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细胞外信号调节激酶反义寡核苷酸对支气管哮喘血清被动致敏的人气道平滑肌细胞的影响
目的 观察细胞外信号调节激酶(ERK)反义寡核苷酸(ODNs)对支气管哮喘(简称哮喘)血清被动致敏的人气道平滑肌细胞(HASMCs)增殖和凋亡的影响.方法 用10%哮喘患者血清被动致敏HASMCs(空白对照组),并用脂质体将反义(AODNs组)、正义(SODNs组)及错配ERKODNs(RODNs组)导入HASMCs,以10%非哮喘患者血清为对照(对照血清组).采用流式细胞仪、四甲基偶氮唑盐(MTT)法、3H-TdR掺入法及增殖细胞核抗原(PCNA)免疫荧光技术检测HASMCs的增殖,原位末端标记法和Annexin-V FITC PI双染色法检测细胞凋亡,RT-PCR和Western blot检测ERKmRNA和ERK1/2、磷酸化ERK1/2蛋白的表达.结果 用ERK ODNs干预经哮喘血清致敏的HASMCs后,AODNs组S+G2/M期细胞所占比例、吸光度(A490)值、细胞DNA合成量和PCNA蛋白表达量[分别为(14.21±1.21)%、(0.271±0.021)、(2811±182)cpm/106和(5.25±0.60)]均低于空白对照组[分别为(22.48±2.04)%、0.507±0.090、(3869±396)cpm/106和11.25±1.21](F值分别为65.594、39.676、61.111、120.321,均P<0.01),AODNs组的凋亡指数和早期凋亡细胞百分率[分别为13.96±1.72和(9.17±0.47)%]均高于空白对照组[分别为5.37±0.05和(3.26±0.04)%],差异有统计学意义(F值分别为98.181和65.444,均P<0.01),AODNs组的ERK mRNA和ERK活化率[分别为0.43±0.06和(63±6)%]均低于空白对照组[分别为0.89±0.09和(87±8)%](F值分别为78.043和87.288,均P<0.01).而正义和错配ERK ODNs没有上述作用.结论 反义ERK可通过抑制ERK mRNA表达和翻译抑制哮喘血清被动致敏的HASMCs的增殖,促进其凋亡,ERK信号通道可能对哮喘患者HASMCs增殖与凋亡具有重要的调控作用.
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细胞外信号调节激酶在胃癌中的过表达与胃癌的恶性潜能相关
目的探讨胃癌中细胞外信号调节激酶ERK-1和ERK-2蛋白的表达与活性及其与胃癌临床病理因素的关系. 方法用固定化蛋白质印迹法检测42例胃癌及邻近正常胃粘膜中ERK-1和ERK-2蛋白及磷酸化ERK(P-ERK)的表达;免疫组织化学法分析其在细胞内的定位. 结果胃癌中ERK-1和ERK-2的蛋白表达水平明显高于正常胃粘膜(P＜0.01);ERK蛋白表达水平与肿瘤大小及组织学分化无关(P>0.05);Ⅲ、Ⅳ期胃癌中ERK-1和ERK-2蛋白表达水平高于Ⅰ、Ⅱ期胃癌(P＜0.05);有淋巴结转移胃癌中ERK-1和ERK-2蛋白表达水平高于无淋巴结转移胃癌(P＜0.05);侵犯浆膜胃癌中ERK-1和ERK-2蛋白表达水平高于无浆膜侵犯的胃癌(P＜0.05); ERK-1与ERK-2蛋白在胃癌中的表达呈线性正相关(r＝0.550, P＜0.01).ERK-1和ERK-2的蛋白表达水平与P-ERK表达水平一致.ERK蛋白主要表达于细胞浆,胃癌组织中的表达量明显高于癌旁正常胃粘膜. 结论 ERK-1和ERK-2蛋白的过表达可能在胃癌的发生发展过程中发挥重要作用,与胃癌TNM分期、浆膜侵犯及淋巴结转移有关.
