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c-src/NADPH氧化酶1/活性氧对中性粒细胞弹力蛋白酶诱导气道黏蛋白5 AC表达的影响
目的 探讨中性粒细胞弹力蛋白酶(NE)诱导气道黏液高分泌的上游信号调节机制.方法 体外培养人气道BEAS-2B上皮细胞,将细胞分为空白对照组(不加任何刺激)、NE组(NE刺激)、NE+PP2组(NE刺激合并c-src抑制剂PP2)、NE+c-src siRNA组(NE刺激合并c-src siRNA)、NE+Noxl siRNA组[NE刺激合并NADPH氧化酶1(Nox1)siRNA]、阴件siRNA对照组(加入阴性对照siRNA)及NE+阴性siRNA组(NE刺激合并阴性对照siRNA)为干预条件.检测干预前后各组细胞巾活性氧含量、NoxI蛋白含量、黏蛋白5AC的蛋白及mRNA水平.用四甲基偶氮唑盐法测定各组细胞活性;活性氧试剂盒测定活性氧相对含量;逆转录PCR法检测各组黏蛋白5AC mRNA水平;ELISA法分析细胞黏蛋白5AC的蛋白相对含量;Western blot法检测Noxl蛋白及c-src蛋白的相对含量.结果 NE组细胞中Nox1蛋白相对含量为0.88±0.12,高于空白对照组的0.32±0.09(t=9.12.P=0.003);活性氧相对含量为0.76±0.09,高于空白对照组的0.18±0.02(t=9.44,P=0.003);黏蛋白5AC蛋白相对含量为0.82±0.09,基因转录水平为0.77±0.05,均高于空白对照组(分别为0.21±0.11和0.18±0.08,t值分别为7.75和6.13,P值分别为0.004和0.006).NE+c-src siRNA组细胞的Nox1蛋白相对含(0.39±0.08)、活性氧相对含量(0.29±0.05)均低于NE组(t值分别为5.43和5.60,均P=0.007);黏蛋白5AC蛋白相对含量(0.38±0.09)及mRNA水平(0.41±0.04)低于NE组(t值分别为5.28和4.09,P值分别为0.008和0.034).NE+PP2组活性氧相对含量为0.41±0.11,Nox1蛋白相对含量为0.44±0.05,黏蛋白5AC蛋白及mRNA水平分别为0.48±0.08和0.46±0.07,均低于NE组(均P<0.05).NE+Noxl siRNA组中活性氧相对含量(0.19±0.06)、黏蛋白5AC蛋白相对含量(0.31±0.05)及mRNA水平(0.32±0.06)也低于NE组(均P<0.05).结论 c-src/Noxl参与了NE诱导的活性氧活化,是气道上皮细胞黏蛋白5AC合成及分泌的上游信号调节因子.
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听觉系统Src家族调控电压门控性钠通道机制
感音神经性聋是耳鼻咽喉科常见的难治性疾病,其发病机制与听神经动作电位异常有关.蛋白酪氨酸激酶Src家族(src family kinases,SFKs)是神经系统重要的细胞信号调控因子,可调控电压门控性钠通道的表达及功能而影响动作电位.近年来研究发现SFKs可上调听神经元性钠通道的功能,而抑制SFKs具有听觉防护的效果,因此研究SFKs调控电压门控性钠通道与听觉防护之间的关系,有望为研究耳聋治疗方案提供新的思路.
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右美托咪定对小鼠海马神经元缺氧复氧时Src介导NR2A酪氨酸磷酸化水平的影响
目的 评价右美托咪定对小鼠海马神经元缺氧复氧时Src介导NR2A酪氨酸磷酸化水平的影响.方法 拉颈处死孕18 d的C57小鼠,剖腹取胎鼠,分离海马神经元.将神经元接种于培养液中,培养至第7天,采用随机数字表法分为3组(n=30):对照组(C组)、缺氧复氧组(H/R组)和右美托咪定组(D组).H/R组和D组缺氧4h复氧24 h制备小鼠海马神经元缺氧复氧损伤模型;D组给予终浓度为1 μmol/L的右美托咪定孵育4h,随后制备模型.于复氧24 h时采用MTT法检测海马神经元活力,TUNEL染色法观察海马神经元凋亡情况,计算细胞凋亡指数,Western blot法检测海马神经元c-Src、p-Src Y416、NR2A、p-NR2A Y1325和cleaved caspase-3表达水平.结果 与C组比较,H/R组海马神经元活力降低,凋亡指数升高,p-Src Y416、p-NR2A Y1325和cleaved caspase-3表达上调(P＜0.05);与H/R组比较,D组海马神经元活力升高,凋亡指数降低,p-Src Y416、p-NR2A Y1325和cleaved caspase-3表达下调(P＜0.05).3组c-Src和NR2A表达比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 右美托咪定可抑制缺氧复氧小鼠海马神经元凋亡,其机制可能与降低Src介导NR2A酪氨酸磷酸化水平有关.
