb2/p130寡核苷酸基因芯片的制备及肺癌手术标本的检测
目的:用基因芯片方法检测肺癌标本中Rb2/p130基因的点突变情况,为肺癌诊断探索快速、准确的基因检测途径.方法:收集肺癌患者的手术标本,提取基因组DNA,检索Rb2/p130基因的DNA序列后,设计并合成探针和引物序列,将探针按一定顺序点样于醛基化玻片,制备成基因芯片.用荧光标记引物对肺癌标本DNA进行PCR扩增,扩增产物与基因芯片杂交,通过对杂交信号的检测判断是否发生热点突变,并用测序方法对突变位点进行验证.结果:在30例用寡核苷酸基因芯片的方法检测的肺癌标本中,Rb2/p 130基因突变的检出率为16.67％,其中肺腺癌的突变率为20％( 4/20),肺鳞癌的突变率16.67％(1/6);在检测过程中发现PCR产物浓度和杂交温度是影响结果的关键因素,对突变位点的测序证实了基因芯片的结果.结论:基因芯片法检测出中国人肺癌组织标本存在Rb2/p130基因突变,但突变率(16.67％)低于西方人(78.5％).未能检测全部突变位点、标本量小和人种差异可能是低突变率的原因.
关键词： 肺癌 基因芯片 Rb2/p130基因 点突变 -
寡核苷酸芯片检测肺癌患者痰标本中p53点突变
目的:用寡核苷酸基因芯片方法检测肺癌患者痰标本中p53基因的热点突变,为肺癌的诊断探索快速、准确的基因检测途径.方法:收集肺癌患者痰标本并提取基因组DNA,用荧光标记的引物对DNA进行p53基因Exon 5、Exon 7 PCR扩增,然后用PCR扩增产物与基因芯片进行杂交,通过对杂交信号的检测,判断是否发生点突变,并用测序方法对部分阳性结果进行验证.结果:在27例肺癌患者痰标本中,p53基因突变的检出率为25.92％,其中小细胞肺癌的突变率为40％( 2/5)、肺鳞癌的突变率为26.6％(4/15)、肺腺癌的突变率为14.28％(1/7),检测到的突变位点有175(2)、248(1)、249(2),对2例阳性标本的测序证实了基因芯片的结果.结论:寡核苷酸基因芯片法可以快速、准确检测出肺癌患者痰标本中p53基因的点突变,今后可用该法对肺癌患者和高危人群的痰标本进行大规模筛选,提高肺癌的早期诊断率.
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烧伤创面耐药金黄色葡萄球菌的分离及其norA基因突变分析
目的 探讨野生型耐药金黄色葡萄球菌的norA基因及其启动子的突变情况.方法 分离并筛选出10株烧伤刨面的耐药性金黄色葡萄球菌,对norA基因及其启动子进行测序并分析其改变.结果 共分离出金黄色葡萄球菌87株,它们对万古霉素100%敏感,对奎奴普汀和呋喃妥因也有很高的敏感性,而对其余抗生素的耐药率则非常高;耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的阳性率达到91.7%.所有10株实验菌的norA基因编码区都有1 349位G→A的点突变,也就是氨基酸的291位处存在Gly(甘氨酸)→A8p(天冬氨酸)的突变.利血平逆转实验提示10株细菌对三种抗生素的MICs值均存在不同程度的下降.结论 norA基因突变是金黄色葡萄球菌耐药的机制之一.
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缺氧诱导肝细胞株中葡萄糖转运体1表达的变化
在以往的实验中笔者观察到,严重烧伤后早期肝脏葡萄糖转运蛋白1蛋白水平及其转录活性明显升高[1].本研究通过点突变等技术方法,构建不同的表达质粒,体外转染正常大鼠肝细胞株(BRL),在缺氧条件下诱导其表达,以期进一步阐明缺氧对膜糖蛋白葡萄糖转运体1(glucose transporter-1,GLUT-1)诱导的机制.
