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环丙沙星体外诱导肺炎克雷伯菌耐药机制的研究
目的:探讨环丙沙星体外诱导敏感肺炎克雷伯菌(KPn)耐药的分子机制。方法对临床分离的敏感肺炎克雷伯菌体外使用环丙沙星,采用多步法诱导耐药,并随机选择10对临床分离敏感菌和诱导后高度耐药菌进行GyrA 基因 QRDR(喹诺酮抗性区,quinolone resistant-determining region)的聚合酶链式反应(PCR)扩增、SDS-PAGE 电泳鉴定外膜外排泵蛋白 TolC 及膜孔蛋白 porin 蛋白的表达。结果诱导后的 KPn 均成为耐药菌,其中高度耐药菌占73.81%。10株诱导的耐药菌中 Ser83突变率为30%;膜孔蛋白 porin 表达均减少,外排泵蛋白 TolC表达均增多。结论环丙沙星的使用与 KPn 耐药密切相关,并可引起 KPn 多种耐药分子产生。
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小鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化的形态学观察
目的 探讨5-氮胞苷(5-aza)对小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外诱导作用.方法 分离2周龄小鼠胫骨、股骨,冲洗出骨髓,利用Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心和贴壁培养的方法获得MSCs.取传2代MSCs培养48h后加101μmol/L5-aza进行诱导,3周后刮取贴壁细胞,离心收集,免疫细胞化学检测心肌特异性蛋白a-actin的表达对所诱导细胞进行鉴定,电镜观察细胞超微结构.结果 电镜下见胞质内出现大量肌丝,线粒体数量增多,分布在肌丝周围,可见细胞膜电子密度增高的缝隙连接;免疫细胞化学显示a-actin呈强阳性表达.结论 MSCs经5-aza体外诱导分化,可获得形态上类似、表达心肌特异性蛋白的心肌样细胞.
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小鼠骨髓间充质干细胞体外诱导向心肌细胞分化的研究
目的 探讨体外诱导小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌细胞分化的方法.方法 分离2周龄小鼠胫骨、股骨,冲洗出骨髓,利用Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心和贴壁培养的方法获得MSCs.取传2代细胞培养48h,分为4组:A组加入心肌组织块条件培养液、B组加10μmol/L 5-氮胞苷(5-aza)、C组为二者的混合液、D组不加任何诱导剂以作对照组.应用免疫细胞化学方法检测各组心肌特异性蛋白α-actin的表达.结果 免疫细胞化学染色结果显示,A组细胞培养3周时可检测到α-actin阳性细胞,阳性细胞较多;B组培养1周可见弱阳性细胞,随时间延长,阳性着色增强且阳性细胞数增多,3周时呈强阳性表达;C组2周即可检测到细胞呈强阳性着色.对照组MSCs胞浆内未检测到α-actin的表达.4个组的阳性细胞率进行两两比较均有统计学意义(P<0.05).结论 心肌组织块条件培养液和5-aza联合应用可促进MSCs体外分化为心肌样细胞.
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成人脂肪干细胞的体外多向分化能力观察
目的 观察成人脂肪干细胞(ADSCs)的体外多向分化能力.方法 从正常成人脂肪组织分离得到ADSCs并体外培养.在ADSCs中分别加入成人脂肪、骨、软骨、肝细胞的体外诱导培养基诱导,观察诱导过程中细胞形态的变化,诱导前、诱导1周、诱导2周时采用RT-PCR法观察细胞相应标志物mRNA表达的变化.结果 ADSCs向脂肪细胞诱导2周,细胞内的脂质空泡聚集,小脂滴融合在一起并变大;后细胞变为单房,并且充满脂质,红油O染色阳性;诱导1周细胞PPARγ、脂蛋白酶和αP2 mRNA表达较诱导前增加;诱导2周细胞PPARγ、脂蛋白酶mRNA表达降低,但αP2 mRNA变化不明显.ADSCs向骨细胞诱导5天,细胞由成纤维形转化为多边形或不规则状.诱导2周单层细胞聚集成块,形成细胞岛状结构,ALP染色阳性,von Kossa染色可见黑色矿化结节;矿化结节形成后细胞向结节移行聚集,促使更多的细胞形成更大的矿化结节;诱导后细胞ALP、骨桥蛋白和Ⅰ型胶原mRNA表达逐渐增加.ADSCs向软骨细胞诱导1周,细胞呈多边形或类圆形,细胞团向内呈放射状聚集,FITC染色后免疫荧光可见Ⅱ型胶原;诱导1、2周时细胞Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖和SOX9 mRNA表达明显高于诱导前.ADSCs向肝细胞诱导2周时可见部分细胞变成圆形或椭圆形,并随时间顺延呈肝细胞样圆形细胞增多趋势,细胞核居中,圆形且边缘清楚,PAS染色阳性;诱导1、2周时细胞CK18、HNF1α及白蛋白mRNA表达明显高于诱导前.结论 成人脂肪组织中分离得到的成人ADSCs可在体外定向分化为脂肪细胞、骨细胞、成骨细胞和肝细胞.