关键词： 胃肿瘤 细胞外信号调节激酶类 蛋白质杂交 免疫组织化学 -
作用于MAPK信号转导系统的抗肿瘤药物研究
丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是细胞内重要的信号转导系统,可以调节细胞的生长、增殖、分化、凋亡、黏附、迁移等一系列过程,继而影响肿瘤的发生、侵袭、转移以及耐药,是可能的抗肿瘤药物靶点之一.近年来,已有大量以MAPK信号转导通路为靶寻找抗肿瘤药物的研究报道,涉及该系统的多个分子,如表皮生长因子受体、Ras、Raf、蛋白激酶C、谷胱甘肽转移酶等.
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大鼠脊髓小胶质细胞CX3CR1/ERK5信号通路在神经病理性疼痛中的作用
目的 探讨脊髓小胶质细胞CX3CR1/ERK5信号通路在神经病理性疼痛中的作用.方法 建立脊神经结扎(SNL)疼痛模型,检测大鼠脊髓p-ERK5表达的改变及其表达的细胞类型.鞘内注射ERK5反义寡核苷酸,观察抑制脊髓ERK5表达对SNL大鼠PWT与TWL的影响,以确定ERK5在神经病理性疼痛中的作用.SNL大鼠鞘内注射CX3CR1中和抗体,观察阻断该受体对ERK5活化的影响；鞘内注射CX3CR1的配体CX3CL1,观察CX3CL1能否激活脊髓小胶质细胞和ERK5,以及预先抑制ERK5表达能否逆转CX3CL1的作用,以判定神经病理性疼痛条件下CX3CR1对ERK5的调节作用.结果 与假手术组相比,SNL大鼠术后脊髓p-ERK5免疫反应阳性细胞表达增加(61.75±11.52比2.2±0.12; 58.01 ±10.45比1.1 ±0.11)(P＜0.05),荧光双标结果表明p-ERK5主要表达于小胶质细胞.抑制脊髓ERK5表达有效缓解SNL所致的热(13.48±2.0)s比(18.0±3.7)s;(11.6 ±2.3)s比(17.7 ±1.4)s(P＜0.05)与机械(15.42 ±3.46)g比(22.7±3.2)g；(13.6±2.9)g比(21.4±4.1)g痛敏(P＜0.05).与对照组相比,阻断CX3CR1可有效减少SNL大鼠脊髓ERK5的活化(30±9)比(58±12)；(50±12)比(36±4)(P＜0.05).抑制脊髓ERK5的表达缓解鞘内注射CX3CL1所致痛觉过敏与小胶质细胞活化.结论 在神经病理性疼痛条件下,CX3CL1/CX3CR1通过激活脊髓小胶质细胞ERK5,调节脊髓小胶质细胞的活化,该通路参与了脊髓疼痛信号的转导过程.
关键词： 受体趋化因子 细胞外信号调节激酶类 小神经胶质细胞 神经痛 -
胞外信号调节激酶在胃溃疡愈合中的作用研究
目的探讨胞外信号调节激酶(ERK1)在胃溃疡发生及愈合中的作用机制.方法采用免疫组织化学ABC法,对16例愈合前后胃溃疡患者胃黏膜组织中ERK1的表达水平及其分布进行检测.结果治疗前16例活动性胃溃疡患者胃黏膜组织中ERK1的表达水平为0.861±0.038(以平均吸光度A值表示),与治疗后(A值为0.347±0.026)相比明显增高(P<0.01).镜下,ERK1主要表达于胃黏膜上皮细胞和胃底(体)腺上皮细胞胞质内,少数浸润的炎症细胞及成纤维细胞亦见阳性表达.结论 ERK1的高表达可加快溃疡灶的重上皮化,对胃溃疡的愈合起促进作用.
