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PCNA在L-02肝细胞用氢醌处理后的表达
氢醌(Hydroquinone,HQ),是一种重要的工业化学物,同时也是苯在生物体内的代谢产物之一.HQ可经消化道、呼吸道和皮肤吸收,主要在肝脏内代谢.动物实验表明,HQ对肝、肾、造血系统和中枢神经系统等均可造成损害,并导致肿瘤的形成.体外研究也表明,HQ可导致动物及人体细胞染色体及DNA的异常改变,如引起染色体断裂、DNA链断裂,以及产生DNA加合物等 [1-3].此外,还有研究发现氢醌能够干扰T细胞的细胞周期而引起G1期阻滞,并能诱导HL-60细胞发生凋亡 [4-5].然而,目前关于HQ的毒性作用机制仍不太清楚.因此,本研究以体外培养的L-02肝细胞为研究对象,以HQ为受试物,旨在探讨L-02肝细胞中增殖细胞核抗原(PCNA)在HQ所致肝细胞毒性过程中的分子作用机制.
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氢醌对苯肼诱发小鼠溶血性贫血恢复的抑制作用
目的 观察氢醌能否延缓苯肼诱发的急性溶血性贫血的恢复.方法 雄性C57BL/6小鼠经腹腔注射40 mg/kg·bw苯肼,于第0～12天内每2天鼠尾采血1次,检测外周血指标变化.在观察氢醌对溶血性贫血恢复的影响时,雄性C57BL/6小鼠第0天经腹腔注射苯肼40 mg/kg·bw,第4天经腹腔注射50 mg/kg·bw的氨醌,于第4天和第6天鼠尾采血进行检测.结果 苯肼注射后12 d内,小鼠外周血RBC、HGB和PLT在第4天下降到低水平,HCT在第2天下降到低水平,MCV、MCH和RDW在第4天升高至高水平,MCHC在第2天升高至高水平,随后所有指标逐渐恢复至正常水平.单独注射氢醌不引起小鼠外周血相关指标明显变化;单纯苯肼注射组动物第6天的RBC、HGB和HCT相对于第4天出现明显的恢复性上升,而苯肼+氢醌组第6天的RBC、HGB和HCT明显低于苯肼组;苯肼组动物的MCHC和RDW在第4天显著高于对照组,第6天恢复性下降到对照水平,而苯肼+氢醌组第6天的MCHC和RDW明显高于苯肼组.结论 苯肼单次注射可诱发小鼠轻度的溶血性贫血,注射氢醌可抑制贫血的恢复,表明苯肼诱发急性溶血性贫血动物模型可用于评价外源化合物的红系造血毒性.
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氢醌诱导下肝细胞XPV基因mRNA表达规律的研究
目的 研究氢醌(HQ)对L-02肝细胞XPV基因mRNA表达的影响及其规律,探讨XPV基因在HQ所致肝细胞毒性过程中分子作用机制.方法 体外培养的L-02肝细胞经40μmol/L的HQ诱导后,采用实时荧光定量PCR法检测不同时间点(6、12、24和48h)XPV基因mRNA的表达;并检测不同剂量(0、5、10、20、40、80和160tmaol/L)HQ诱导24h后,各浓度组XPV基因mRNA的表达.结果 在24h的时间范围内,XPV基因在mRNA水平上的表达无论是染毒组(40μmol/L)还是正常对照组,均具有随时间的延长而增加的趋势;到24h时,相对表达量达到大值,当培养时间达到48h时,该基因的表达则有所下降;此外,在各时间处理组(6h、12h、24h和48h)中,染毒组L-02肝细胞内XPV基因在mRNA水平上的表达均高于正常对照组.各剂量HQ作用24h后,L-02肝细胞内XPV基因mRNA的表达在0～80μmol/L范围内随着剂量的增加而增加,以正常对照组XPV基因的相对表达量为1,各染毒剂量组内XPV基因mRNA的相对表达量分别增至1.20、2.02、2.37、2.67、4.40和2.32倍;80μmol/L时其相对表达量达到峰值,160μmol/L的HQ作用后,其表达却有所下降,但仍高于正常对照组.结论 HQ可以诱导XPV基因mRNA的表达变化,并且呈现一定的时间和剂量依赖性,提示XPV基因可能参与了肝细胞对HQ的应答过程.
