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高糖对大鼠系膜细胞NADPH氧化酶的影响
目的 探讨高糖对大鼠系膜细胞NADPH氧化酶表达及活性的影响.方法 高糖体外培养大鼠系膜细胞,RT-PCR技术检测系膜细胞内NADPH氧化酶亚基p22phox mRNA的表达,流式细胞术检测超氧离子(.O2-)和过氧化氢(H2O2)反映NADPH氧化酶活性.结果 高糖(10mM)培养3天及5天组,p22phox mRNA表达较正常组和培养1天组升高(P<0.05).随着葡萄糖浓度升高和作用时间的延长随着葡萄糖浓度升高和作用时间的延长,.O2-和H2O2的表达增多(P<0.05).结论 高糖使系膜细胞NADPH氧化酶表达增多、活性增强.
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NADPH氧化酶在氟诱导小胶质细胞氧化应激中的作用
目的:观察NADPH氧化酶在氟引起的小胶质细胞氧化应激中的作用,为进一步研究氟致中枢神经系统损伤机制提供实验依据.方法:用1,5,10,25,50,100 mg/L的氟化钠处理BV-2小胶质细胞6,12,24h后,检测细胞活力、细胞内活性氧(ROS)含量,以及NADPH氧化酶抑制剂API处理后的小胶质细胞ROS水平变化情况.结果:BV-2小胶质细胞细胞氟化钠染毒后,细胞活力显著降低,差异有统计学意义(P＜0.05).染毒组细胞内ROS含量显著高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).与单独染氟组相比,NADPH氧化酶抑制荆API能够显著降低氟化钠诱导的BV-2细胞内活性氧(ROS)含量.结论:氟能引起小胶质细胞氧化应激,NADPH氧化酶在氟诱导的ROS产生中起一定作用.
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芝麻素对高糖损伤SH-SY5Y细胞的保护效果及机制
目的 研究芝麻素(sesamin)对高糖所致人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞损伤的保护作用及其机制.方法 SH-SY5Y细胞接种于含100 mmol/L葡萄糖的培养基并与10、20、40 μmol/L芝麻素共同孵育36 h,MTT法测定细胞存活率,比色法测定细胞培养液乳酸脱氢酶(LDH)水平,ELISA检测DNA片段及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)活性.2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)探针法检测细胞中活性氧(ROS)的水平,试剂盒检测细胞内丙二醛(MDA)、超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和还原型谷胱甘肽(GSH)活性.光度法检测细胞烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶活性,实时荧光定量检测NADPH氧化酶亚基p47phox mRNA表达.Western blot法检测p47phox蛋白表达.结果 芝麻素可增加高糖作用下SH-SY5Y细胞的存活率,抑制细胞LDH释放,阻止高糖诱导的DNA断裂,降低Caspase-3活性.同时芝麻素能够增加高糖作用下SH-SY5Y细胞内SOD、CAT和GSH的活性,清除细胞内的ROS,抑制NADPH氧化酶活性及p47phox mRNA和蛋白的表达.结论 芝麻素对高糖诱导SY5Y细胞损伤具有保护作用,其机制可能与抗氧化和抑制NADPH氧化酶活性有关.
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筋脉通含药血清对高糖培养的Schwann细胞诱导型一氧化氮合酶和NADPH氧化酶p22-phox亚基表达的影响
目的:探讨筋脉通含药血清对高糖培养的Schwann细胞诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)蛋白表达及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶p22-phox亚基mRNA表达的影响.方法:雄性Wistar大鼠随机分为3组,分别灌胃筋脉通、维生素C或蒸馏水制备含药血清和对照血清.取新出生大鼠的双侧坐骨神经用于制备Schwann细胞.将体外培养的Schwann细胞分为高糖组、筋脉通组(加入筋脉通含药血清)、维生素C组(加入维生素C含药血清)及正常对照组.培养48 h后,采用免疫荧光法检测Schwann细胞内iNOS蛋白的表达,实时荧光定量聚合酶链式反应法检测NADPH氧化酶p22-phox亚基mRNA的表达.结果:高糖培养的Schwann细胞内iNOS蛋白表达及NADPH氧化酶p22-phox亚基mRNA 表达均较正常对照组明显升高(P＜0.01);与高糖组比较,筋脉通组iNOS蛋白表达及NADPH氧化酶p22-phox亚基mRNA表达明显降低(P＜0.01),且明显优于维生素C组(P＜0.01).结论:筋脉通含药血清可以下调高糖培养的Schwann细胞iNOS蛋白及NADPH氧化酶p22-phox亚基mRNA的表达.