关键词： 胃溃疡 细胞外信号调节激酶类 -
脊髓背角细胞外信号调节激酶磷酸化参与调控2,4-二硝基氟苯诱导的小鼠慢性痒
目的:探讨脊髓背角细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)磷酸化对2,4-二硝基氟苯(2,4-dinitrofluorobenzene,DNFB)诱导的小鼠慢性痒的调控作用.方法:8~12周ICR雄性小鼠随机分为DNFB诱导组和丙酮对照组.DNFB组小鼠分别于面颊部和背部反复涂抹1.5% DNFB溶液,建立类似特异性皮炎的慢性痒模型.分别观察慢性痒模型建立后小鼠的自发性行为,以及鞘内注射M EK抑制剂U0126后小鼠自发性慢性痒行为的变化.免疫组织化学染色法分析小鼠脊髓组织磷酸化 ERK(phosphrylated ERK,pERK)的表达情况.结果:面颊部诱导模型中,DNFB组小鼠的搔抓次数明显高于丙酮对照组(P<0.05),而擦涂行为无差异,证实DNFB诱发的是痒觉;颈背部诱导模型中,DNFB组小鼠表现出剧烈的搔抓行为,而丙酮对照组的搔抓行为不明显.背部慢性痒模型建立后,分别在第1、3、7和14天鞘内注射 M EK 抑制剂U0126,小鼠的搔抓行为受到明显抑制(P<0.05),且脊髓背角pERK的表达水平也明显降低(P<0.05).pERK活化主要表达于小鼠脊髓背角Ⅰ ~ Ⅱ层,且与神经元标志物NeuN共标,与星形胶质细胞标志物GFAP和小胶质细胞标志物Iba1不共标.结论:脊髓背角浅层神经元 ERK磷酸化可能参与调控DNFB诱导的慢性痒.
关键词： 瘙痒症 脊髓背角 细胞外信号调节激酶类 小鼠 近交ICR -
上皮钠通道与炎症性肠病关系的研究进展
炎症性肠病(IBD)是一种自身免疫性疾病,可导致腹泻、腹痛、体质量丢失等症状.腹泻的发病机制尚不清楚,但越来越多的证据表明上皮钠通道(ENaC)与腹泻有关.ENaC对控制钠稳态、细胞外液总量、血压等方面至关重要.本文就ENaC与IBD的关系作一综述.
关键词： 上皮钠通道 炎症性肠病 细胞外信号调节激酶类 肿瘤坏死因子α -
雷帕霉素对不同肿瘤细胞Bax/Bcl-2和活性caspase-3表达的影响
目的:探讨雷帕霉素(rapamycin,RAPA)对不同肿瘤细胞Bax/Bcl-2和活性caspase-3表达的影响及其可能的机制.方法:采用RAPA处理肺腺癌A549细胞、人成神经细胞瘤SH-SY5Y细胞和人骨肉瘤MG63细胞后,MTT法检测细胞的相对增殖率,蛋白质印迹法检测细胞中Bcl-2、Bax和活性caspase-3的表达以及细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)和Akt活性的变化;RAPA联合ERK抑制剂U0126或PD98059以及联合Akt抑制剂wortmannin处理MG63和SH-SY5Y细胞后,分别用MTT法和蛋白质印迹法检测细胞的相对增殖率和Bcl-2、Bax、活性caspase-3的表达.结果:在A549细胞中,RAPA上调细胞Bax/Bcl-2和活性caspase-3的表达(P＜0.05),细胞的相对增殖率下降(P＜0.05).在MG63细胞中,RAPA通过ERK上调Bcl-2和Bax的表达,Bax/Bcl-2和活性caspase-3的表达以及细胞的相对增殖率无明显变化;ERK抑制剂U0126或PD98059逆转RAPA导致的Bcl-2上调,联合RAPA作用后细胞中Bax/Bcl-2和活性caspase-3的表达上调(P＜0.05),细胞的相对增殖率降低(P＜0.05).在SH-SY5Y细胞中,RAPA通过Akt上调Bcl-2的表达,Bax/Bcl-2降低(P＜0.05),细胞的相对增殖率上升(P＜0.05); Akt抑制剂wortmannin逆转RAPA导致的Bcl-2上调,联合RAPA作用后细胞中Bax/Bcl-2和活性caspase-3的表达上调(P＜0.05),细胞的相对增殖率降低(P＜0.05).结论:RAPA在不同肿瘤细胞中可能通过调节不同的激酶影响Bax/Bcl-2和活性caspase-3的表达.