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低剂量氢醌诱导人胚肺成纤维细胞适应性反应研究
目的通过研究低剂量氢醌(HQ)诱导人胚肺成纤维细胞(HLF)适应性反应的量效关系,建立氧化适应模式,探讨真核细胞过氧化适应性反应及其可能机理.方法应用HLF,以HQ为诱导剂,用不同剂量HQ时HLF细胞预处理12h后,再用80μmol/L HQ攻击HLFlh,结合微核试验、彗星实验及细胞周期变化,观察低剂量HQ诱导的适应性反应.结果在细胞整体活力水平,0.001μmol/L、0.01μmol/L HQ预处理可以提高HLF对攻击剂量80.0μmo1/L的耐受性.与对照组比较,从0.5μmol/L HQ剂量开始预处理的HLF的微核率和核异常率明显增加(P＜0.05),细胞出现不同程度拖尾现象,拖尾率及彗星尾长显著增加(P＜0.01),从0.1μmol/L预处理剂量开始,随着预处理剂量的增加,属3级、4级DNA损伤细胞比例逐渐增加.细胞周期出现G2期阻滞,G1期比例减少.与细胞仅大剂量攻击比较,0～0.1μmol/L预处理的HLF微核率和核异常率、尾长及拖尾率均明显减少、DNA重度损伤比例明显下降(P＜0.05).相关分析表明,预处理剂量从0.1μmol/L开始,HLF的微核率、核异常率、拖尾率及彗星尾长与HQ预处理剂量间均存在剂量反应关系.结论低剂量HQ预处理HLF后再用高剂量去攻击,出现不同程度的适应性反应.
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利用蛋白质组学技术研究氢醌刺激后人胚肺成纤维细胞蛋白质表达改变
目的 研究氢醌(HQ)对人胚肺成纤维细胞(HLF)蛋白质表达的影响,以阐明氢醌引起细胞应答反应的分子机制.方法细胞受HQ刺激后,加入裂解液,取上清丙酮沉淀,蛋白定量.双向凝胶电泳分离蛋白质组成分,胶体考马斯亮兰显色,Imagemaster2.0进行图像分析后选取差异点,胶内酶解后MALDI-TOF进行肽指纹图谱鉴定.结果图像分析结果显示,对照组HLF细胞检测到490±28个蛋白点,HQ染毒组为438±23个.氢醌刺激后15个蛋白斑点发生变化,初步鉴定了其中8个蛋白斑点,包括一些氧化应激和细胞骨架相关蛋白.结论氢醌可引起HLF细胞蛋白表达改变.
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低剂量氢醌诱导人胚肺成纤维细胞适应性反应的研究
目的研究氢醌诱导真核细胞适应性反应及其可能的机制.方法氢醌刺激MRC-5细胞后,用AlamarBlue还原率检测细胞增殖,乳酸脱氢酶漏出率检测细胞死亡,AnnexinV/PI染色检测细胞凋亡.双向凝胶电泳分离细胞总蛋白,图像分析后选取差异蛋白点进行质谱鉴定.结果AlamarBlue,乳酸脱氢酶及AnnexinV/PI双染结果显示10μM氢醌对细胞存活无显著影响,250μmol/L氢醌显著降低细胞存活率,细胞预先暴露于10μmol/L氢醌12h对250μmol/L氢醌攻击的耐受力明显增强,表现为细胞存活增多,死亡减少.双向凝胶电泳结果显示,对照组MRC-5细胞检测到1429±369个蛋白点,低剂量组、高剂量组和适应组分别为1453±307、1191±393和1107±247.氢醌刺激后24个蛋白斑点发生变化,肽指纹图谱及肽序列标签鉴定了其中22个蛋白斑点,这些蛋白参与细胞能量代谢、细胞骨架、蛋白折叠、氧化调节、信号传导等各个方面.结论低剂量氢醌可诱导MRC-5细胞适应性反应,多种蛋白参与细胞的适应性反应调控.
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氢醌对人L-02肝细胞泛素结合酶Rad6B表达的影响
目的 研究氢醌(HQ)对人L-02肝细胞中泛素结合酶Rad6B表达的影响.方法 将L-02肝细胞用不同浓度(0、5、10、20、40、80和160pmol/L)的HQ处理24h之后,采用实时荧光定量PCR技术检测R且d6B在mRNA水平上的表达;采用Western blot方法检测Rad6B在蛋白质水平上的表达.结果 在0～160gmol/L的范围内,HQ可诱导Rad6B在mRNA和蛋白质水平上表达的增加,具有随着剂量的增加而升高的趋势;并且各染毒剂量组(5、10、20、40、80和160μmol/L组)肝细胞Rad6B在mRNA和蛋白质水平上的表达均明显地高于对照组(Oμmol/L组)(P＜0.01);当HQ的作用浓度达到160pmol/L时,Rad6B的表达水平达到大值,其mRNA和蛋白质表达的相对定量值分别为4.35和0.85.结论 HQ可使L-02肝细胞的Rad6B表达增加.
