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晚期糖基化终产物对大鼠血管外膜成纤维细胞中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶p22phox亚基及活性氧表达的影响
目的:探讨晚期糖基化终产物(AGE)对大鼠血管外膜成纤维细胞(AF)中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶p22phox亚基及活性氧表达的影响.方法:用组织贴块法培养SD大鼠的血管外膜成纤维细胞,用逆转录-聚合酶链反应、蛋白质印迹检测不同浓度的糖基化人血清白蛋白(AGE-HSA,分为对照组、100 μg/ml AGE-HSA组,200 μg/ml AGE-HSA组、300 μg/ml AGE-HSA组)对NADPH氧化酶p22phox亚基信使核糖核酸(mRNA)及蛋白的表达的影响,并观察不同干预因素[分为对照组1、200 μg/ml AGE-HSA组(200 μg/ml处理组1)、200 μg/ml AGE-HSA+50 μg/ml抗RAGE中和抗体组(抗RAGE中和抗体组1)及200 μg/ml AGE-HSA+30 nmol/L坎地沙坦组(坎地沙坦组1)对AGE-HSA上调NADPH氧化酶p22phox亚基mRNA和蛋白表达的影响.用2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐检测不同干预因素[空白对照组、AGE-HSA 200 μg/ml组(200 μg/ml处理组2)、200 μg/ml AGE-HSA+50 μg/ml 抗RAGE中和抗体组(抗RAGE中和抗体组2)、200 μg/ml AGE-HSA+30 μmol/L夹竹桃素组(夹竹桃组),200 μg/ml AGE-HSA+30 nmol/L坎地沙坦组(坎地沙坦组2)对血管外膜成纤维细胞内活性氧表达的影响.结果:3个浓度(100 μg/ml、200 μg/ml和300 μg/ml)的AGE-HSA组均与对照组比较,血管外膜成纤维细胞NADPH氧化酶p22phox亚基mRNA及蛋白的表达随AGE-HSA增加呈浓度依赖性上调;抗RAGE中和抗体组1、坎地沙坦组1比200 μg/ml处理组1的p22phox mRNA及蛋白表达降低;抗RAGE中和抗体组2、夹竹桃素组2及坎地沙坦组2比200 μg/ml AGE-HSA处理组2血管外膜成纤维细胞内活性氧相对荧光强度降低,上述比较差异均有统计学意义(P<0.05).结论:AGE-HSA经由RAGE影响活性氧与NADPH氧化酶p22phox亚基的表达上调,活性氧的上调与NADPH氧化酶p22phox亚基表达相关.NADPH氧化酶抑制剂及坎地沙坦可通过下调NADPH氧化酶p22phox亚基的表达减少血管外膜成纤维细胞内活性氧的产生.
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探讨白藜三醇抑制快速电刺激乳鼠心肌细胞氧化应激损伤及其机制
目的：探讨白藜三醇（Resveratrol，RSV）对快速刺激乳鼠心肌细胞氧化应激损伤的保护机制。方法：本实验采用胰酶和胶原酶双酶法及差速贴壁法分离新生大鼠心肌细胞和成纤维细胞。心肌细胞随机分为5组：空白对照组、快速电刺激组（RES组）、快速电刺激+烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶抑制剂夹竹桃麻素组（RES+APO组）、快速电刺激+白藜三醇组（RES+RSV组）、快速电刺激+钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂组（RES+AIP组）。为了证实白藜三醇是否还通过蛋氨酸亚砜还原酶—氧化型钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶（MsrA-OX-CaMKⅡ）途径对心肌细胞产生保护作用。除了上述5组，另设了MsrA竞争性阻断剂0.5%二甲基亚砜（DMSO）对照组（DMSO对照组）和RSV+DMSO组，RES+RSV+DMSO组。细胞计数Kit-8（CCK-8）法检测心肌细胞活性以确定白藜三醇的佳浓度，采用酶联免疫吸附检测法（ELISA）检测细胞培养液中AngⅡ水平以选择佳心肌细胞电刺激时间。