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索拉非尼抑制人非小细胞肺癌细胞的增殖并诱导其凋亡
目的:观察索拉非尼对人非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC) A549和H1299细胞增殖和凋亡的影响,并探讨其可能机制.方法:不同浓度索拉非尼作用A549和H1299细胞后,应用CCK-8 (cell counting kit-8)法检测细胞的增殖抑制率,FCM检测细胞周期和细胞凋亡,蛋白质印迹法检测细胞的磷酸化细胞外信号调节激酶(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase,p-ERK)和磷酸化Akt(phosphorylated Akt,p-Akt)蛋白的表达水平.结果:不同浓度索拉非尼能抑制A549和H1299细胞的增殖,且呈浓度依赖性(P＜0.05)；索拉非尼能诱导细胞凋亡,与对照组比较,G0/G1期细胞比率明显上升,S期细胞比率相应下降,细胞阻滞于G0/G1期(P＜0.05)；索拉非尼作用后,A549和H1299细胞中P-ERK蛋白的表达明显低于对照组(P＜0.05).结论:索拉非尼能抑制人NSCLC A549和H1299细胞的增殖并诱导其凋亡,其作用机制可能与阻断ERK信号通路有关.
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氯沙坦抑制球囊损伤后腹主动脉富含半胱氨酸蛋白61、ERK1/2的表达
目的 观察球囊损伤后大鼠腹主动脉富含半胱氨酸蛋白61、ERK1/2的表达及氯沙坦对富含半胱氨酸蛋白61、ERK1/2表达的影响,探讨氯沙坦抑制动脉增殖的机制.方法 72只雄性Wistar大鼠分为氯沙坦组、球囊损伤组和假手术组.对球囊损伤后不同时间段的大鼠腹主动脉标本采用免疫组织化学、免疫蛋白印记分析检测富含半胱氨酸蛋白61、ERK1/2的表达.结果 7 d和14 d球囊损伤组富含半胱氨酸蛋白61、ERK1/2的表达均明显增强,与假手术组比较有显著差异(P<0.01),氯沙坦组与球囊损伤组比较均明显降低.28 d时,3组两两比较没有显著差异(P>0.05).结论 氯沙坦抑制球囊损伤后富含半胱氨酸蛋白61、ERK1/2的表达,提示氯沙坦抑制球囊损伤后内膜增生可能是通过抑制富含半胱氨酸蛋白61发挥作用的,这种抑制作用可能部分是通过ERK1/2信号转导途径介导的.
关键词： 细胞外信号调节激酶类 免疫组织化学 印迹法 蛋白质 大鼠 氯沙坦 球囊损伤 内膜增生 富含半胱氨酸蛋白61 -
熊果酸对活化型肝星状细胞NADPH氧化酶亚基p47Phox表达及ERK1/2信号通路活化的影响
目的 研究熊果酸(ursolic acid,UA)对瘦素诱导的大鼠肝星状细胞(HSC-T6) NADPH氧化酶(NOX)亚基p47Phox表达及ERK1/2信号通路活化的影响,并观察I 型胶原合成及细胞增殖情况.方法 将培养激活的HSC-T6细胞株分为6组:正常对照组,不加任何药物；瘦素组,给予重组大鼠瘦素(100 ng/ml)刺激细胞；各干预组分别给予UA (50 μmol/L)、JAK抑制剂AG490 (50 μmol/L)、NOX抑制剂DPI (20μmol/L)、ERK抑制剂PD98059(30 μmol/L)预处理30 min,再加入瘦素刺激不同时间.采用蛋白质印迹分析检测细胞膜移位的p47Phox蛋白、细胞总p47Phox蛋白和磷酸化的ERK1/2(p-ERK1/2)蛋白表达；采用RT-PCR法检测 I型胶原mRNA的表达；采用MTT法检测细胞增殖.结果 瘦素刺激HSC-T6细胞30 min后细胞膜p47Phox蛋白表达较正常对照组增高(P＜0.01),细胞内p-ERK1/2蛋白表达也随之增高(P＜0.05)；UA、AG490、DPI、PD98059干预后抑制了p47Phox蛋白向细胞膜移位以及细胞内ERK1/2蛋白磷酸化.瘦素刺激HSO-T6细胞12h后I 型胶原的mRNA表达较正常对照组升高(P＜0.01),UA、AG490、DPI及PD98059干预组I 型胶原mRNA的表达均低于瘦素组(P均＜0.01).瘦素刺激HSC-T6细胞12、24、48 h后细胞增殖率高于正常对照组(P均＜0.01)；UA、AG490、DPI及PD98059干预不同时间点的细胞增殖率均低于瘦素组(P均＜0.01),UA的抑制细胞增殖作用弱于DPI(P＜0.01).结论 UA能抑制瘦素诱导的HSC-T6细胞增殖及I 型胶原表达,机制可能与抑制NOX亚基p47Phox向细胞膜移位及下游信号通路ERK1/2的激活有关.