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晚期氧化蛋白产物通过 NADPH 氧化酶途径诱导MC3 T3-E1细胞产生ROS
目的：研究晚期氧化蛋白产物( AOPP )通过 NADPH 氧化酶途经诱导小鼠成骨样细胞(MC3T3-E1)产生ROS。方法实验分为空白对照组、RSA(鼠血清白蛋白)组、AOPP组。培养MC3T3-E1细胞,加入RSA和不同浓度的AOPP,用2,7-二氯二氢荧光素二乙酯为荧光探针流式细胞仪检细胞内活性氧簇(ROS)的生成量。在阻断实验中,MC3T3-E1细胞分别与各种可能产生活性氧的酶的抑制剂孵育后加入AOPP,观察阻断剂对ROS生成的阻断作用。采用Western印迹和免疫荧光法观察NADPH氧化酶亚基的变化。结果分别采用50、100、200μg/ml AOPP刺激MC3T3-E1细胞,细胞ROS的生成随着AOPP浓度的升高而逐渐增加,其中200μg/ml AOPP产生的ROS多(P<0.05)。 AOPP诱导MC3T3-E1生成ROS还表现为时间依赖性,AOPP刺激30 min即可引起ROS生成增加(P<0.05),3 h达峰。加入不同的酶阻断剂后,仅NADPH氧化酶抑制剂二苯碘鎓( DPI)、夹竹桃麻素( apocynin)、胞浆型超氧化物歧化酶C-SOD抑制了ROS的生成(P<0.05)。同时,AOPP刺激后p47phox有明显的膜迁移,并可诱导MC3T3-E1细胞Nox4蛋白表达上调。结论 AOPP通过NADPH氧化酶途径诱导MC3T3-E1细胞产生ROS,推测这可能是AOPP参与骨质疏松发病的机制。
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辛伐他汀对高糖损伤乳鼠心肌细胞NADPH氧化酶亚基基因表达的影响
取原代培养的SD雄性乳鼠心肌细胞在高糖刺激下加入10-7、10-6和10-5mol/L辛伐他汀作用72 h.结果显示,与对照组比较,高糖组心肌细胞活力明显降低(P＜0.01),乳酸脱氢酶(LDH)活性显著增加(P＜0.01),NADPH氧化酶亚基p22phox、p47phox mRNA表达和活性氧簇(ROS)水平明显增高(均P＜0.05);与高糖组比较,辛伐他汀各组心肌细胞活力明显增加(P＜0.05),LDH活性显著降低(P＜0.05),p22phox、p47phox mRNA表达和ROS水平明显降低,且辛伐他汀浓度对心肌细胞活力的影响呈剂量依赖效应.这些结果提示辛伐他汀能够抑制NADPH氧化酶亚基的基因表达,减轻高糖引起的心肌损伤.