流式细胞仪检测心肌细胞内活性氧水平；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测心肌细胞MsrA、NADPH氧化酶4（Nox4）、NADPH氧化酶2（Nox2）、NADPH氧化酶p22phox亚基（P22phox）、OX-CaMKⅡ、凋亡相关激酶半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）、Caspase-3剪切蛋白表达。结果（：1）与空白对照组比，RES组心肌细胞AngⅡ分泌显著增加，同时Nox4、Nox2及P22phox、OX-CaMKⅡ、Caspase-3剪切蛋白的表达水平显著增加。（2）与RES组比，RES+APO组、RES+RSV组和RES+AIP组的活性氧水平降低， RES+RSV组降低更明显。（3）与RES组比较，RES+APO组、RES+RSV组的Nox4、Nox2及P22phox、OX-CaMKⅡ、Caspase-3剪切蛋白的表达水平降低，RES+AIP组仅Nox2、OX-CaMKⅡ及Caspase-3剪切蛋白表达水平降低。（4）加入MsrA抑制剂二甲基亚枫（DMSO）后，白藜三醇抑制快速电刺激导致的Caspase-3剪切蛋白表达作用减弱。结论：白藜三醇对快速电刺激乳鼠心肌细胞具有保护作用，其机制可能是抑制NADPH氧化酶及增加MsrA表达，从而减少乳鼠心肌细胞氧化应激损伤。
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阿托伐他汀对血管紧张素Ⅱ诱导的人肠系膜动脉平滑肌细胞增殖和细胞内NADPH氧化酶-活性氧通路的影响
目的 观察阿托伐他汀钙对血管紧张素Ⅱ的促人肠系膜动脉平滑肌细胞增殖和其诱导的平滑肌细胞内NADPH氧化酶-活性氧通路的干预作用.方法 用组织贴块法培养的第2～4代人肠系膜动脉平滑肌细胞作为实验标本;以四甲基偶氮唑盐(MTT)法比色测定各组平滑肌细胞增殖率;流式细胞仪检测被双氢乙酰乙酸-二氯荧光黄(DCFH-DA)标记的细胞内活性氧;反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测细胞内p22phox蛋白mRNA的表达变化.结果 (1)与空白对照组比较,加入血管紧张素Ⅱ药物组的细胞增殖率、细胞内活性氧物质生成量、细胞内p22phox mRNA的表达均明显增高(P<0.01).(2)与浓度为10-6moL/L血管紧张素Ⅱ孵育组比较,血管紧张素Ⅱ和阿托伐他汀钙共孵育组的细胞增殖率[阿托伐他汀组(0.242 ±0.018)比血管紧张素Ⅱ组(0.359±0.024),P<0.01]、细胞内活性氧[阿托伐他汀组(130±29)比血管紧张素Ⅱ组(180±34),P<0.01]、细胞内p22phox蛋白mRNA的表达[阿托伐他汀组(0.47±0.07)比血管紧张素Ⅱ组(0.71±0.05),P<0.01]均降低.结论 阿托伐他汀钙可以部分抑制血管紧张素Ⅱ的促人肠系膜动脉平滑肌细胞增殖和其诱导的细胞内NADPH氧化酶-活性氧通路的作用.
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NADPH氧化酶在阿霉素心脏毒性的表达及意义
目的 探讨NADPH氧化酶(Nox)在阿霉素心脏毒性中的表达及意义.方法 选择40只SPF级雄性C57BL/6J小鼠,随机分成为对照组和模型组,每组各20只,模型组小鼠通过一次性腹腔注射20 mg/kg阿霉素诱导心脏毒性,对照组小鼠给予等量生理盐水.2组小鼠均观察5 d后处死,测量并记录体重、心重和胫骨长度,计算心重胫骨长度比,同时行心肌组织荧光TUNEL染色观察心肌细胞凋亡情况.应用Real time-PCR和Western blots法检测小鼠心肌组织Nox2和Nox4 mRNA和蛋白表达.结果 与对照组相比,模型组小鼠体重、心重和心重胫骨长度比明显下降(P均<0.05);TUNEL染色结果显示模型组小鼠心肌组织凋亡指数明显升高(P<0.05);模型组小鼠心肌组织中Nox2和Nox4 mRNA和蛋白质表达均较对照组明显上调(P均<0.05).结论 在阿霉素心脏毒性模型,小鼠心肌组织中Nox2和Nox4表达增高,提示Nox通过调控氧化应激参与阿霉素心脏毒性作用,且可能是阿霉素心脏毒性的潜在治疗靶点.