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二烯丙基三硫通过miR-34a调控人白血病细胞中NADPH氧化酶的机制研究
目的:研究二烯丙基三硫(diallyl trisulfide,DATS)对人白血病细胞HL-60细胞中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶活性的影响及可能的作用机制.方法:DATS(150 μmol/L)作用于HL-60细胞不同时间后,采用硝基四氮唑蓝(nitro blue-tetrazolium,NBT)还原实验检测NADPH氧化酶的活性;实时荧光定量PCR检测DATS对微RNA-34a(microRNA-34a,miR-34a)以及S rc、Gab1和Shp-2 mRNA表达的影响及miR-34a对Src、Gab1和Shp-2 mRNA表达的影响;蛋白质印迹法检测DATS及miR-34a对Src、Gab1和Shp-2蛋白磷酸化的影响;细胞计数实验检测DATS和miR-34a对HL-60细胞增殖的影响.结果:DATS作用于HL-60细胞后能明显提高细胞中NADPH氧化酶的活性,且呈时间依赖性,而S rc激酶抑制剂PP2可抑制这种作用;DATS能上调HL-60细胞中miR-34a的表达水平,呈时间依赖性;miR-34a过表达可抑制Src、Gab1和Shp-2 mRNA及磷酸化蛋白的表达;DATS能抑制磷酸化Src、Gab1和Shp-2蛋白的表达水平.DATS和miR-34a过表达能抑制HL-60细胞的增殖,而抑制miR-34a的表达则可提高白血病细胞的增殖能力.结论:DATS可能通过促进HL-60细胞miR-34a-Src-Gab1-Shp途径调控NADPH的氧化酶活性,从而起到抑制白血病细胞增殖的作用.
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Src酪氨酸激酶抑制剂dasatinib对人食管鳞癌细胞KYSE180生长及凋亡的影响
目的:探讨Src酪氨酸激酶抑制剂dasatinib对人食管鳞癌细胞生长和凋亡的影响及其相关机制.方法:采用蛋白质印迹法检测食管鳞癌细胞株KYSE180、EC109、KYSE30和人永生化食管上皮细胞株SHEE中总Src和磷酸化Src激酶的表达.用不同剂量的Src酪氨酸激酶抑制剂dasatinib作用KYSE180细胞后,分别采用MTT法、FCM法、蛋白质印迹法和裸鼠皮下移植瘤实验观察dasatinib对KYSE180细胞Src激酶的抑制作用,以及对细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡和裸鼠皮下移植瘤的影响.结果:KYSE180、EC109和KYSE30细胞中Src激酶显著活化,而在SHEE细胞中未见活化Src激酶.Dasatinib可显著抑制KYSE180细胞增殖,阻碍细胞G1/S期转换,促进细胞凋亡,并上调caspase 3、cytochrome C和Bax等凋亡相关蛋白的表达.另外,dasatinib可显著抑制裸鼠皮下KYSE180细胞移植瘤的生长.结论:Dasatinib可通过抑制食管鳞癌细胞增殖、促进细胞凋亡以及影响细胞周期等机制,抑制食管鳞癌细胞皮下移植瘤的生长,因此其可望成为治疗食管鳞癌的一个有效药物.
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伯舒替尼的药理研究及临床评价
慢性髓性白血病是一造血系统疾病,与融合基因Bcr-Abl相关,尽管采用酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼治疗取得了显著疗效,但部分患者出现耐药或不能耐受.伯舒替尼为Src和Abl激酶的双重抑制剂,主要用于治疗对伊马替尼耐药或不能耐受的慢性髓性白血病,对一些实体瘤也有效.本文综述了其药理作用、药动学、药物相互作用、临床评价及不良反应等.