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氢醌对骨髓间充质干细胞PARP-1表达的影响
目的探讨氢醌(HQ)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)PARP-1基因表达的影响。方法2015年1月一2015年3月在东莞市环境医学重点实验室以BMSCs为对照组,以PARP-1沉默BMSCs为处理组,磷酸盐缓冲液(PBS)溶解HQ,分别以0、2.5、5.0、10.0、20.0和40.0μmol/L HQ染毒两组细胞,应用实时荧光定量-聚合酶链反应检测两组细胞PARP-1基因表达的改变。结果与PBS组对比,2.5、5.0、10.0、20.0、40.0μmol/L HQ染毒24 h后,BMSCs细胞PARP-1表达量分别为1.39倍、1.65倍(P<0.05)、1.69倍(P<0.05)、1.76倍(P<0.05)和1.5倍(P<0.05)；沉默细胞PARP-1表达量分别为1.37倍(P<0.05)、1.58倍(P<0.05)、1.84倍(P<0.05)、2.15倍(P<0.05)和1.93倍(P<0.05)；与BMSCs细胞相比,沉默细胞中PARP-1表达水平下降了78%(P<0.05)差异均无统计学意义。结论两组细胞PARP-1表达水平随HQ剂量增加先升后降,PARP-1沉默能增加BMSCs对HQ的敏感性。
关键词： 氢醌 骨髓间充质干细胞 聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1 -
极低剂量氢醌诱导人胚肺成纤维细胞应答反应的研究
我们采用蛋白质组学技术研究了极低浓度氢醌(HQ)刺激人胚肺成纤维细胞蛋白质表达差异,用肽指纹图谱初步鉴定了数个差异蛋白,有助于阐明低剂量化学物刺激诱导细胞应答反应的分子机制,为发展低剂量毒物测试系统,建立正确的环境污染物的危险度评价体系提供理论依据.
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景天祛斑胶囊联合超声透入氢醌霜治疗黄褐斑的临床研究
目的：观察景天祛斑胶囊联合超声透入氢醌霜治疗黄褐斑的临床疗效。方法本研究为随机对照研究。将符合纳入标准的180例黄褐斑患者采用随机数字表法分为2组，对照组80例给予超声波透入2%氢醌乳膏；治疗组100例在对照组基础上加服景天祛斑胶囊，均连续治疗2个月。评价治疗结束时和2个月后随访时症状和皮肤损伤总积分。结果治疗结束时，治疗组治愈率为81.0%(81/100)，对照组为67.5%(54/80)，2组比较差异有统计学意义(χ2＝4.320，P＝0.038)。2个月后随访时，治疗组治愈率为92.0%(92/100)，对照组为76.3%(61/80)，2组比较差异有统计学意义(χ2＝5.538，P＝0.019)。治疗组治疗结束时、2个月后随访时皮损总积分[(1.61±0.84)分、(1.30±0.85)分比(3.48±1.02)分，t＝14.152、16.419]均较治疗前降低(P＜0.01)；对照组治疗结束时、2个月后随访时皮损总积分[(2.04±0.61)分、(2.03±0.51)分比(3.45±1.09)分，t＝10.097、10.554]均较治疗前降低(P＜0.01)。治疗组治疗结束、2个月后随访时皮损总积分下降程度较对照组显著(t值分别为3.839、6.767，P＜0.01)。结论景天祛斑胶囊联合超声波透入氢醌乳膏可有效治疗黄褐斑。
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复方芩醌乳膏的制备与质量控制
目的 探讨复方芩醌乳膏的制备、质量控制方法.方法 以黄芩、氢醌和维生素E为主要原料,选择适宜的乳化剂,制成O/W型乳膏,采用高效液相色谱法测定该乳膏中黄芩苷的含量.结果 复方芩醌乳青制剂稳定性较好,无刺激性.含量测定方法 快速准确,黄芩苷在0.25～2.5 μg范围内,进样量与吸收面积分值呈良好的线性关系.平均回收率为98.9%,RSD为0.73%(n=5),结果 准确,重复性好.结论 复方氢醌乳膏处方及制备工艺合理,质量可控.