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NADPH氧化酶在Ang II介导H9C2心肌细胞凋亡中的作用
目的：分析血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）介导的H9C2心肌细胞凋亡是否通过NADPH氧化酶/P38MAPK途径。方法体外培养H9C2心肌细胞，分组干预：①Control组：仅加细胞培养液；②AngⅡ组：在Control组的基础上加入AngⅡ；③apocynin组：在Control组的基础上加apocynin；④AngⅡ+apocynin组：在Control组的基础上加入AngⅡ以及apocynin（n=6）。干预24 h后测定NADPH氧化酶活性，TUNEL法检测细胞凋亡，Western Blot 检测P38MARK及相关凋亡蛋白的表达水平。结果 Control组、apocynin组、AngⅡ组、Ang II+apocynin组凋亡比例分别为（12.20±1.18）%、（14.71±3.88）%、（62.33±4.79）%、（13.67±2.59）%。与Control组比较，AngⅡ组凋亡比例明显增加，而AngⅡ+apocynin组凋亡比例较AngⅡ组下降，差异有统计学意义（P均＜0.05）。与Control组比较，加入NADPH氧化酶抑制剂apocynin后细胞NADPH氧化酶活性降低；而仅加入AngⅡ的细胞NADPH氧化酶活性明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。AngⅡ+apocynin组的NADPH氧化酶活性较AngⅡ组降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。与正常细胞比较，AngⅡ作用后，P38MAPK表达增加，凋亡蛋白Bax表达增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少，差异有统计学意义（P均＜0.05）。Ang II+apocynin组较AngⅡ组P38MAPK表达降低，凋亡蛋白Bax表达减少，抗凋亡蛋白Bcl-2表达增加，差异有统计学意义（P均＜0.05）。结论血管紧张素II通过NADPH氧化酶/P38MAPK途径介导H9C2心肌细胞凋亡。
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还原型辅酶Ⅱ氧化酶蛋白亚单位在特发性肺纤维化患者中的表达
目的 探讨特发性肺纤维化(IPF)患者支气管肺泡灌洗液(BALF)和外周血中性粒细胞膜蛋白质和还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶蛋白亚单位p47-PHOX和p67-PHOX因子磷酸化表达.方法 选择15例IPF患者为病例组,7例无器质性肺疾病者为对照组.采用细胞色素C还原法测定外周血中性粒细胞释放超氧阴离子水平,采用免疫细胞化学法和Western免疫印迹法检测BALF和外周血中性粒细胞膜蛋白质和NADPH氧化酶p47-PHOX和p67-PHOX因子磷酸化表达.结果 BALF中性粒细胞膜蛋白质磷酸化,IPF组平均吸光度值(0.19±0.02)显著高于对照组(0.14±0.01);IPF组外周血中性粒细胞膜相对分子质量为80 000、58 000、45 000蛋白质的磷酸化表达和p47-PHOX和p67-PHOX因子的磷酸化表达(强阳性)均较对照组(弱阳性)显著增强.IPF组中性粒细胞释放超氧阴离子的水平与用力肺活量、第一秒用力呼气容积、动脉血氧分压、一氧化碳弥散量呈显著负相关.结论 外周血中性粒细胞释放超氧阴离子水平与肺纤维化程度存在一定关系.NADPH氧化酶p47-PHOX和p67-PHOX因子在IPF患者中表达增加.
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c-src/NADPH氧化酶1/活性氧对中性粒细胞弹力蛋白酶诱导气道黏蛋白5 AC表达的影响
目的 探讨中性粒细胞弹力蛋白酶(NE)诱导气道黏液高分泌的上游信号调节机制.方法 体外培养人气道BEAS-2B上皮细胞,将细胞分为空白对照组(不加任何刺激)、NE组(NE刺激)、NE+PP2组(NE刺激合并c-src抑制剂PP2)、NE+c-src siRNA组(NE刺激合并c-src siRNA)、NE+Noxl siRNA组[NE刺激合并NADPH氧化酶1(Nox1)siRNA]、阴件siRNA对照组(加入阴性对照siRNA)及NE+阴性siRNA组(NE刺激合并阴性对照siRNA)为干预条件.检测干预前后各组细胞巾活性氧含量、NoxI蛋白含量、黏蛋白5AC的蛋白及mRNA水平.用四甲基偶氮唑盐法测定各组细胞活性;活性氧试剂盒测定活性氧相对含量;逆转录PCR法检测各组黏蛋白5AC mRNA水平;ELISA法分析细胞黏蛋白5AC的蛋白相对含量;Western blot法检测Noxl蛋白及c-src蛋白的相对含量.结果 NE组细胞中Nox1蛋白相对含量为0.88±0.12,高于空白对照组的0.32±0.09(t=9.12.P=0.003);活性氧相对含量为0.76±0.09,高于空白对照组的0.18±0.02(t=9.44,P=0.003);黏蛋白5AC蛋白相对含量为0.82±0.09,基因转录水平为0.77±0.05,均高于空白对照组(分别为0.21±0.11和0.18±0.08,t值分别为7.75和6.13,P值分别为0.004和0.006).NE+c-src siRNA组细胞的Nox1蛋白相对含(0.39±0.08)、活性氧相对含量(0.29±0.05)均低于NE组(t值分别为5.43和5.60,均P=0.007);黏蛋白5AC蛋白相对含量(0.38±0.09)及mRNA水平(0.41±0.04)低于NE组(t值分别为5.28和4.09,P值分别为0.008和0.034).NE+PP2组活性氧相对含量为0.41±0.11,Nox1蛋白相对含量为0.44±0.05,黏蛋白5AC蛋白及mRNA水平分别为0.48±0.08和0.46±0.07,均低于NE组(均P<0.05).NE+Noxl siRNA组中活性氧相对含量(0.19±0.06)、黏蛋白5AC蛋白相对含量(0.31±0.05)及mRNA水平(0.32±0.06)也低于NE组(均P<0.05).结论 c-src/Noxl参与了NE诱导的活性氧活化,是气道上皮细胞黏蛋白5AC合成及分泌的上游信号调节因子.