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熊果酸对活化型肝星状细胞信号通路的影响
目的 观察熊果酸对血小板衍生生长因子(PDGF)诱导的大鼠活化型肝星状细胞株(HSC-T6)还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX)活化及下游信号通路激活的影响.方法 取大鼠HSC-T6,分为空白对照组(不予处理)、熊果酸对照组(50 μmol/L)、PDGF组(10 μg/L)、熊果酸干预组(50 μ mol/L熊果酸+10μg/L PDGF)、二联苯碘干预组(20μmol/L二联苯碘+10 μg/L PDGF)、SB203580干预组(10 μmol/L SB203580+ 10 μg/LPDGF)、LY294002干预组(10 μmol/L LY294002+10 μg/L PDGF)、活性氧阳性对照组(5μg/mL活性氧试剂rosup).采用荧光定量-PCR法检测除活性氧阳性对照组外的其余各组细胞中Ⅰ型胶原mRNA的表达水平.采用Western印迹法检测膜蛋白NOX亚基p47phox(除外活性氧阳性对照组)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K,除外活性氧阳性对照组和SB203580干预组)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt,除外活性氧阳性对照组和SB203580干预组)、磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(除外活性氧阳性对照组和LY294002干预组)的表达.采用活性氧检测试剂盒和荧光酶标仪检测除SB203580干预组和LY294002干预组外的其余各组细胞内荧光强度.组间比较行单因素方差分析和LSD检验.结果 Ⅰ型胶原mRNA表达水平,PDGF组(3.74±0.32)高于空白对照组(1.00土0.00),熊果酸对照组(0.21±0.02)低于空白对照组,熊果酸干预组(1.02±0.12)、二联苯碘干预组(1.09±0.21)、SB203580干预组(1.18±0.27)、LY294002干预组(1.15±0.26)均低于PDGF组,差异均有统计学意义(t=15.667、-4.501、-15.553、-15.154、-14.642、-14.813,P均＜0.05).p47phox蛋白表达水平,PDGF组(1.98±0.53)高于空白对照组(1.00±0.00),熊果酸对照组(0.48±0.10)低于空白对照组,熊果酸干预组(0.95±0.26)、二联苯碘干预组(0.99±0.28)、SB203580干预组(0.93±0.31)、LY294002干预组(1.07±0.19)均低于PDGF组,差异均有统计学意义(t=4.209、-2.234、-4.424、-4.252、-4.510、-3.909,P均＜0.05).PI3K蛋白表达水平,PDGF组(2.27±0.46)高于空白对照组(1.00±0.00),熊果酸干预组(0.59±0.28)低于PDGF组和空白对照组,熊果酸对照组(0.14±0.07)低于空白对照组,二联苯碘干预组(0.53±0.25)、LY294002干预组(0.35±0.14)均低于PDGF组,差异均有统计学意义(t=6.205、-8.208、-2.003、-4.202、-8.502、-9.831,P均＜0.05).p-Akt蛋白表达水平,PDGF组(2.54±0.49)高于空白对照组(1.00±0.00),熊果酸干预组(0.74±0.20)、二联苯碘干预组(0.94±0.37)、LY294002干预组(1.17±0.41)均低于PDGF组,熊果酸对照组(0.59±0.15)低于空白对照组,差异均有统计学意义(t=5.927、-6.928、6.158、-5.273、-1.578,P均＜0.05).磷酸化p38MAPK蛋白表达水平,PDGF组(1.98±0.35)高于空白对照组(1.00±0.00),熊果酸干预组(0.68±0.28)、二联苯碘干预组(0.63±0.27)、SB203580干预组(0.67±0.29)均低于PDGF组,熊果酸对照组(0.28±0.13)低于空白对照组,差异均有统计学意义(t=4.897、-6.479、-6.727、-6.529、-3.561,P均＜0.05).活性氧水平,PDGF组(105.57±7.51)高于空白对照组(69.60±8.63),熊果酸干预组(64.56±9.11)、二联苯碘干预组(65.75±6.62)均低于PDGF组,熊果酸对照组(29.84±3.19)低于空白对照组,差异均有统计学意义(t=6.368、-7.288、-7.071、-7.255,P均＜0.05).结论 熊果酸或可抑制PDGF诱导的大鼠HSC-T6细胞内NOX亚基p47phox蛋白膜移位及活性氧的产生,进而阻断PI3K-蛋白激酶B、p38MAPK信号通路的磷酸化及Ⅰ型胶原mRNA的表达.