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RP-HPLC测定羟苯磺酸钙含量及有关物质
目的:建立反相高效液相色谱法测定羟苯磺酸钙原料药的含量及其有关物质.方法:采用C8色谱柱(4.6 mm×200 mm,5μm),柱温35℃,50 mmol·L-1磷酸二氢钠溶液-乙腈(90∶ 10)为流动相等度洗脱,流速0.8 mL·min-1,检测波长220 nm,进样体积20 μL.结果:含量测定色谱条件下,羟苯磺酸钙质量浓度在20.0 ～ 200.0 mg·L-1与峰面积呈良好的线性关系(r=0.999 5),平均回收率99.4％;有关物质项下杂质氢醌的含量分别为0.018％,0.023％,0.021％,杂质总量分别为0.16％,0.18％,0.13％.结论:方法简便、快速,可用于羟苯磺酸钙原料药的含量测定及有关物质的检查.
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人参毛状根生物合成熊果苷的研究
目的:研究人参毛状根生物合成熊果苷的基本条件.方法:以熊果苷的含量、氢醌(1,4-对苯二酚)的转化率为指标,找出适于生物合成的培养条件、持续时间和底物浓度.结果:培养22 d的人参毛状根更换含底物的B5培养基后,对浓度为2 mmol@L-1的氢醌持续转化24 h,所合成的熊果苷占干重的13.0%,转化率达89.0%.结论:本文首次以人参毛状根为反应器,人工合成出人参属植物所不具有的熊果苷.
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氢醌对体外培养骨髓基质细胞核转录因子表达的影响
为了研究氢醌(hydroquinone, HQ)对细胞激活剂佛波酯(PMA)导致的骨髓基质细胞(BMSC)核转录因子表达的影响,并初步探讨其与苯的血液学毒性的关系.用体外培养法获得骨髓基质细胞,观察其形态学变化;分别用NF-κB P65免疫组织化学方法和TransAM P65试剂盒测定了用不同浓度的氢醌加激活剂PMA刺激后的骨髓基质细胞NF-κB蛋白表达和活性的动态变化.结果表明:各组细胞加入HQ后,与对照组相比,P65蛋白由细胞核转回至胞核周围的细胞浆,染色呈弱阳性;不同浓度的HQ作用不同时间后NF-κB活性测定结果与对照组间具有明显差异;各组之间相比,100 μmol/L的HQ作用72小时对NF-κB的抑制作用明显;而0.1 μmol/L的HQ几乎无抑制作用.结论: HQ可抑制体外培养骨髓基质细胞核转录因子的激活,并且随HQ浓度和作用时间而增强,推测可能与苯的造血微环境毒性有关.
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维A酸对A375细胞黑素合成及酪氨酸酶蛋白表达的影响
目的：探讨维A酸对人A375黑素瘤株细胞黑素含量、酪氨酸酶活性及蛋白表达的影响。方法将培养的A375细胞分为维A酸组、8-甲氧补骨脂素（8-MOP)组、氢醌组、阴性对照组(A375细胞只加入相应溶媒，不加入药物)分别培养，于24 h、48 h和72 h测定黑素含量及酪氨酸酶活性；培养24 h Western检测酪氨酸酶蛋白的变化。结果A375细胞加入维A酸24 h、48 h、72 h后黑素含量及酪氨酸酶活性均较阴性对照组下降（P＜0.05）。阴性对照组A375细胞酪氨酸酶蛋白含量测定值为（0.89±0.085），维A酸组A375细胞酪氨酸酶蛋白含量为（0.56±0.044）（t=3.811，P＜0.05）。结论维A酸能抑制人A375黑素瘤株细胞黑素含量、酪氨酸酶活性及蛋白表达。
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积雪草甙对酪氨酸酶活性的抑制作用及对Cloudman S91黑素瘤细胞黑素合成的影响
目的探讨积雪草甙外用脱色素的作用机制.方法体外观察积雪草甙对蘑菇酪氨酸酶活性的作用并进行酶促反应动力学分析.进一步以系列浓度的积雪草甙作用于体外培养的Cloudman S91黑素瘤细胞,测定细胞酪氨酸酶活性、黑素含量和细胞增殖率.结果积雪草甙能剂量依赖性抑制蘑菇酪氨酸酶活性,酶促动力学分析提示积雪草甙为蘑菇酪氨酸酶混合型抑制剂.进一步研究发现,积雪草甙能抑制体外培养的Cloudman S91黑素瘤细胞酪氨酸酶活性和黑素合成,但对细胞增殖无明显影响.与氢醌相比,积雪草甙抑制酪氨酸酶活性低于相同浓度的氢醌.结论积雪草甙可直接作用于黑素细胞,抑制黑素合成,是一种无细胞毒性的皮肤脱色剂.