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还原型辅酶Ⅱ氧化酶抑制剂对慢性间歇缺氧大鼠血压的影响及相关机制
目的 探讨还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶抑制剂罗布麻宁对慢性间歇缺氧(CIH)模型大鼠血压可能的影响及相关作用机制.方法 使用随机数字表法将30只雄性SD大鼠分为健康对照组、CIH组及罗布麻宁治疗组,每组10只.采用气囊加压法测定大鼠尾动脉收缩压,应用实时PCR检测外周血单核细胞NADPH氧化酶亚基p22phox的mRNA表达,并用Western blot检测胸主动脉组织匀浆中p22phox蛋白的表达,采用比色法测定胸主动脉组织匀浆中一氧化氮及超氧阴离子含量,采用化学比色法测定大鼠外周血丙二醛及超氧化物歧化酶(SOD)水平.各组均数之间比较采用单因素方差分析,组内两两比较采用SNK-q检验.结果 CIH组p22phox mRNA(2.85±0.47)及其蛋白(0.63±0.15)的表达明显高于健康对照组(2.26±0.48,0.27 ±0.13,q值分别为3.202、6.522,均P＜0.05),罗布麻宁治疗组p22phox mRNA(2.75±0.50)及其蛋白(0.57±0.16)的表达与CIH组比较两组无明显差异,但治疗后可显著逆转由慢性间歇缺氧导致的丙二醛、超氧阴离子及尾动脉收缩压的升高以及SOD和一氧化氮水平的降低.结论 NADPH氧化酶亚基p22phox的过度表达在慢性间歇缺氧导致的高血压发生过程中起重要作用,这可能是OSAHS患者并发高血压的病理生理基础之一;抑制NADPH氧化酶的活性可能对OSAHS合并高血压的治疗有一定积极的意义.
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NADPH氧化酶p22phox亚基基因多态性与高血压左心室肥厚的相关性
目的 探讨中国汉族人群中NADPH氧化酶p22phox亚基C242T基因多态性与高血压左心室肥厚(LVH)的相关性.方法 连续收入初诊汉族原发性高血压患者286例,超声心动图评估并计算患者左心室质量指数,将患者分为单纯高血压和高血压合并LVH,并记录体质量指数、血压、血糖和血脂等.同时,采用限制性片段长度多态性鉴定p22phox亚基C242T基因型.结果 全部患者中均未检出TT基因型,而高血压合并LVH的患者中CT基因型(P=0.002)和T等位基因出现的频率(P=0.005)均显著高于单纯高血压患者.Logistic回归分析显示p22phox亚基C242T多态性与性别、收缩压同为高血压合并LVH的独立影响因素,存在T突变的高血压患者合并LVH的风险降低63%(P=0.007).结论 CYBA C242T多态性与中国汉族高血压患者LVH相关,T等位基因可能是LVH的保护因素.