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神经性勃起功能障碍大鼠阴茎海绵体内氧化应激状态研究
目的：通过海绵体神经损伤建立神经性勃起功能障碍大鼠，研究其阴茎海绵体组织内氧化应激状态，及其对于大鼠阴茎勃起功能的影响。方法取成年雄性SD大鼠60只，随机分为3组：A组为假手术组（Sham组）， B组为单侧海绵体神经切断组，C组为双侧海绵体神经切断组。各组大鼠造模手术后8周，进行勃起功能试验后处死，取大鼠阴茎海绵体组织，测定大鼠阴茎海绵体组织中超氧化物歧化酶（SOD）水平、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）及内皮型一氧化氮合酶（eNOS）活力，丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）含量，以及NADPH氧化酶gp91phox和p22phox亚基的mRNA表达情况。结果单侧海绵体神经损伤组和双侧海绵体神经损伤组的阴茎海绵体组织SOD水平、GSH-PX活性低于假手术组。单侧海绵体神经损伤组和双侧海绵体神经损伤组的阴茎海绵体组织MDA含量高于于假手术组。单侧海绵体神经损伤组和双侧海绵体神经损伤组的阴茎海绵体组织NO浓度和eNOS活力均低于假手术组。单侧海绵体神经损伤组和双侧海绵体神经损伤组的阴茎海绵体组织内NADPH氧化酶的gp91phox亚基和p22phox亚基mRNA的相对表达倍数均高于假手术组。结论通过对大鼠阴茎海绵体组织氧化应激相关指标（SOD、GSH-PX、MDA）、血管内皮功能相关指标（NO、eNOS）以及NADPH氧化酶功能亚基mRNA的相对表达倍数的测定，单侧海绵体神经损伤组和双侧海绵体神经损伤组的上述指标与假手术组之间均存在统计学差异，说明大鼠海绵体神经损伤致阴茎勃起功能障碍的过程中，除了本身神经损伤以外，阴茎海绵体组织的氧化应激以及NADPH氧化酶相关的阴茎海绵体血管内皮损伤也是大鼠神经性ED的发生、发展的重要机制之一。
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NADPH酶及活性氧与男性勃起功能障碍
男性性功能是一个复杂的生理过程,由一系列条件反射和非条件反射活动来完成.阐明勃起的调节机制可以为治疗提供理论依据,一氧化氮(NO)被认为在勃起生理中起非常重要的作用,研究显示增加其他活性氧可以减少NO产牛和生物利用度,导致内皮功能受损和勃起功能障碍(ED)[1].大量证据表明:活性氧(ROS)在正常生理功能和不同疾病发病机制中起重要作用.ROS通过非酶途径和酶途径产生,例如NADPH酶、黄嘌呤氧化酶、非配对内皮NO合成酶、细胞色素P450和线粒体呼吸链.在正常状态F,通过胞内抗氧化酶,包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化酶和谷胱甘肽还原酶,细胞内抗氧化系统和ROS产生处于动态平衡,细胞通过上调抗氧化酶活性对抗增加的ROS的副作用[2].
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NCF2基因突变致儿童慢性肉芽肿病临床特点分析
目的 探讨NCF2基因突变所致儿童慢性肉芽肿的临床特点并基因分析.方法 回顾分析1例因肺内多发结节影而被发现的慢性肉芽肿患儿的临床资料及基因检测结果,并复习相关文献.结果 患儿,女,生后20天因呼吸道感染症状行胸部CT检查发现双肺多发类圆形结节影,中性粒细胞活化刺激试验显示未见刺激活化细胞.基因测序显示NCF2基因纯合突变,c.233G>A;p.(Gly78Glu).确诊为儿童慢性肉芽肿病.结论 对于无明显诱因出现反复感染、肺部多发结节,但免疫球蛋白水平及淋巴细胞亚群无异常的患儿应考虑慢性肉芽肿可能,中性粒细胞活化刺激试验有助于诊断,终诊断依靠基因检测.