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芬太尼抑制鼻咽癌细胞侵袭转移的机制研究
目的：通过选择10 nmol·L －1芬太尼作用于鼻咽癌细胞系 CNE2和 HONE1，研究芬太尼对鼻咽癌细胞迁移能力的影响。方法取对数生长期的鼻咽癌细胞系 CNE2和 HONE1，选择10 nmol·L －1芬太尼分别作用于鼻咽癌细胞系30 min 和1 h，Western blot 检测 p-Src 和 Src 表达，Transwell 检测细胞迁移能力；构建 Src 过表达质粒，转染鼻咽癌细胞系，观察鼻咽癌细胞形态，检测细胞的迁移能力。结果10 nmol·L －1芬太尼处理鼻咽癌细胞 CNE2和 HONE148 h 后，细胞呈现出类间质向上皮转化的形态特征，同时，与对照组相比，加入芬太尼处理组的鼻咽癌细胞其迁移能力显著降低；应用芬太尼分别处理鼻咽癌细胞30 min 和1 h 后，p-Src 水平显著下调；此外，与转染空载体质粒的对照组相比，过表达 Src 的细胞迁移能力明显增强，而在过表达 Src 的细胞中同时联合芬太尼处理后，细胞的迁移能力没有被抑制。结论芬太尼可能通过抑制 Src 通路活化抑制鼻咽癌细胞侵袭转移。
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Src激酶和NR2B介导D1/D5受体激动剂诱导的脊髓LTP
目的 探讨Src激酶在D1/D5受体激动剂诱导的脊髓长时程增强(LTP)中的作用.方法 细胞外记录技术在脊髓腰膨大部记录背角浅层神经元C-纤维诱发电位.结果 ①DI/D5受体激动剂SKF 38393(250μmol/L)诱导的脊髓LTP的效应可被DI/D5受体拮抗剂SCH 23390(20μmol/L)所阻断;②Src激酶的选择性抑制剂Genistein(200 μmol/L)对脊髓背角c-纤维诱发电位的基础电位没有影响,但可阻断SKF诱导的脊髓背角LTP;③N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)亚基2B特异性拮抗剂Ro25-6981(50 μmol/L)阻断SKF诱导的脊髓背角LTP.结论 脊髓背角Src激酶和NMDAR 2B受体参与D1/D5受体诱导的脊髓LTP.
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Src激酶抑制剂-1对人软骨肉瘤细胞生物学行为的影响
目的 探讨Src激酶抑制剂-1对人软骨肉瘤SW1353细胞生长、凋亡和迁移等生物学行为的影响及其机制.方法 体外培养人软骨肉瘤SW1353细胞,分为对照组和实验组,分别采用MTT法、流式细胞术和细胞迁移实验观察Src激酶抑制剂-1对人软骨肉瘤SW1353细胞生长、凋亡和迁移等生物学行为的影响,并通过Western-blot检测Src激酶抑制剂-1作用后Src及下游信号通路蛋白的影响.结果 0.5、1、5、10 μmol/L的Src激酶抑制剂-1均能明显抑制SW1353细胞的增殖(P<0.01);1、5、10 μmol/L的Src激酶抑制剂-1均能明显促进SW1353细胞的凋亡(P<0.01);Src激酶抑制剂-1能明显限制SW1353细胞的迁移;Src激酶抑制剂-1能明显抑制SW1353细胞Src(Tyr416)及下游信号ERK1/2、Akt和FAK(Y397)的磷酸化.结论 Src激酶抑制剂-1具有抑制人软骨肉瘤SW1353细胞生长和迁移的能力,可能对软骨肉瘤具有一定的治疗效果,这是通过直接抑制Src 酪氨酸激酶的活性,进而抑制其下游信号通路的激活来实现的.