关键词： 熊果酸 肝星状细胞 NADPH氧化酶 细胞外信号调节激酶类 细胞增殖 -
ERK1/2信号通路介导PDGF-CC诱导的鼠心肌纤维化及其机制
目的 研究ERK1/2通路在血小板源性生长因子(PDGF)-CC诱导的鼠心肌纤维化中的作用及其可能的机制.方法 取SD大鼠乳鼠心脏组织,差速贴壁法分离并纯化心肌成纤维细胞.按不同药物处理随机分成对照组(CON组)、PDGF-CC(P组)、PDGF-CC+ERK1/2抑制剂U0126(PU组).MTT法检测心肌成纤维细胞的增殖,qRT-PCR法检测mRNA含量,Western blot法分析蛋白表达量.结果 MTT法显示P组细胞数较CON组显著增加(P＜0.01),而PU组细胞数较P组明显减少(P＜0.01).qRT-PCR法显示P组中PDGF-α受体(PDGFR-α)、ERK1、ERK2、Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白(Col Ⅰ、ColⅢ)的mRNA表达水平均明显高于CON组(P ＜0.001),PDGFR-β的mRNA表达量在P组与CON组间差异无统计学意义.与P组相比,PU组中PDG-FR-α、ERK1、ERK2、Col Ⅰ和ColⅢmRNA表达均明显下降(P＜0.01).Western blot法显示P组中磷酸化PDGFR-α(p-PDGFR-α)、ERK1/2、p-ERK1/2、Col Ⅰ和ColⅢ的表达量均明显高于CON组(P ＜0.001),PU组中p-PDGFR-α、ERK1/2、p-ERK1/2、Col Ⅰ和ColⅢ蛋白表达量均显著低于P组(P＜0.001).结论 PDGF-CC可能通过结合PDGFR-α激活ERK 1/2信号通路,诱导鼠心肌成纤维细胞过量增殖伴胶原蛋白的合成,参与心肌纤维化的发生.
关键词： 心肌纤维化 心肌成纤维细胞 血小板源性生长因子 细胞外信号调节激酶类 -
替米沙坦对高血压大鼠血管前纤维蛋白1及ERK磷酸化水平的影响
目的:探讨替米沙坦对自发性高血压大鼠(SHR)血管前纤维蛋白1(Profilin-1)及细胞外信号调节激酶(ERK1/2)磷酸化水平的影响.方法:选取10周龄SHR及其同源对照魏-凯氏(WKY)大鼠,给予替米沙坦(5～10 mg/kg·d) 或安慰剂,为期10周.尾套法测量大鼠尾血压.采用实时定量聚合酶链式反应(PCR)和Western免疫印迹检测治疗后大鼠主动脉组织中Profilin-1 mRNA和蛋白及ERK1/2磷酸化水平.结果:与WKY对照组相比,SHR大鼠血压明显升高[(126±3.5)mmHg∶(195±6.1)mmHg],伴血管Profilin-1mRNA[(1.0±0.11)∶ (7.8±0.57)]及ERK硫酸化水平[(1.0±0.11): (2.43±0.19)]表达明显升高(P均<0.01),而经替米沙坦治疗后SHR大鼠血压明显降低[替米沙坦低剂量组(169±6.2)mmHg,高剂量组 (161±4.9)mmHg],伴Profilin-1 mRNA [替米沙坦低剂量组(4.45±0.92),高剂量组 (1.95±0.41)] 表达及ERK1/2磷酸化水平[替米沙坦低剂量组(1.62±0.20),高剂量组 (1.34±0.09)] 明显下调(P均<0.05).结论:长期替米沙坦治疗可降低高血压大鼠血压水平,降低血管Profilin-1表达及ERK1/2磷酸化水平,提示替米沙坦对高血压血管重塑具有一定的保护功效.