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辛伐他汀对高糖损伤乳鼠心肌细胞氧化应激的影响
目的 探讨辛伐他汀对高糖损伤乳鼠心肌细胞内还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶-活性氧通路的干预作用.方法 培养新生1～3 d SD雄性大鼠心肌细胞,随机分为对照组、高浓度葡萄糖刺激组(GS组)、不同浓度辛伐他汀干预组[分别为GS+ 10 7 mol/L Sim组(GS+10-7 MSim组)、GS+ 10 6 mol/L Sim组(GS+ 10-6 MSim组)、GS+ 10-5 mol/LSim组(GS+10-5 MSim组)].以MTT比色法测定各组心肌细胞活力；化学比色法测定心肌细胞丙二醛含量、超氧化物歧化酶活力及活性氧水平；RT-PCR检测细胞内NADPH氧化酶p22phox mRNA、p47phox mRNA的表达水平.结果 与GS组比较,GS+ 10 7 MSim组、GS-10 6 MSim组、GS+ 10-5 MSim组丙二醛含量、活性氧水平明显降低,p22phox mRNA、p47phox mRNA表达明显下调,超氧化物歧化酶活力明显升高(P＜0.05).结论 心肌细胞内NADPH氧化酶源性的活性氧升高是介导高糖损伤心肌细胞的重要机制,辛伐他汀可能通过抑制NADPH氧化酶-活性氧通路减轻心肌细胞损伤.
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硫氧还蛋白通过下调Nox4活性抑制血管内皮细胞黏附蛋白的表达
目的 探讨动脉粥样硬化始动环节中硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)对还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶Nox4亚型的作用,及其参与内皮细胞黏附蛋白表达的分子机制研究. 方法 应用腺病毒感染的方法在原代人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中建立高表达硫氧还蛋白(Ad-Trx)及其对照(Ad-GFP)的细胞模型.以致动脉粥样硬化重要危险因子氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)为刺激剂.用免疫印迹法检测细胞间黏附蛋白-1(ICAM-1)、Nox4及P22 phox的表达;用间接免疫荧光的方法检验Trx在细胞内的表达;提取细胞膜组织,用酶学方法测定内皮细胞NADPH氧化酶的活性;应用荧光探针DCFH-DA进行细胞内活性氧检测. 结果 Trx过表达及NADPH氧化酶特异性的抑制剂Apocynin可以显著下调ox-LDL刺激下内皮细胞ICAM-1的表达和活性氧产生.与对照组相比过表达Trx抑制了内皮细胞膜组分中ox-LDL刺激下Nox4的表达、NADPH氧化酶活性增加以及P22 phox的表达增加. 结论 Trx通过下调内皮细胞Nox4的活性,抑制内皮细胞ICAM-1的表达,减轻炎性损伤,保护内皮细胞功能.
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还原型辅酶Ⅱ氧化酶/血管过氧化酶途径促大鼠心肌缺血再灌注氧化损伤
目的 研究还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶/血管过氧化酶(NOX/VPO)途径在心肌缺血再灌注(I/R)氧化损伤中的作用和机制.方法 雄性SD大鼠分为正常对照组,假手术组,缺血再灌注组(I/R组,大鼠心肌缺血1h,再灌注3h),夹竹桃麻素(apocynin)处理组(I/R+ apocynin组,再灌注开始前30 min腹腔注射NOX特异性抑制剂apocynin)和溶媒对照组(I/R+ vehicle组,再灌注开始前30 min腹腔注射等体积apocynin溶媒).每组动物数为7～8只.再灌注结束后测定心肌梗死面积、血清肌酸激酶(CK)活性、心肌组织细胞凋亡率和心肌组织细胞凋亡蛋白酶(caspase-3)含量及活性、NOX活性、NOX2和VPO1 mRNA和蛋白表达水平.结果 I/R组VPO1、NOX2mRNA和蛋白表达水平、NOX2酶活性水平、CK水平、心肌梗死面积、心肌细胞凋亡率均显著高于假手术组[两组上述指标分别为2.01 ±0.20比1.01 ±0.10,0.02 ±0.39比1.12 ±0.08,1.15±0.14比0.52 ±0.08,0.82±0.08比0.53 ±0.07,(14.1 ±1.2)比(9.1±1.2) μmol· L-1· min-1· g-1,(2838.5 ±315.2)比(715.1±121.2) U/L,(52.1±2.1)％比(0.9±0.1)％和(23.5±3.5)％比(1.8±0.5)％,P均＜0.01].I/R+ apocynin组VPO1、NOX2mRNA和蛋白表达水平、NOX2酶活性水平、CK水平、心肌梗死面积、心肌细胞凋亡率[分别为1.51 ±0.20,0.76 ±0.06,(12.1 ± 1.0)μmol·L-1·min-1·g-1,(1795.2 ±206.3)U/L,(21.5±2.2)％和(8.9±2.3)％]均显著低于I/R组(P均＜0.01).I/R+vehicle组上述指标与I/R组比较差异均无统计学意义.结论 NOX2/VPO1途径在I/R氧化损伤中起重要作用,VPO1与NOX2可能以H2O2为中介,共同促进了I/R造成的氧化损伤.