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卵泡刺激素受体基因的点突变和单核苷酸多态性
卵泡刺激素受体(FSHR)是由FSHR基因编码的G蛋白耦联受体蛋白,由胞外区、跨膜区及胞内区3部分构成.胞外区与FSH特异性结合组成FSH/FSHR系统,在人类生殖过程中发挥着重要作用.FSHR基因上突变基因分为活性突变和失活突变2种,失活突变可能导致原发或继发性闭经、高促性腺激素性功能障碍、卵巢早衰及生精功能障碍等生殖疾病,活性突变主要与卵巢过度刺激综合征(OHSS)关系密切.FSHR基因的点突变出现概率非常小,大部分仅有1次报道,而大多数FSHR基因突变为单核苷酸多态性.卵巢和睾丸的正常发育及发挥功能均依赖于完整的FSHR介导,FSHR突变对两性生殖表型的影响存在着差异.
关键词： 卵泡刺激素受体(FSHR) FSHR基因 点突变 单核苷酸多态性 -
一个X连锁少汗性外胚层发育不良家系EDA基因突变分析
目的 检测一个X连锁少汗性外胚层发育不良(XLHED)家系EDA基因突变,为XLHED的基因诊断提供依据.方法 应用DNA二代测序技术(NGS),对收集的XLHED病人家系4位家庭成员(病人及其两个姐姐、母亲)进行EDA基因检测,PCR结合Sanger测序技术验证突变位点.同时收集50例健康查体者进行Sanger测序作为对照.结果 二代测序结果显示,XLHED病人EDA基因发生致病错义突变c.466C＞ T(p.Arg156Cys)(TY),病人母亲和一个姐姐c.466位点为杂合突变(CT),另一姐姐该位点基因型为野生型(CC),三者表型均正常.Sanger测序结果显示,病人及家属基因型与二代测序结果一致,50例对照者基因型均为野生型(CC).结论 EDA基因c.466C＞T突变会造成氨基酸序列改变,影响外胚层发育从而导致XLHED的发病.
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散发性帕金森病Parkin基因突变检测
目的 探讨散发性帕金森病病人Parkin基因的突变情况.方法 应用聚合酶链反应-单链构象多态性技术(PCR-SSCP), 对18例帕金森病病人和20例正常人Parkin基因的第3、4、5、6、7外显子突变情况进行检测分析.结果 4例病人有Parkin基因第3外显子点突变, 1例病人有Parkin基因第4外显子点突变,2例病人有Parkin基因第5外显子点突变.所有病例均未检测到Parkin基因外显子缺失突变.结论 散发性帕金森病病人中存在Parkin基因点突变,Parkin基因点突变可能是散发性帕金森病发病原因之一.
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CD59转染细胞Caspase-3和Bcl-2基因的表达
目的 探讨野生型和突变型CD59分子的表达与细胞凋亡因子之间的关系.方法 应用免疫组化方法,分别测定空pIRES、野生型pIRES-WTCD59和突变型pIRES-MCD59转染CHO细胞中凋亡相关基因Caspase-3、Bcl-2的表达.结果 转染野生型pIRES-WTCD59组与转染空pIRES质粒组比较,Caspase-3表达降低,Bcl-2表达增高,差异有显著性(Z=3.462、3.958,P<0.05);转染突变型pIRES-MCD59组与转染空pIRES质粒组比较,Caspase-3表达降低,Bcl-2表达增高,差异有显著性(Z=3.212、3.956,P<0.05);转染野生型pIRES-WTCD59组与突变型pIRES-MCD59组比较,Caspase-3、Bcl-2表达差异无显著性(Z=1.948、0.544;P>0.05).结论 CD59分子具有抑制凋亡的作用,而其保守位点W40与凋亡信号的传导无关.