关键词： 替米沙坦 高血压 纤维蛋白 细胞外信号调节激酶类 -
姜黄素对肝纤维化大鼠肝组织中核转录因子-кB及细胞外信号调节激酶-1mRNA表达的影响
目的 探讨核转录因子-кB (NF-кB )及细胞外信号调节激酶(ERK) mRNA在CCl4致实验性肝纤维化大鼠肝组织中的表达及姜黄素(CUR)对它们的影响.方法 建立CCl4致大鼠实验性肝纤维化的模型,用免疫组织化学法比较正常组、模型组以及CUR组的α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达,用RT-PCR法比较各组肝组织NF-кB以及ERK-1 mRNA的表达.结果 NF-кB mRNA 及ERK-1mRNA的表达: 正常组分别为0.317±0.035和0.434±0.067,模型组分别为1.219±0.158和0.944±0.151,CUR组分别为0.912±0.274和0.736±0.293,CUR组与模型组比较,P值均＜0.05,差异有统计学意义.α-SMA的表达:CUR组为4.327±2.064,模型组为6.784±2.158,正常组为0.943±0.371,CUR组与模型组比较,P值均＜0.05 ,差异有统计学意义.结论 CUR可能通过抑制α-SMA的表达,减弱NF-кB诱导的肝星状细胞的活化以及抑制ERK-1的促肝星状细胞的增殖,从而起到抗大鼠肝纤维化的作用.
关键词： 肝纤维化 细胞外信号调节激酶类 核因子кB 姜黄素 -
非小细胞肺癌中细胞外信号调节激酶表达的意义
目的 探讨细胞外信号调节激酶ERK1和ERK2蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达及其意义.方法 应用固定化蛋白质印迹法检测52例非小细胞肺癌及癌旁正常肺组织中ERK1、ERK2及磷酸化的ERK(P-ERK)蛋白的表达;应用免疫组织化学法分析其在细胞内的定位.结果 肺癌组织中ERK1、ERK2及P-ERK蛋白的表达水平明显高于癌旁正常组织,分别为癌旁组织的1.5、1.8和1.7倍(P＜0.01);ERK1与ERK2蛋白表达水平呈正线性相关(r=0.64,P＜0.01).免疫组织化学显示ERK蛋白主要位于细胞浆内.结论 ERK蛋白的过表达可能在非小细胞肺癌的发生、发展过程中起着重要的作用.