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大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导后对糖尿病大鼠模型的治疗作用
对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)分离培养、体外扩增,采用含不同葡萄糖浓度的培养基加尼克酰胺、exendin-4向胰岛样细胞进行诱导.将诱导细胞通过尾静脉及肾包囊移植入糖尿病大鼠模型体内,通过对血糖的检测,观察诱导后细胞对糖尿病大鼠模型的治疗效果.发现大鼠BMSCs在尼克酰胺和exendin-4作用后,可通过尾静脉和肾包囊途径进入体内,分布在不同脏器,同时产生降低链脲佐菌素(STZ)诱导糖尿病大鼠血糖水平的作用.
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氯化钴体外诱导人胃癌细胞COX-2表达的研究
研究证实,多种恶性肿瘤组织内存在低氧区,其产生与肿瘤生长迅速、肿瘤血管结构异常等有关.而低氧可诱导包括血管内皮生长因子(VEGF)在内的多种促血管生长因子表达,促进肿瘤生长[1].环氧合酶(COX)是催化花生四烯酸转化为前列腺素类代谢中的限速酶,环氧合酶-2(COX-2)呈诱导性表达,为其同工酶,在多种肿瘤组织中表达升高[2,3].多项细胞水平的研究表明,低氧可以刺激多种细胞表达COX-2,还可以诱导多种细胞COX-2、VEGF共表达[4,5];因此肿瘤微环境低氧可能是体内肿瘤COX-2与VEGF共表达的重要原因之一,但低氧是否可以刺激胃癌细胞COX-2表达尚不明确.2004年1~5月,我们观察了低氧模拟剂氯化钴体外诱导人胃癌细胞株BGC-823表达COX-2的情况,旨在为胃癌的临床诊治提供依据.
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内皮前体细胞的临床应用进展
内皮前体细胞(EPCs)是指出生后机体中存在的能特异性归巢于血管新生组织并分化成内皮细胞的一群干细胞,包括从成血-血管干细胞到完全分化的内皮细胞之间一定阶段的细胞群体.研究表明,EPCs可在生理或病理条件下迁移到新血管形成位点并在原位分化成内皮细胞,能快速修复损伤血管.为了解决来源于骨髓和外周循环中EPCs数量过少的问题,Tatiana等[1]对人体骨髓内和外周血中的单个核细胞(MNCs)转化为EPCs的潜能进行了研究,结果发现在不同培养条件下骨髓和外周血中的MNCs可以转化为EPCs,从而为EPCs的临床应用提供了前景.本文就EPCs的临床应用进展综述如下.
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鼠伤寒沙门菌L型变异对抗原与抗生素敏感性的影响
H和O抗原常用于鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium STM)的鉴定,对抗生素的敏感性常可指导STM患者的治疗用药.为探讨STM L型变异菌对H和O抗原及对抗生素敏感性的影响,本文对体外诱导的3株STM L型及其原菌进行了H和O的抗原检测和对抗生素的敏感试验,以期有利于STM病的诊断和流行病学研究,及对患者的临床治疗用药有指导意义.