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抑制Src激酶可减轻单侧输尿管梗阻小鼠肾间质纤维化
目的 探讨Src激酶在单侧输尿管梗阻(UUO)小鼠肾间质纤维化中的作用及其机制.方法 雄性C57BL/6J小鼠随机分为假手术(Sham)组(n=8)、Sham+PP2(Src激酶抑制剂)组(n=8)、UUO组(n=8)和UUO+PP2组(n=8).Sham+PP2组和UUO+PP2组自手术日起每天给予2 mg/kg PP2腹腔注射.PP2溶解于生理盐水配制的1％二甲基亚砜(DMSO).Sham组和UUO组给予等量1％ DMSO腹腔注射.术后第7天处死取肾组织.天狼星红染色观察肾脏组织胶原分布;Western印迹法分别检测Src、蛋白激酶B(PKB,也称AKT)、丝裂原活化蛋白激酶p38 (p38 MAPK)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)的活化及α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤连蛋白(FN)的表达;免疫组化检测Ⅰ型胶原(COL Ⅰ)的表达;ELISA法检测基质金属蛋白酶9(MMP-9)、金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP-1)、转化生长因子β1(TGF-β1)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、白细胞介素6(IL-6)的表达.结果 与Sham组比较,UUO组小鼠第7天肾组织纤维化明显,COLⅠ及FN表达升高(均P＜ 0.05),Src及其下游p38 MAPK、AKT和ERK激酶活化增加(均P＜ 0.05),同时伴有α-SMA表达增加(P＜0.05),TGF-β1、MMP-9、TIMP-1、MCP-1和IL-6表达升高(均P＜0.05).与UUO组比较,UUO+PP2组肾脏Src、AKT、p38 MAPK和ERK的活化受抑制(均P＜ 0.05),TGF-β1、MCP-1和IL-6表达减少(均P＜0.05),COLⅠ、FN及α-SMA表达降低(均P＜ 0.05),肾组织纤维化程度明显减轻;MMP-9、TIMP-1的表达不受PP2干预影响.结论 Src激酶通过激活其下游相关信号通路促进肾间质肌成纤维细胞聚集、促纤维化因子分泌及炎性反应,参与UUO小鼠肾间质纤维化的进展.
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C末端Src激酶在血管紧张素Ⅱ诱导足细胞骨架重构中的作用
目的 观察血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激对大鼠肾脏及条件永生性小鼠足细胞C末端Src激酶(C-terminal Sre kinase,Csk)表达的影响,探讨Csk在AngⅡ诱导足细胞骨架重构中的作用.方法 24只无特定病原(SPF)级雄性Wista大鼠皮下埋置渗透性微泵,随机分为正常对照组和AngⅡ输注组(AngⅡ以400 ng· kg-1·min-1持续输注),于造模后2周和4周留取肾组织用于后续实验.采用透射电镜观察各组大鼠肾脏足细胞超微结构改变;Western印迹检测各组大鼠Csk蛋白表达水平;免疫荧光法检测肾脏Csk表达及分布改变.体外培养条件永生性小鼠足细胞(MPC),Western印迹法检测不同浓度AngⅡ(10-9、10-8、10-7、10-6、10-5 mol/L)刺激MPC细胞6h及10-6mol/L AngⅡ刺激不同时间(0、1.5、3、6、12、24 h)后足细胞Csk蛋白表达水平.Csk siRNA转染足细胞下调Csk表达,异硫氰酸荧光素(FITC)-鬼笔环肽(phalloidin)标记F-actin评价AngⅡ、细胞松弛素D(Cytochalasin D)诱导的足细胞骨架重构改变.结果 (1)透射电镜观察发现,AngⅡ输注组大鼠足细胞出现足突融合;(2)免疫荧光及Western印迹显示,AngⅡ输注组肾小球Csk表达增加(P＜ 0.05);(3)AngⅡ可诱导培养的小鼠足细胞Csk蛋白表达增加(P＜0.05),且呈时间和剂量依赖性;(4) Csk siRNA转染足细胞下调Csk表达,可减轻AngⅡ诱导的足细胞F-actin重构,可减轻细胞松弛素D诱导的足细胞骨架破坏.结论 AngⅡ可诱导Csk表达上调,Csk可能参与了AngⅡ诱导的足细胞骨架重构及足突融合.
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过表达Src诱导K562细胞产生格列卫耐药
目的:探讨过表达Src激酶在诱导K562细胞产生耐药中的作用及机制.方法:应用质粒转染的方法在K562细胞中过表达Src激酶,WST方法检测对格列卫(Imatinib)的敏感性,并通过RNA干扰特异抑制Src激酶,检测其对耐药的K562/G细胞增殖的影响.结果:在K562细胞中过表达Src激酶,显著提高细胞对格列卫的耐药性;用siRNA方法抑制Src激酶,24 h就可以抑制约47％的K562/G细胞增殖.结论:Src激酶在诱导K562细胞耐药中发挥重要作用,抑制Src激酶可以抑制细胞增殖,Src激酶可以成为治疗耐药的慢性粒细胞白血病的新靶点.