关键词： 肺癌 细胞外信号调节激酶类 固定化蛋白质印迹 -
反义细胞外信号调节激酶对移植物血管的保护作用
目的探讨反义细胞外信号调节激酶(ERK1/2)基因治疗对移植物血管的保护作用及可能的保护机制.方法建立BN至Lewis大鼠的腹主动脉移植模型.反义ERK1/2治疗组移植前取供者动脉血管段给予经脂质体包装的反义ERK1/2基因转染;腹主动脉移植术后1个月内受者每日从尾静脉或阴茎背静脉注入经脂质体包装的反义ERK1/2寡核苷酸100μl.对照组移植未经任何处理的血管段,移植后也无特殊处理.移植术后60 d取移植段主动脉进行组织病理学观察内膜和胶原纤维变化;免疫组织化学法观察移植段血管ERK1/2基因的表达和CD4+、CD8+T淋巴细胞的浸润情况;ELISA法检测血清中细胞间粘附分子(ICAM-1)的变化.结果移植术后60 d,对照组的移植动脉呈慢性移植物血管病表现,血管内膜显著增厚,移植血管中ERK1/2基因高表达,CD4+、CD8+T淋巴细胞大量浸润;反义ERK1/2基因治疗组移植动脉呈血管内膜炎改变,ERK1/2基因表达不明显,内膜有少量CD4+、CD8+T淋巴细胞;对照组ICAM-1表达显著高于反义ERK1/2治疗组(P＜0.05).结论反义ERK1/2基因治疗对移植物血管具有保护作用,可以减缓慢性移植物血管病的发生,这种保护机制可能和减少ICAM-1的表达以及减少移植血管T淋巴细胞的浸润有关.
关键词： 细胞外信号调节激酶类 移植物 外周血管病 -
细胞外信号调节激酶在非小细胞肺癌中的表达及其意义
目的:探讨细胞外信号调节激酶ERK-1和ERK-2蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达及其意义.方法:用固定化蛋白质印迹法检测52例非小细胞肺癌及癌旁正常肺组织中ERK1、ERK2及磷酸化的ERK(P-ERK)蛋白的表达情况;应用免疫组织化学法分析其在细胞内的定位.结果:肺癌组织中ERK1、ERK2及P-ERK蛋白的表达水平明显高于癌旁正常组织,分别为癌旁组织的1.5,1.8和1.7倍(P值均小于0.01);ERK1与ERK2蛋白表达水平呈线性正相关(r=0.64,P＜0.01).免疫组织化学显示ERK蛋白主要位于细胞浆内.结论:ERK蛋白的过表达可能在非小细胞肺癌的发生、发展过程中起着重要的作用.
关键词： 肺癌 细胞外信号调节激酶类 固定化蛋白质印迹 免疫组织化学 -
ADM和ADT对肺动脉平滑肌细胞胶原合成及磷酸化ERK1/2表达的影响
目的:检测不同浓度的肾上腺髓质素(ADM)和肾上腺加压素(ADT)对培养的Wistar大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)Ⅰ、Ⅲ型胶原合成和磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK1/2)表达的影响,探讨PASMCs增殖过程中ERK途径是否被激活.方法:取健康雄性Wistar大鼠,行大鼠远端PASMCs分离并进行原代培养,采用小鼠抗人平滑肌α-actin单克隆抗体对培养细胞进行鉴定;在培养基内分别加入10-7 mol/L ADM或ADT培养72 h 后加入兔抗大鼠Ⅰ型、Ⅲ型胶原抗体和兔抗大鼠p-ERK1/2抗体,0.01 mol/L PBS作阴性对照,FITC标记山羊抗兔IgG为Ⅱ抗,免疫荧光法观察PASMCs内Ⅰ、Ⅲ型胶原及p-ERK1/2表达.Western blotting检测10-7mol/L、10-8mol/L和10-9 mol/L ADM或ADT对p-ERK1/2蛋白表达的影响.结果:经平滑肌α-actin单克隆抗体对培养细胞进行鉴定,其纯度达97%.10-7 mol/L ADM可抑制PASMCsⅠ、Ⅲ型胶原及p-ERK1/2的表达(P<0.05,P<0.01);10-7 mol/L的ADT刺激后大鼠PASMCsⅠ、Ⅲ型胶原及p-ERK1/2的表达增强(P＜0.05,P<0.01).Western blotting结果显示ADM可呈剂量依赖性抑制p-ERK1/2蛋白表达(P<0.01,P<0.05);而ADT也可呈剂量依赖性促进p-ERK1/2蛋白表达(P<0.01,P<0.05).结论:ADM可抑制大鼠PASMCsⅠ、Ⅲ型胶原及p-ERK1/2表达,而ADT可促进PASMCsⅠ、Ⅲ型胶原及p-ERK1/2表达,提示PASMCs增殖过程中ERK通路被激活,ADM和ADT可能通过ERK1/2信号通路来调节PASMCs增殖.