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CD59基因的突变并真核表达载体的构建
目的 构建两种活性位点相关性CD59突变基因,并重组入真核表达载体.方法 选取物种间高度保守W40位点及相邻位置为突变位点,重叠延伸PCR(Overlap extension PCR)法构建两种CD59基因点突变,一种是编码W40的密码子TGG缺失突变,另一种是C39W40K41→W39W40W41的相应基因突变,各设计两条常规引物和两条反向互补突变引物,以已构建CD59 cDNA为模板,三重PCR 定点诱变扩增突变基因, 重组入克隆载体PMD18-T-Vector, EcoRⅠ单酶切获得目的 基因,重组入真核表达载体pIRES.结果 通过PCR定点诱变成功获得两种目的 CD59突变基因,序列测定及酶切鉴定结果均证实成功构建了pIRES-m1CD59、pIRES-m2CD59重组真核表达载体系统,突变CD59基因长度约500 bp.结论 重叠延伸 PCR法诱变经济可靠,重组质粒的构建为进一步研究CD59的抗补体活性奠定了基础.
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CD59基因突变在肿瘤逃逸中的作用
目的 构建CD59突变的重组体,研究Hela细胞中CD59基因突变引起肿瘤凋亡相关分子caspase-3表达的变化.方法 采用重组聚合酶链反应定点诱变技术,将CD59的第39～41位氨基酸突变为色氨酸,克隆入pALTER-MAX质粒,采用阳离子脂质体法将重组质粒转染Hela细胞.G418筛选稳定表达细胞克隆,用免疫荧光、ELISA、流式细胞术筛选出高表达突变CD59的细胞株,用免疫组化法检测转染前后Hela细胞内caspase-3表达的变化.结果 酶切鉴定和序列测定均证实成功构建了CD59氨基酸突变的重组质粒.转染突变CD59后Hela细胞内caspase-3表达明显减少,与转染正常CD59的Hela细胞比较差异有显著意义(t=2.846,P<0.01).结论 caspase-3表达变化可能是CD59引起肿瘤逃逸的另一途径.
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线粒体DNA tRNALeu(UUR)基因A3243G点突变糖尿病病人的监测
①目的调查青岛地区糖尿病人群中线粒体DNA tRNALeu(UUR)基因np3243A→G点突变糖尿病流行情况,评价所用方法检测该点突变的灵敏度. ②方法制定调查入选条件,选择可疑病例.由外周血白细胞提取基因组DNA.基因检测采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术.③结果糖尿病病人中该点突变检出率为5‰,在可疑病人中为14‰,在高危人群中为200‰.通过增加电泳上样量可以检测到7%的突变比例.④结论该点突变在糖尿病人群中有一定流行.高危人群检出率高,提示对线粒体基因突变糖尿病的高危人群进行基因诊断非常必要.PCR-RFLP结合大的电泳上样量可以提高检测灵敏度.
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慢性进行性眼外肌麻痹发病机制探讨
①目的探讨慢性进行性眼外肌麻痹(CPEO)发病的分子机制.②方法采用聚合酶链反应(PCR)、PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术以及PCR-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术,对4例CPEO病人和10例非CPEO病人受累眼外肌线粒体DNA(mtDNA)的8483～13459碱基部位的缺失突变、tRNA(Leu)基因A3243G位点的点突变以及tRNA(Leu)基因其他位点的突变情况进行检测分析.③结果在1例CPEO病人眼外肌标本中检测到mtDNA的8483～13459碱基部位的缺失突变;未检测出A3243G点突变及mtDNA tRNA(Leu)基因的其他点突变.④结论 mtDNA的8483～13459碱基部位缺失突变可能与CPEO的发病有关.
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白血病Flt3基因编码的近膜区点突变的检测和内含子14缺失的分析
目的 对白血病Flt3基因编码的近膜区突变点进行检测,研究其与白血病发生、发展的关系.方法 应用聚合酶链反应(PCR)、聚合酶链反应单链构象多态性(PCR/SSCP)和DNA测序方法,对60例白血病患者外周血和部分骨髓标本Flt3基因外显子14、15进行检测.结果 在60例白血病患者中,3例白血病Flt3-L576P发生点突变,其中1例合并有Flt3基因内含子14缺失突变.结论 白血病Flt3-L567点突变是近膜区(JM)新发现的点突变,其发生与临床白血病的发生、发展具有相关性.