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NADPH氧化酶DUOX1在肝细胞癌中的表达及临床意义
目的 探讨NADPH氧化酶DUOX1在肝细胞癌(HCC)中的表达及其与临床病理指标及预后的关系.方法 选取7株人HCC细胞系及1株人正常肝细胞系、30例正常肝组织及103例肝癌标本作为研究对象,采用RT-PCR的方法研究DUOX1 mRNA的表达情况,结合临床病理指标及预后进行分析. 结果 DUOX1 mRNA在MHCC-97H、MHCC-97L及BEL7402细胞系中表达,在HepG2、Hep3B、SMMC-7721、Chang liver 和LO2中无表达.30例正常肝组织中均无表达.在肝癌和癌旁肝组织中表达阳性率分别为53.4%(55/103)和14.5%(15/103),差异有高度统计学意义(P <0.01).相关性统计分析提示肝癌组织中DUOX1 mRNA表达状态与性别、年龄、有无卫星结节及术前AFP水平相关.单因素分析提示影响肝癌术后总体生存率的因素为性别、年龄、肿瘤直径、有无卫星结节、有无门静脉癌栓、TNM分级以及DUOX1 mRNA表达状态.多因素分析提示影响肝癌术后总体生存率的因素为肿瘤直径、有无门静脉癌栓及DUOX1 mRNA表达状态.结论 肝癌组织DUOX1 mRNA表达状态是肝癌术后总体生存的独立预后因素,DUOX1基因可能与肝癌的发生发展有关.
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极低出生体重儿中性粒细胞呼吸爆发功能的研究
目的 探讨极低出生体重儿中性粒细胞呼吸爆发功能. 方法 以2012年7月1日至2012年12月31日收住复旦大学儿科医院的22例极低出生体重儿(very low birth weight infant,VLBWI)为VLBWI组,根据有无新生儿呼吸窘迫综合征(neonatal respiratory distress syndrome,NRDS),分为NRDS组和无NRDS组,各11例.以同期在上海市闵行区妇幼保健院出生的20例正常足月新生儿为对照.所有新生儿均排除早发型败血症.VLBWI组入院时留取桡动脉血1.5 ml,足月儿组出生时留取脐带血1.5 ml.对早产儿和足月儿进行中性粒细胞呼吸爆发功能检测,使用佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)刺激中性粒细胞活化后,将二氢若丹明123(dihydrorhodamine-1,2,3,DHR)氧化为发出黄绿色荧光的若丹明123,用流式细胞仪检测荧光强度以评价中性粒细胞呼吸爆发功能.使用荧光标记的细胞色素b558单克隆抗体(7D5)标记,用流式细胞仪检测中性粒细胞gp91Phox的表达.采用Mann-Whitney U检验进行统计学分析.结果 无刺激时,VLBWI组发生呼吸爆发的中性粒细胞比例为(49.10±20.19)％,高于足月儿组的(18.73±6.81)％(Z=-4.911,P=0.000).PMA刺激后VLBWI组发生呼吸爆发的中性粒细胞比例为(96.58±3.44)％,高于足月儿组的(99.20±0.62)％,差异有统计学意义(Z=-3.186,P=0.001).VLBWI组中性粒细胞刺激指数为171.40±103.35,低于足月儿组的306.30±138.47,差异有统计学意义(Z=-3.413,P=0.001).VLBWI组中性粒细胞表达gp91Phox荧光强度几何均数为21.66±19.87,而足月儿组为19.60±8.03,2组差异无统计学意义(Z=-0.934,P=0.350).VLBWI组表达gp91Phox的中性粒细胞比例为(56.11±29.40)％,低于足月儿组的(80.14±14.87)％,差异有统计学意义(Z=-2.374,P=0.018).无刺激时,NRDS组发生呼吸爆发的中性粒细胞比例为(63.40±16.45)％,高于无NRDS组的(34.80±11.65)％,差异有统计学意义(Z=-3.382,P=0.001).NRDS组中性粒细胞刺激指数为129.46±75.36,低于无NRDS组的213.35±113.49,差异有统计学意义(Z=-2.331,P=0.020). 结论 VLBWI及足月儿出生时无刺激时发生呼吸爆发的中性粒细胞比例较高,VLBWI更为明显,极低出生体重儿和足月儿出生时中性粒细胞均表达蛋白gp91Phox.NRDS患儿中性粒细胞呼吸爆发功能及gp91Phox表达与无NRDS患儿比较,有降低趋势.