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熊果酸对活化型肝星状细胞NADPH氧化酶亚基p47Phox表达及ERK1/2信号通路活化的影响
目的 研究熊果酸(ursolic acid,UA)对瘦素诱导的大鼠肝星状细胞(HSC-T6) NADPH氧化酶(NOX)亚基p47Phox表达及ERK1/2信号通路活化的影响,并观察I 型胶原合成及细胞增殖情况.方法 将培养激活的HSC-T6细胞株分为6组:正常对照组,不加任何药物；瘦素组,给予重组大鼠瘦素(100 ng/ml)刺激细胞；各干预组分别给予UA (50 μmol/L)、JAK抑制剂AG490 (50 μmol/L)、NOX抑制剂DPI (20μmol/L)、ERK抑制剂PD98059(30 μmol/L)预处理30 min,再加入瘦素刺激不同时间.采用蛋白质印迹分析检测细胞膜移位的p47Phox蛋白、细胞总p47Phox蛋白和磷酸化的ERK1/2(p-ERK1/2)蛋白表达；采用RT-PCR法检测 I型胶原mRNA的表达；采用MTT法检测细胞增殖.结果 瘦素刺激HSC-T6细胞30 min后细胞膜p47Phox蛋白表达较正常对照组增高(P＜0.01),细胞内p-ERK1/2蛋白表达也随之增高(P＜0.05)；UA、AG490、DPI、PD98059干预后抑制了p47Phox蛋白向细胞膜移位以及细胞内ERK1/2蛋白磷酸化.瘦素刺激HSO-T6细胞12h后I 型胶原的mRNA表达较正常对照组升高(P＜0.01),UA、AG490、DPI及PD98059干预组I 型胶原mRNA的表达均低于瘦素组(P均＜0.01).瘦素刺激HSC-T6细胞12、24、48 h后细胞增殖率高于正常对照组(P均＜0.01)；UA、AG490、DPI及PD98059干预不同时间点的细胞增殖率均低于瘦素组(P均＜0.01),UA的抑制细胞增殖作用弱于DPI(P＜0.01).结论 UA能抑制瘦素诱导的HSC-T6细胞增殖及I 型胶原表达,机制可能与抑制NOX亚基p47Phox向细胞膜移位及下游信号通路ERK1/2的激活有关.
关键词： 熊果酸 肝星状细胞 NADPH氧化酶 细胞外信号调节激酶类 细胞增殖 -
通络方剂对糖尿病大鼠肾脏氧化应激的影响
目的:研究两种剂型通络方剂(超微粉和微粉)对糖尿病SD大鼠肾脏氧化应激的影响.方法:链脲佐菌素(60 mg/kg)腹腔注射诱导糖尿病大鼠.1周后测血楮≥16.7 mmol/L为糖尿病,将大鼠随机分为糖尿病对照组(DMC,n=7)、通络方剂超微粉组(DM+UT,n=8)和通络方剂微粉组(DM+FT,n=8)3组,同时取8只大鼠作为正常对照组(NC).DM+UT组和DM+FT组按每天1 g/kg UT或FT灌胃,NC和DMC组给予等量的生理盐水溶液.干预4周后,测肾质量/体质量(KW/BW)和24 h尿蛋白(24 h UP),比色法检测肾皮质抗氧化酶和丙二醛(MDA),实时PCR法检测NADPH氧化酶亚基p47phox和p22phox mRNA表达的改变.结杲:与正常大鼠相比,糖尿病大鼠肾皮质MDA含量、24 h UP和KW/BW升高,总超氧化物歧化酶(TSOD)活性降低,谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性升高,均有统计学意义;正常大鼠与糖尿病大鼠问过氧化氢酶(CAT)活性差异无统计学意义.与DMC组相比,两个通络方剂干预组糖尿病大鼠肾皮质MDA、24 h UP和Kw/BW明显降低;TSOD和GSH-Px活性增强,差异均有统计学意义.DMC组和两个通络方剂组间CAT活性差异无统计学意义.其中DM+UT组对24 h UP,KW/BW、MDA、TSOD和GSH-Px的作用较DM+FT组更明显,差异有统计学意义.与正常大鼠相比,糖尿病大鼠肾皮质NADPH氧化酶亚基p47phox mRNA表达增强,差异有统计学意义.与DMC组相比,两个通络方剂干预组p47phox mRNA表达降低,差异有统计学意义,但两干预组间差异无统计学意义.在各实验组问NADPH氧化酶亚基p22phox mRNA表达的差异无统计学意义.结论:通络方剂能增强糖尿病大鼠肾脏TSOD和GSH-Px活性,降低NADPH氧化酶p47phox mRNA的表达,可能因此抑制肾脏氧化应激水平,减轻糖尿病大鼠早期的肾脏损伤.