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bcr-abl阴性骨髓增生性疾病患者JAK2V617F点突变检测的临床意义
目的 探索Janus Kinase 2V617F基因突变(JAK2V617F)在bcr-abl阴性骨髓增生性疾病(MPD)的发生率和临床意义.方法 基因组DNA从患者骨髓或外周血粒细胞中提取.采用等位基因特异性PCR(AS-PCR)、限制性内切酶消化和PCR产物测序的方法检测JAK2V617F突变.共检测患者110例,其中bcr-abl阴性MPD 41例、bcr-abl阳性慢性粒细胞白血病(CML)25例和急性白血病44例.结果 JAK2V617F阳性结果分别为真性红细胞增多症(PV)11例(91.7%)、原发性血小板增多症(ET)8例(53.3%)、特发性骨髓纤维化(IMF)4例(57.1%),而高嗜酸粒细胞增多症(HES)7例、bcr-abl阳性CML 25例和急性白血病44例[包括急性髓细胞白血病(AML)24例、急性淋巴细胞白血病(ALL)18例、急性混合细胞白血病2例1均未检测到JAK2V617F基因突变.在所有JAK2V617F阳性的标本和10份阴性标本中,AS-PCR和限制性内切酶消化方法的测定结果都可经测序进一步证实.结论 90%以上的PV、50%以上的ET和IMF可检测到JAK2V617F基因突变;JAK2V617F基因突变在PV、ET和IMF的诊断和鉴别诊断中有重要意义,可以作为诊断的分子标志,也可能是治疗的新靶点.
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急性髓系白血病患者FLT3表达及TKD点突变的研究
目的 研究急性髓系白血病(AML)患者与正常人FMS样酷氨酸激酶3(FLT3)基因在骨髓中表达的差异以及FLT3基因酪氨酸激酶结构域(TKD)点突变与AML的关系.方法 将AML初治患者和正常人的骨髓分别用CD135抗体标记后,应用三色流式细胞术检测并分析;采用RT-PCR结合限制性内切酶酶切,检测30例AML初治患者FLT3基因的TKD点突变.结果 AML患者骨髓中CD135阳性率均＞20%,而正常人＜2%,二者差异有统计学意义(P＜0.05);另外,30例AML患者中3例存在FLT3-TKD点突变,阳性率为10%,其中2例化疗后完全缓解(CR),缓解率66.7%,其他27例非点突变患者化疗后完全缓解率为84%,二者比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 AML患者骨髓中FLT3基因表达显著高于正常人.AML患者FLT3-TKD点突变的阳性率为10%左右,FLT3-TKD点突变对患者化疗后CR率的影响有待进一步研究.
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慢性髓系白血病的现代治疗
伊马替尼(IM)以及二代酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的问世不仅彻底改革了慢性髓系白血病(CML)的治疗模式,也成为其他肿瘤发病机制和治疗研究的范例.IM可使90%以上的慢性期患者获得血液学缓解,80%以上的患者获得遗传学完全缓解(CCyR)及主要分子学缓解(MMoR),明显延长其无病生存期,使CML自然病程大为改观.然而,也存在目前难以克服的缺点:TKI并非疾病基因清除剂,对CML干细胞不敏感,获得CCyR/MMoR者仍需长期持续服用,小部分患者发生抗药或不耐受.现阶段的TKI仍是根治CML的起始.