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人脂肪组织来源的干细胞体外诱导为角膜上皮样细胞的分化潜能
目的 初步探讨人脂肪组织来源的干细胞(human adipose-derived stem cells,hADSC)体外诱导为角膜上皮样细胞的分化潜能.方法 分离、纯化、体外扩增hADSC,流式细胞术鉴定所获得细胞的CD29+、CD34-、CD49d+、CD105+、CD106-的表达情况.成脂、成骨诱导鉴定其多向分化潜能.在DMEM/F12体系、KM体系及上述二者等体积混合的KM/DMEM/F12体系内添加不同梯度浓度的生长因子对hADSC进行体外诱导:0μg·L-1、10μg·L-1、20μg·L-1、30μg·L-1、40μg·L-1、50μg·L-1的表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF),及50μg·L-1 EGF+10μg·L-1 碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和50μg·L-1 EGF+20 μg·L-1 bFGF.连续诱导21 d,观察hADSC形态学的改变及第21天时角膜特异性蛋白AE5(CK3/CK12)的免疫化学表达情况,比较不同培养体系及不同浓度生长因子对hADSC诱导作用的差异.结果 流式细胞仪测定传3-5代的细胞CD34-、CD106-、CD29+、CD49d+、CD105+.成脂、成骨体外诱导14 d后.油红O、碱性磷酸酶染色阳性率分别为74.6%和29.3%.KM体系中加入终浓度为0~50μg·L-1 EGF诱导21d后,hADSC AE5阳性细胞率均占90%以上.其中,40μg·L-1EGF诱导下的AE5阳性细胞率为98.7%,50μg·L-1 EGF可达到100%.而加入bFGF的hADSC 则为AE5弱阳性.而另2个体系对各浓度ECF、bFGF诱导的hADSC的作用均为阴性.结论 人吸脂术废弃液中可获得大量高纯度脂肪组织来源的干细胞,经体外条件诱导具备向角膜上皮样细胞分化潜能.添加EGF的角质细胞培养液有利于其分化,并具有浓度依赖性,bFGF则对分化有抑制性作用.
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丹酚酸B体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究
目的 观察丹酚酸B(SalB)干预体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的作用及其机制.方法 分离培养及鉴定大鼠MSCs,对其进行分组诱导:SalB组(终浓度为250μg/L)、5-氮胞苷组(终浓度为10 μmol/L)、SalB联合5-aza组(终浓度分别为250μg/L与10μmol/L),诱导24h后继续培养4周,观察其形态学变化,免疫细胞化学法鉴定心肌特异性肌钙蛋白T(cTnT)的表达,实时荧光定量RT-PCR法检测心肌早期基因NKX2.5、GATA-4、Desmin和a-actin mRNA的表达.结果 诱导后的MSCs体积增大,增殖减慢,并出现肌管样结构;免疫细胞化学结果显示诱导后的MSCs表达心肌特异性蛋白cTnT,与5-aza组相比,SalB组cTnT表达较低,SalB联合5-aza组cTnT表达升高;实时荧光定量RT-PCR结果显示各组均表达心肌分化早期基因,SalB联合5-aza组诱导后的MSCs的心肌早期分化基因表达明显高于其他两组.结论 SalB可在体外诱导大鼠MSCs定向分化为心肌样细胞,其与5-aza联合诱导可明显提高MSCs向心肌细胞分化的能力.
关键词: 丹酚酸B 骨髓间充质干细胞 体外诱导 免疫细胞化学 实时荧光定量RT-PCR -
脐带血造血干细胞向巨核细胞诱导分化研究进展
大剂量的放、化疗或进行造血干细胞移植会导致患者血小板急剧减少而致出血,严重时危及生命.输注他人捐献的血小板成为目前主要的治疗手段.但血小板储存时间短、易于激活、储存条件苛刻的原因导致血小板供应紧张[1],且反复输注容易产生血小板抗体及增加病原体感染的风险.因此,体外诱导造血干细胞向巨核细胞分化并回输体内发育生成血小板,成为加速患者血小板恢复的新型治疗方案[2-3].造血干细胞来源有:骨髓、外周血与脐带血[4],由于脐带血中所含造血干/祖细胞数量与骨髓相似,临床输注免疫原性低、排斥反应小,特别是其增殖分化能力明显优于骨髓及外周血造血干细胞的特点,如今已成为优秀的造血干细胞来源.
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高浓度的卡巴胆碱体外诱导鼠胰腺腺泡细胞NF-κB活化
核转录因子NF-κB-是调节炎症反应相关蛋白基因表达的关键因子之一,NF-κB的活化在急性胰腺炎病理过程中起重要作用.胰腺腺泡细胞胰酶分泌的胆碱能受体信号转导通路是否参与调节NF-κB活化,目前尚无报道.我们利用大剂量胆碱能受体激动剂卡巴胆碱体外作用于鼠胰腺腺泡细胞,测定细胞内NF-κB活性,确定胆碱能受体信号转导通路是否参与调节NF-κB活化.
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脐血间充质干细胞体外诱导分化潜能的研究
近年来的研究认为,间充质干细胞(MSCs)是中胚层发育的早期细胞,具有很强的自我更新能力,可体外大量扩增,并至少能分化成3种中胚层结缔组织,已被用作组织工程的种子细胞.本研究试图在体外从脐血单个核细胞(MNCs)中分离培养MSCs,研究其生物学特性及分化潜能,现报告如下.