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血管外膜损伤后血管组织氧化应激与内膜病变
目的:探讨NADPH氧化酶相关的氧化应激在外膜损伤致内膜病变中的作用.方法:选用纯种新西兰大白兔,采用胶原酶消化+钝性机械分离的方法建立血管外膜损伤动物模型,采用H-E染色观察外膜损伤血管的形态变化,实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RQ-PCR)技术检测外膜损伤后血管组织NADPH氧化酶亚单位p22phox、抗氧化酶HO-1的mRNA表达,荧光探针检测外膜损伤后血管组织活性氧(reactive oxygen species,ROS)的生成.结果:外膜损伤可致内膜增生性病变;外膜损伤导致p22phox/HO-1 mRNA表达明显升高,血管组织ROS产量增加.结论:血管外膜参与了内膜病变形成的病理过程;NADPH氧化酶活性升高导致的氧化应激可能是外膜损伤致内膜病变的机制之一.
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金属硫蛋白对糖尿病大鼠肾脏氧化应激的影响
目的:观察抗氧化剂金属硫蛋白(metallothionein,MT)对糖尿病大鼠肾脏氧化应激指标及NADPH氧化酶的影响,探讨MT对糖尿病大鼠肾脏保护作用的可能机制.方法:雄性SD大鼠随机分为正常对照组(NC,n=8)、糖尿病模型组(DM,n=7)以及糖尿病MT治疗组(DM+MT,n=8),糖尿病大鼠腹腔注射链脲佐菌素(60 mg/kg)制备糖尿病大鼠模型,DM+MT组大鼠给予10 g/kg体质量MT灌胃.4周后检测各组大鼠24 h尿蛋白(24 h UP)和肾质量/体质量(KW/BW)值,评价肾脏功能,比色法检测肾脏丙二醛(MDA)含量,real-time PCR法检测NADPH氧化酶亚基p47phox、p22phox,蛋白激酶C(PKC)-β和血管紧张素原(Ang)mRNA表达.结果:与NC组相比,DM组24 h UP、KW/BW以及肾皮质MDA水平明显升高(P＜0.05);肾皮质p47phox、p22phox、PKC-β和Ang mRNA表达显著升高(P＜0.05或P＜0.01).与DM组相比,DM+MT组24 h UP、KW/BW以及肾皮质MDA水平降低(P＜0.05),p47phox、PKC-β和Ang mRNA的表达水平降低(P＜0.05),而p22phox无明显改变.结论:MT可能通过降低糖尿病大鼠肾脏氧化应激水平,抑制肾皮质PKC-β、Ang以及NADPH氧化酶亚基的表达,从而发挥肾脏保护作用.
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血管紧张素Ⅱ及其受体AT1R与肝纤维化的相关性
肝纤维化是各种慢性肝损伤修复过程引起的肝脏疾病,以细胞外基质(extracellular matrix,ECM)增生和降解失衡导致过度沉积为特征.血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)是肾素血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)中的主要效应成分.越来越多的证据表明,AngⅡ及其1型受体(angiotensin receptor 1,AT1R)之间的相互作用在对长期肝脏损伤引起的纤维化中起重要作用,包括促进肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的活化、增殖及收缩,诱导人类活化型HSCs产生活性氧簇(reactive oxygen species,ROS),促进胶原合成及沉积等.本文就AngⅡ及其受体AT1R在肝纤维化的发生、发展及抗纤维化治疗中的作用作一综述.