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FUT2基因座4个新变异等位基因的分析
目的探讨FUT2基因座新变异等位基因的结构、检测方法与表达状态.方法应用PCR、RFLPs、基因重组、DNA序列检测及基因表达技术,对4种FUT2基因座新变异等位基因进行分析.结果在新几内亚人个体中,发现了3种新的FUT2等位基因,分别由错义突变C664T、G868A和G760A所致.经基因表达证实:3种基因编码的α2-FUT酶蛋白缺乏相应的糖基转移酶活性;在中国汉族个体中,发现1例同义突变A660T.C664T和A660T改变了限制性内切酶SacI的识别序列,可以用RFLPs方法进行检测.在应用DNA序列分析技术检测杂合子时,可能会漏检显示弱峰的变异,RFLPs技术不能确定内切酶识别序列内部的具体变异点.结论C664T、G868A和G760A突变所形成的FUT2基因为非分泌型基因,序列多态性的检测应使用2种以上的方法相互验证.
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引物3'端第二个碱基SNP变异的长度多态性遗传标记检测
目的 为了获得引物3'端存在SNP点突变的插入缺失遗传标记rs10644346所有等位基因片段.方法 基于等位基因特异性PCR原理,设计一条共用上游引物,二条3'端倒数第二个位置特异性碱基的下游引物.运用该三条引物检测150个无关个体及10例亲子关系已确定的三联体,同时运用其中二条引物(共同上游弓物和其中一条下游引物)扩增9例样本.结果 三条引物扩增150个无关个体均有清晰扩增片段;10例三联体案例亲代与子代扩增片段均符合孟德尔遗传定律;二条引物扩增9例样本后发现特定片段丢失.结论 本次研究设计的三条引物PCR,证明特异性碱基位置除了通常的3'末端,理想条件下3'端的其他位置(如倒数第二个位置)也可以成为有效选择,该三条引物设计方法为检测引物侧翼存在点突变的遗传标记提供了一种薪的参考.
关键词： 法医物证学 三条引物 等位基因特异性PCR 3'末端 点突变 -
Q61R和V112A突变的HRAS基因在NIH小鼠体内诱发肿瘤的实验研究
目的:分析含有HRAS(V112A)基因及其G12C、G13C、Q61R和G12C/G13C/Q61R突变体的质粒DNA在NIH小鼠体内的致癌性.方法:从人结肠癌DiFi细胞中扩增含有V112A突变的HRAS(V112A)基因,采用PCR点突变法在HRAS(V112A)中分别引入G12C[HRAS(V112A/G12C)]、G13C[HRAS(V112A/G13C)]、Q61 R[HRAS(V112A/Q61R)]或3位点联合突变[HRAS(112A/G12 C/G13C/Q61R)],将HRAS(V112A)及上述突变基因克隆入真核表达载体pCDNA3.1(+),Western blot确证HRAS(V112A)及各突变体可体外表达后,每种质粒按每只100 μg剂量皮内注射6～8周龄雌性NIH小鼠,阴性对照组注射PBS,每组8只小鼠,持续观察小鼠致瘤情况.注射后4个月,取小鼠瘤样组织分别采用PCR和Western blot方法检测病变组织中的HRAS基因及其表达产物.结果:从DiFi细胞中成功扩增出含有V112A突变的HRAS(V112A)基因,并构建4个突变体,体外转染结果表明各HRAS均可在L929细胞中表达.重组质粒注射小鼠后,HRAS(V112A)组有4只小鼠注射后4个月于注射部位出现增生样改变,该病变在1个月后自愈;HRAS(V112A/Q61R)组有1只小鼠于注射后4个月出现明显的瘤样增生.至观察期末,HRAS(V112A/G12C)、HRAS(V112A/G13C)和HRAS(V112A/G12C/G13C/Q61R)组小鼠均未出现可见增生样结节.病变组织的PCR和Western blot检测结果表明HRAS(V112A)组小鼠增生样组织和HRAS(V112A/Q61R)组小鼠肿瘤组织中均有对应的HRAS基因存在和表达.结论:HRAS(V112A)可在NIH小鼠体内导致注射部位皮肤的增生样改变,含有Q61R突变的HRAS(V112A)可在NIH小鼠体内诱导肿瘤形成,含有G12C、G13C及G12C/G 13C/Q61R突变的HRAS(V112A)在小鼠体内不会引起明显病变.