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脂筏对子宫颈癌细胞生长的影响
目的 探讨脂筏对子宫颈癌细胞生长的影响并初步探讨其作用机制.方法 将HeLa细胞系分为不处理对照组、脂筏干扰剂组及NADPH氧化酶抑制剂组,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定各组培养24h后的细胞存活率,Western blot法检测各组细胞内缺氧诱导因子1α(HIF-1α)蛋白相对含量.结果 与对照组相比脂筏干扰剂组细胞的生长速度明显减慢(0.612±0.051与0.984±0.034),NADPH氧化酶抑制剂组显示了类似的效应(0.591±0.074与0.984±0.034),差异有统计学意义(t=4.062,P＜ 0.05).与对照组相比脂筏干扰剂组及NADPH氧化酶抑制剂组HIF-1α的表达量也明显降低(1.79±0.14与2.56±0.22; 1.54±0.12与2.56±0.22),差异有统计学意义(t=2.423,P＜ 0.05).结论 脂筏可能通过NADPH氧化酶激活途径激活HIF-1α及其下游原癌基因促进子宫颈癌细胞的生长,脂筏干扰剂及NADPH氧化酶抑制剂可能成为子宫颈癌药物治疗新的研究方向.
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NAD(P)H氧化酶p22phox亚基C242T基因多态与颈动脉粥样硬化
目的 探讨在中国青岛地区汉族人群中NAD(P)H氧化酶p22phox亚基C242T基因多态与颈动脉粥样硬化(CA)的相关性.方法 共收集138例CA患者和130名对照者,用聚合酶链反应-限制性片段长度多态分析(PCR-RFLP)方法确定其基因型,计数资料比较应用卡方检验.结果 CA组和对照组的CT基因型频率分别为0.268和0.139,两组差异具有统计学意义(X2=6.899,P=0.009),未发现有TT基因型.CA组的T等位基因频率亦高于对照组(X2=6.110,P=0.013).多元逐步Logistic回归分析显示收缩压、血糖、低密度脂蛋白胆固醇、吸烟以及CYBA基因C242T多态都是CA的独立危险因素.结论 NAD(P)H氧化酶p22phox亚基C242T多态可能是CA的一个危险因素.
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艾塞那肽对1型糖尿病大鼠肾脏NADPH氧化酶亚单位表达的影响
目的 观察胰高血糖素样肽1(GLP-1)受体激动剂艾塞那肽对链脲佐菌素(STZ)诱导的1型糖尿病大鼠肾脏NADPH氧化酶亚单位NOX4和p22phox,以及结缔组织生长因子(CTGF)表达的影响,探讨艾塞那肽对糖尿病大鼠肾脏的保护作用及其机制.方法 30只雄性SD大鼠随机分为正常对照组(A组,n=7)和糖尿病造模组(n=23).采用STZ诱导1型糖尿病大鼠模型,共有19只大鼠造模成功.将造模成功的糖尿病大鼠随机分为糖尿病对照组(B组,n=10)和艾塞那肽治疗组(C组,n=9).C组予以艾塞那肽5μg/kg,2次/d皮下注射,A组和B组给予等量生理盐水皮下注射.艾塞那肽治疗8周后放血处死动物,测定血生化指标及尿白蛋白排泄率,并计算肾脏指数,采用实时荧光定量PCR法测定肾脏NOX4和p22phox mRNA的表达,免疫组化法检测肾脏组织CTGF蛋白的表达及分布.结果 与A组比较,B组糖尿病大鼠血糖、血脂、血肌酐、尿素氮、尿白蛋白排泄率、肾脏指数、肾脏NOX4和p22phox mRNA以及CTGF蛋白表达均显著升高(p＜0.05).经艾塞那肽治疗后,大鼠血脂、血肌酐、尿素氮、尿白蛋白排泄率、肾脏指数、肾脏NOX4和p22phox mRNA以及CTGF蛋白表达显著降低(P＜0.05),但血糖与B组比较无明显变化(P＞0.05).结论 艾塞那肽可使1型糖尿病大鼠肾脏NOX4、p22phox和CTGF表达降低,尿蛋白减少,肥大减轻,对肾脏有保护作用.