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RP-HPLC测定氢醌无水凝胶的含量
目的:建立反相高效液相色谱法测定氢醌无水凝胶的含量.方法:以Resolve-C18(4.6mm×150mm,5μm)柱为分析柱;甲醇-水(1∶1)为流动相,检测波长为280nm,以咖啡因为内标物,按峰面积内标法计算.结果:平均回收率为97.88%,RSD为0.71%(n=6),氢醌在5～50μg*mL-1范围内浓度与峰面积比呈良好的线形关系,r=0.9997.结论:此方法简便、快速、准确,有效地控制了该制剂的质量.
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硫氧还蛋白对氢醌细胞毒性的抑制
目的氢醌引起细胞凋亡,可能是通过降低细胞内巯基水平及升高活性氧水平改变细胞内氧化还原状态.鉴于硫氧还蛋白在维持细胞氧化还原状态平衡上也起着重要作用,本研究探讨人硫氧还蛋白(hTRX)对氢醌细胞毒作用有无影响.方法采用脂质体法,将真核表达质粒pVP22-hTRX和 pVP22分别转入人胚肾细胞中,并将获得的G418抗性单克隆细胞株hTRX12和VP22细胞进行Western印迹法分析.分别用荧光探针DCFH-DA法、碘化丙啶染色法及MTT法测定活性氧水平、凋亡率及细胞存活率.结果用不同浓度氢醌处理hTRX12细胞与VP22细胞,hTRX过度表达可降低氢醌所致的活性氧水平升高,降低氢醌诱导的凋亡,抑制氢醌的细胞毒性.另外,用重组人硫氧还蛋白(rhTRX)与氢醌同时处理未转染人胚肾细胞,也可观察到类似结果.结论硫氧还蛋白可对抗氢醌的细胞毒性,其机制可能是通过降低氢醌所致活性氧升高及维持细胞内巯基水平.
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低剂量氢醌、甲醛及过氧化氢刺激人胚肺成纤维细胞适应性反应的共同差异蛋白的表达
目的 研究低剂量氢醌(HQ)、甲醛(FA)及过氧化氢(H2O2)刺激引起的细胞耐受与适应反应是否存在共同机制.方法 利用已建立的HQ, FA及H2O2诱导人胚肺成纤维细胞MRC-5适应性反应模型,分别选择能诱导产生适应性反应的低剂量和致死剂量的HQ, FA及H2O2交叉染毒,Alamar Blue还原率检测细胞增殖.适应剂量HQ,FA及H2O2处理细胞后,二维凝胶电泳(2-DE)分离细胞总蛋白,图像分析后选取共同变化的差异蛋白点进行质谱鉴定.结果 MRC-5细胞交叉染毒结果发现,低剂量HQ预刺激后再给予致死剂量FA或H2O2刺激,以及低剂量FA或H2O2预刺激后再给予致死剂量HQ刺激,其Alamar Blue还原率均较单独用致死剂量HQ,FA或H2O2刺激增高.低剂量HQ,FA和H2O2刺激MRC-5细胞后2-DE图谱图像分析发现,对照组MRC-5细胞检测到1519±154个蛋白点,低剂量HQ组为1551±172个,低剂量FA组为1572±179个,低剂量H2O2组为1429±159个,凝胶匹配后发现,染毒后出现4个共同消失的蛋白点,7个新增蛋白点,经肽质量指纹图谱和串联质谱鉴定了其中6个蛋白点.已鉴定的蛋白包括二磷酸核苷激酶B,蛋白磷酸酶PP1-β催化亚基,Ufm1结合酶1,肌苷-5'-单磷酸脱氢酶,α晶状体球蛋白B链,巯氧还蛋白过氧化物酶1,这些蛋白功能涉及氧化应激、细胞骨架、蛋白折叠等各个方面.结论 HQ, FA和H2O2交叉染毒可相互诱导适应性反应;低剂量HQ, FA和H2O2可诱导多种共同蛋白的表达.
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HPLC测定甲萘氢醌二磷酸酯钠的有关物质及含量
甲萘氢醌二磷酸酯钠(menadiol sodium diphosphate)为促凝血药,可促使肝脏合成凝血酶原等凝血因子,达到止血的目的.此外对内脏平滑肌痉挛引起的绞痛有明显抑制作用.