关键词： 肾上腺髓质素 肾上腺加压素 细胞外信号调节激酶类 肺动脉平滑肌细胞 胶原合成 -
Fibrocystin对常染色体隐性遗传多囊肾病囊肿细胞增殖的影响
目的 研究fibrocystin对表皮生长因子(EGF)诱导的细胞过度增殖的影响并探讨其机制.方法 通过RNA干扰技术建立PKHD1-沉默细胞株,分别检测EGF诱导的细胞增殖率、ERK1/2磷酸化水平和细胞内Ca2+浓度.通过降低HEK 293细胞和增高PKHD1-沉默细胞内Ca2+浓度,研究Ca2+在其中的可能作用.结果 与HEK 293细胞比较,PKHD1-沉默HEK 293细胞对EGF作用高度敏感,增殖率为231 .5%,显著高于HEK 293细胞的152 .8%(P＜0 .01),细胞内ca2+浓度也显著降低(P＜0 .01).同时PKHD1沉默可显著增高EGF诱导的ERK1/2信号通路活化.运用Ca2+通道阻断剂维拉帕米降低HEK 293细胞内Ca2+浓度后,与未经维拉帕米处理的细胞比较,细胞增殖率为202 .2%,显著增高.维拉帕米处理的HEK 293细胞的ERK1/2磷酸化水平明显高于未处理的细胞.而运用Ca2+通道激活剂Bay K8644增高PKHD1-沉默HEK 293细胞内Ca2+浓度后,显著降低了EGF诱导的PKHD1-沉默HEK 293细胞的增殖率(135 .5%),Bay K8644处理的PKHD1-沉默HEK 293细胞的ERK1/2磷酸化水平明显低于未处理的细胞.结论 PKHD1基因的突变导致fibrocystin功能缺失,引起细胞内Ca2+浓度降低,导致EGF诱导的ERK1/2信号通路过度活化,可能是常染色体隐性遗传多囊肾疾病(ARPKD)患者肾囊肿衬里上皮细胞异常增殖导致ARPKD肾囊肿发生的机制之一.
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ERK1/2信号通路在小鼠库普弗细胞-内毒素反应中的活化规律及其作用
目的研究内毒素诱导下小鼠库普弗细胞(KC) ERK1/2活化规律、肿瘤坏死因子α(TNFα)分泌规律以及ERK1/2信号通路在TNFα分泌中的作用,探讨防治内毒素血症的新方法. 方法磷酸化ERK时效组以含有100 ng/ml LPS的培养基分别培养KC 0,5,10,20,30,45,60,120 min;磷酸化ERK量效组分别用含有0,0.1,1,10,100,1 000,10 000 ng/ml LPS的培养基孵育KC 30 min,免疫印迹杂交检测内毒素诱导KC ERK1/2活化规律,酶联免疫分析检测内毒素诱导KC释放TNFα规律.以0,0.5,1,10,25,50 μmol/L PD98059(ERK信号通路特异性阻断剂)预处理KC 1 h,酶联免疫分析检测PD98059对LPS诱导TNFα分泌的抑制作用. 结果 100 ng/ml内毒素刺激后,KC内ERK1/2被迅速活化,30 min达到高峰,2 h后基本恢复至正常水平;在10 pg/ml～100 ng/ml范围内,内毒素对ERK1/2激酶具有剂量依赖性的激活作用;内毒素诱导KC TNFα释放显著增加,呈显著的剂量依赖性关系;随着PD98059剂量的增加,其对LPS诱导KC TNFα分泌的抑制作用越大. 结论内毒素可诱导KC ERK1/2活化和TNFα分泌,ERK1/2对内毒素诱导KC分泌TNFα具有显著的调节作用,ERK1/2可能是治疗内毒素血症的新靶位.
关键词： 库普弗细胞 脂多糖类 肿瘤坏死因子α 细胞外信号调节激酶类