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熊果酸对TGF-β1诱导肝细胞凋亡的抑制作用及其机制
目的 研究熊果酸(UA)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导肝细胞凋亡的干预作用及其机制.方法 采用原位灌注法分离健康SD大鼠原代肝细胞,随机分成空白对照组、UA自身对照组(UA 25μmol/L)、TGF-β1组(TGF-β12.5ng/ml)、UA干预组(UA 25μmol/L+TGF-β12.5ng/ml)、DPI干预组(DPI 0.5μmol/L+TGF-β12.5ng/ml).药物作用相应时间后,采用流式细胞术检测肝细胞增殖及凋亡情况,荧光定量PCR法检测肝细胞内CD95(Fas) mRNA的表达,Western blotting检测肝细胞内CD95蛋白的表达以及NADPH氧化酶(NOX)亚基p47phox移位至胞膜的蛋白量,并采用活性氧(ROS)检测试剂盒检测肝细胞内ROS水平.结果 在TGF-β1刺激肝细胞前30min加入UA进行干预可明显降低TGF-β1诱导的肝细胞凋亡率(80.53％±1.56％vs 63.97％±3.19％,P＜0.01),肝细胞增殖指数明显增加(10.83％±2.03％vs 18.67％±1.60％,P＜0.01),细胞内CD95 mRNA及蛋白表达均明显下调(2.40±0.25 vs 1.28±0.15,P＜0.01;1.37±0.18vs 1.05 ± 0.15,P＜0.05),p47phox向膜移位明显减少(1.76±0.22 vs 1.13±0.12,P＜0.01),肝细胞中ROS水平明显降低(3.23±0.53vs2.12±0.45,P＜0.01).结论 UA可能通过抑制肝细胞内NOX激活,减少ROS产生,下调CD95的表达来抑制TGF-β1诱导的肝细胞凋亡.
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晚期糖基化终产物诱导单核细胞产生细胞因子的细胞内信号传导机制
目的探讨晚期糖基化终产物(AGE)诱导单核细胞产生白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-ɑ(TNF-ɑ)的细胞内信号传导机制.方法采用密度梯度离心法分离健康成人外周血单核细胞,经AGE修饰的人血清白蛋白(AGE-HSA)刺激后,用 ELISA法检测培养上清中IL-1β、TNF-ɑ水平,用化学发光法测定活性氧的生成;免疫细胞化学染色及凝胶迁移电泳(EMSA)法观察核因子-κB(NF-κB/p65)的激活.分别用抗AGE受体(RAGE)抗体、NADPH氧化酶特异性抑制剂apocynin和p38通路抑制剂SB 203580预处理单核细胞,观察对AGE-HSA诱导细胞因子和活性氧产生的影响.结果 AGE-HSA与单核细胞在体外共同培养后,细胞内NF-κB激活,培养上清中IL-1β、TNF-ɑ水平明显增高,活性氧生成增加;用抗RAGE抗血清或apocynin预处理细胞可阻断AGE-HSA诱导的活性氧生成(P<0.01),抑制NF-κB的活化并使培养上清IL-1β、TNF-ɑ显著降低(P<0.01).用SB 203580预处理细胞也可抑制AGE-HSA诱导的NF-κB激活及IL-1β、TNF-ɑ的产生,但对活性氧的产生无明显影响 (P>0.05).结论 AGE通过RAGE介导的途径刺激单核细胞生成IL-1β、TNF-ɑ和活性氧,NADPH氧化酶途径可能是RAGE细胞内信号途径的上游,而AGE诱导的细胞因子生成依赖于p38磷酸化.
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过度训练对大鼠腹膜巨噬细胞活性氧生成能力的影响及其相关机制研究
目的:了解过度训练对巨噬细胞活性氧生成能力的影响及其相关机制.方法:8周龄健康雄性Wistar大鼠16只,随机分为安静对照组和过度训练组,每组8只.过度训练组进行11周递增负荷跑台训练,后一次训练结束后36 h断头处死,分离纯化腹膜巨噬细胞.流式细胞术测定其活性氧( ROS)生成量,荧光定量PCR技术测定NADPH氧化酶gp91phox、p22phox、p47phox亚基和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)基因表达.结果:与安静对照组相比,过度运动组巨噬细胞ROS生成量显著降低(P=0.003),gp91phox、p22phox亚基表达量无显著变化(P＞0.05),p47phox亚基表达量显著增加(P＜0.05),G6PD表达量无显著差异(P＞0.05).结论:过度训练可显著降低大鼠腹膜巨噬细胞ROS生成水平,这并非通过抑制NADPH氧化酶亚基表达和抑制NADPH氧化酶生成途径实现,可能有其它调控机制参与.
关键词： 过度训练 巨噬细胞 活性氧 NADPH氧化酶 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶