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熊果酸对血管紧张素Ⅱ诱导肝星状细胞内NADPH氧化酶的活化及下游信号通路的影响
目的 分析熊果酸(UA)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)引起肝星状细胞(HSC) NADPH氧化酶(NOX)激活及其下游的PI3K/Akt、P38MAPK信号通路的影响.方法 将培养激活的HSC-T6细胞株分组:对照组,不加任何药物;AngⅡ组,给予AngⅡ(1μmol/L)刺激细胞;各干预组分别给予UA(50 μmol/L)、NOX抑制剂DPI(20 μmol/L)、PI3 K/Akt信号通路抑制剂LY294002(10 μmol/L)、P38MAPK信号通路抑制剂SB203580(10 μmol/L)预处理30 min,再加入AngⅡ处理不同时间.通过Western blotting检测细胞膜上NOX亚基p47Phox蛋白、细胞总PI3K蛋白和磷酸化的Akt 、P38MAPK蛋白的表达;采用RT-PCR法检测UA对AngⅡ诱导的Ⅰ型胶原表达,CCK-8比色法检测HSC-T6的增殖率.结果 用AngⅡ处理15 min后,细胞膜上p47phox蛋白的表达明显高于对照组(P＜0.05);分别给予UA及DPI进行干预后,细胞膜上p47phox蛋白的表达较AngⅡ组明显降低(P＜0.05).用AngⅡ处理30 min后,PI3K、p-Akt的蛋白表达明显高于对照组(P＜0.05);而分别给予UA、LY294002、DPI进行干预后,PI3K、p-Akt蛋白的表达较AngⅡ组均降低(P＜0.05).用AngⅡ处理30 min后,p-P38MAPK蛋白表达明显高于对照组(P＜0.05);分别给予UA、SB203580、DPI干预后,p-P38MAPK蛋白的表达较AngⅡ组明显降低(P＜0.05).AngⅡ处理12h后,Ⅰ型胶原的mRNA的表达明显高于对照组(P＜0.05);分别给予UA、DPI、SB203580、LY294002干预后,Ⅰ型胶原的mRNA表达较AngⅡ组均明显降低(P＜0.05).AngⅡ刺激12、24、48 h后,细胞增殖率明显升高;分别给予UA、DPI、SB203580、LY294002干预后,细胞增殖率均低于AngⅡ组(P＜0.05).结论 UA能够通过抑制NOX活化阻断AngⅡ在肝星状细胞内的信号转导,从而抑制肝星状细胞的增殖及Ⅰ型胶原基因的表达.
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同型半胱氨酸诱导内皮祖细胞凋亡的氧化应激机制
目的 探讨同型半胱氨酸(Hcy)诱导小鼠骨髓内皮祖细胞(EPCs)凋亡的氧化应激机制.方法 密度梯度离心法获取小鼠骨髓单个核细胞,培养7 d后收集贴壁细胞,荧光显微镜下鉴定EPCs;与不同浓度Hcy(0、50、100、500 μmol/L)共孵育12、24、48 h,或分别经氧自由基清除剂NAC(1 mmol/L)、NADPH氧化酶抑制剂DPI(10 μmol/L)、p38MAPK特异性抑制剂SB203580(10 μmol/L)预孵育30 min后,再与500 μmol/L Hcy共孵育24 h;Annexin-V/ PI双染色经流式细胞术检测细胞凋亡,荧光探针H2DCF-DA法检测细胞内活性氧水平,光泽精化学发光法检测NADPH氧化酶活性,硝酸还原酶法测定细胞培养液中一氧化氮(NO)含量.结果 Hcy呈时间、剂量依赖性诱导EPCs凋亡、活性氧产生及NADPH氧化酶激活,并减少细胞培养液中NO含量(P<0.05或P<0.01);NAC、DPI、SB203580预处理能拮抗Hcy诱导的上述改变(P<0.05或P<0.01).结论 Hcy可能通过激活NADPH氧化酶、诱导EPCs活性氧的产生、降低NO水平及激活p38MAPK途径,导致EPCs凋亡.