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体外诱导单核细胞分化为肝样细胞的研究
我们通过建立人为细胞诱导分化体系在体外诱导人外周血单核细胞分化为肝样细胞,旨在为肝组织工程研究及临床应用提供新的细胞来源.一、材料与方法1.材料:外周血由山东省立医院肝胆外科患者知情同意并志愿提供,由山东省立医院伦理委员会批准;RPMI 1640培养基、胎牛血清(Gibco公司);粒细胞刺激因子(齐鲁制药公司),肝细胞生长因子( HGF)、成纤维细胞生长因子4(FGF-4,Peprotech公司);鼠抗人CK19单克隆抗体、鼠抗人甲胎蛋白(AFP)单克隆抗体(Abcom公司);FITC标记山羊抗鼠IgG、TRITC标记山羊抗鼠IgG(北京中杉公司);4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、抗荧光淬灭封片剂(碧云天公司);淋巴细胞分离液、β-巯基乙醇( Sig-ma公司).
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节律基因Per2对小鼠肿瘤细胞增殖和凋亡的影响
我们通过体外诱导节律基因Per2的过表达,观察Per2对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响;同时通过小鼠体内实验观察Per2对肿瘤生长的影响,探讨Per2表达对卵巢癌细胞的肿瘤抑制作用.
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高免疫原性胶质瘤细胞疫苗的体外抗瘤作用
热休蛋白70(HSP70)与主要组织相容性抗原复合体I类分子(MHC-I)是参与内源性抗原提呈的两类重要分子[1,2].本研究旨在观察模型HSP70及MHC-I类分子高表达人多形性胶质母细胞瘤GBM U251细胞疫苗体外诱导的抗瘤作用.
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不同细胞因子体外诱导骨髓间充质干细胞定向肝细胞分化的研究
肝脏损伤修复过程是一个多步骤、多因子、涉及多种信号相互作用的精确而有序的复杂过程,肝脏损伤后骨髓间充质干细胞(BMSCs)参与肝脏再生就是以上因素综合作用的结果[1-4].我们模拟体内多种细胞因子协同作用进行体外诱导,观察体外不同细胞因子对BMSCs定向肝细胞分化率的影响,探讨提高诱导分化率的佳条件.
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外源性B7-1基因诱导抗肺癌主动免疫的实验研究
我们通过构建了携带肿瘤免疫相关基因B7-1的重组腺病毒,并将其感染肺癌细胞,观察了转染基因的表达,同时检测了体外诱导自体外周血淋巴细胞生成肿瘤杀伤性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL).
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单分子膜体外诱导羟基磷灰石晶体矿化的研究进展
矿化现象在自然界广泛存在,与其它条件下的矿化过程不同,在人体内,骨骼、牙齿的矿化,都是在相关细胞(成骨细胞、成釉细胞、成牙本质细胞)及生物大分子的参与、调控下完成的[1].细胞与生物大分子的参与,使骨与牙齿形成了独一无二的结构特点和生物力学特性.
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亚低杀菌浓度环丙沙星体外诱导铜绿假单胞菌标准质控菌株耐药研究
目的:研究亚低杀菌浓度(minimum bactericidal concentration,Sub-MBC)环丙沙星体外诱导对铜绿假单胞菌MIC值影响,为防止临床不合理使用抗菌药物导致细菌耐药性,提供新思路.方法:以铜绿假单胞菌质控菌株ATCC27853为研究对象,以环丙沙星为诱导耐药抗菌药物,用微量稀释法首先测定其MBC值,然后用1/2MBC值环丙沙星浓度进行体外诱导培养,每天观察其MBC值变化,及时调整诱导浓度为变化后MBC值的1/2,直到诱导菌株MBC值升高到原始MBC值的64倍时,停止诱导,并记录诱导天数;诱导出的耐药菌株传代3d,再采用微量稀释法对其MBC进行测定,并通过全自动微生物药敏仪对其进行耐药性鉴定.结果:铜绿假单胞菌标准质控菌株的环丙沙星MBC值为0.5 μg·ml-1;采用0.25 μg·ml-1环丙沙星浓度体外诱导7 dMBC值明显升高,诱导30 d升高至原始菌株MBC的64倍;诱导出的铜绿假单胞菌针对环丙沙星的耐药菌株,经3d传代后,微量稀释法测定其MBC仍为原始菌株的64倍,全自动药敏分析仪鉴定为环丙沙星耐药菌.结论:亚低杀菌浓度环丙沙星可体外诱导铜绿假单胞菌标准质控菌株出现耐药,且耐药性随亚低杀菌浓度诱导时间延长而增加,诱导出的铜绿假单胞菌耐药菌株的耐药性能稳定传代,提示低剂量使用抗菌药物可导致细菌产生耐药性.