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高浓度葡萄糖在内皮细胞氧化应激中的作用
目的 探讨高糖对猪髂动脉内皮细胞(PIECs)氧化应激的影响.方法 不同浓度高糖干预PIECs一定时间后,应用活性氧(ROS)捕获剂dihydroethidium(DHE)、双氢罗丹明123(DHR123)孵育细胞,通过荧光显微镜观察细胞内DHE染色,流式细胞仪检测细胞内罗丹明123(rh123)的平均荧光强度(MFI)而测得细胞内ROS水平;以二甲基吖啶硝酸盐为化学发光试剂,通过化学发光仪检测加入NADPH后发光值的变化,以反映高糖对PIECs中NADPH氧化酶(NOX)活性的影响.设立正常组和甘露醇组作为对照.结果 随着高浓度葡萄糖作用浓度和时间的增加,荧光显微镜下高糖组细胞内DHE荧光增强;流式细胞仪检测显示,高糖组细胞内rh123的MFI较对照组明显升高;化学发光仪检测表明,高糖组细胞NOX活性升高显著.结论 高糖导致细胞发生氧化应激,其对细胞的损伤作用可能与氧自由基生成过多、ROS蓄积有关,该效应可能由NOX介导.
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人嗜酸性粒细胞NADPH氧化酶的定位及gliotoxin的抑制作用
目的研究NADPH氧化酶在人体嗜酸性粒细胞中的细胞化学定位及gliotoxin对其活性的抑制作用.方法用蛋白激酶C的激活剂佛波豆蔻乙酯(phorbol myristate aceta,PMA)和gliotoxin对嗜酸性粒细胞预处理,然后用Ce3+为捕捉剂检测活性氧,作为电镜下NADPH氧化酶活化的标志.结果 PMA组:在嗜酸性粒细胞内囊泡呈放射状排列,大小形态各异的囊泡腔面有很多显示NADPH氧化酶活性的致密颗粒存在.PMA+gliotoxin组:嗜酸性和中性粒细胞内显示该酶活性的颗粒都明显减少,但后者减少程度明显.结论嗜酸性粒细胞经刺激后,位于细胞内囊泡膜的腔面的NADPH 氧化酶被激活,其活性强于中性粒细胞.gliotoxin对嗜酸性粒细胞产生过量·O-2有明显的抑制作用.
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香草乙酮改善葡聚糖硫酸钠诱发溃疡性结肠炎小鼠的炎症反应与NOXs-ROS-p38MAPK信号通路的关系
本文旨在探讨香草乙酮(apocynin)治疗葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)诱导的溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)小鼠的分子机制.以饮用水配制5％ DSS诱发UC动物模型,2％香草乙酮治疗UC小鼠,采样并应用HE染色进行结肠组织病理学评估.采用鲁米诺化学发光方法检测结肠组织活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)生成及DPI抑制后的NADPH消耗率分析NADPH氧化酶(NADPH oxidases,NOXs)活性,Western blot法检测p38MAPK磷酸化水平,Griess方法分析NO,酶联免疫法检测前列腺素E2 (prostaglandin E2,PGE2),real time PCR及Westem blot法检测iNOS、COX2的表达,酶联免疫吸附实验测定细胞因子TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-1β的水平.体外实验采用分离的结肠组织中性粒细胞,检测其ROS生成、NOXs活性、NO、PGE2的变化,并应用Western blot检测其NOX1、p-p38MAPK的表达.结果显示,香草乙酮治疗后UC小鼠结肠组织NOXs活性及ROS生成被抑制(P＜0.01),p38MAPK磷酸化水平降低,NO、PGE2及相关细胞因子生成减少(P＜0.01),UC炎症反应得到缓解.在炎症部位的中性粒细胞中,香草乙酮抑制ROS生成及NOX活性(P＜0.01),并降低NOX1的表达、p38MAPK的磷酸化及NO、PGE2的生成(P＜0.01).因此,香草乙酮可能通过NOXs-ROS-p38MAPK信号通路缓解DSS诱发UC小鼠的炎症反应,中性粒细胞是参与其保护机制的主要炎症细胞.
