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中性粒细胞抑制人单个核细胞释放TNF-α及其机制的研究
目的:探讨人中性粒细胞(PMNs)对人外周血单个核细胞(PBMCs)释放TNF-α的影响及其作用的初步机理.方法:采集健康供血者的新鲜外周静脉血,以葡聚糖沉淀和密度梯度离心法分离其PMNs和PBMCs,将PMNs与PBMCs按2∶1的数量比与脂多糖共同培育后,分别采用酶联免疫吸附法测定培养上清的TNF-α浓度,并用流式细胞测定结合荧光标记脂多糖的单核细胞的百分率及单核细胞表面平均荧光强度.结果:PMNs在细菌脂多糖刺激下不释放TNF-α,PMNs可以抑制PBMCs释放TNF-α,其抑制作用具有细胞特异性;经多聚甲醛固定的PMNs仍具有上述的抑制作用.流式细胞仪结果显示PMNs并不影响单核细胞与脂多糖结合.结论:PMNs可抑制人PBMCs释放TNF-α,其机理可能是PMNs干扰了脂多糖激活PBMCs的信号转导过程,抑制细菌脂多糖对其的活化,从而下调TNF-α的释放.
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用垂直转头密度梯度离心法研究硒对鼠肝核糖体合成的影响
目的:测定多聚核糖体含量及多聚程度的分布对研究生物组织的生理生化现象和代谢过程有重要意义.方法:我们把断奶一周的SD系大鼠(体重60～70 g)随机分为低硒组,加硒Ⅰ组和Ⅱ组,喂养8周,禁食12 h,断头取出肝脏,离心得去线粒体上清液,再加入DOC(脱氧胆酸钠),用差速和不连续梯度离心法分离得总核糖体和多聚核糖体.将制备的多聚核糖体铺放在15%～55%的S形蔗糖密度梯度液顶部,采用RPV50T垂直转头,10 ℃,40 000 r/min离心9 min(日立SCP-85H超速离心机).DGF-U型密度梯度仪上取法收集,同时检测260 nm处紫外吸收.结果:1.总核糖体,多聚核糖体含量(单位mgRNA/g肝组织):缺硒组总核糖体6.74±0.16,多聚核糖体3.61±0.18;多聚核糖体与总核糖体比值0.52±0.03;加硒Ⅰ组,总核糖体7.78±0.17,多聚核糖体4.72±0.09,比值0.61±0.02;加硒Ⅱ组,总核糖体7.93±0.18,多聚核糖体4.79±0.11,比值0.61±0.02;2.多聚核糖体沉降图谱表明(图略)缺硒组和加硒组均出现多个核糖体峰(n＞4),并且加硒组明显高于缺硒组.结论:本实验表明,加硒组多聚核糖体、总核糖及比值均高于缺硒组,图谱表明加硒组多聚核糖体聚集程度高.说明加硒组在蛋白质合成方面不仅合成能力增强,其活性也显著提高,提示硒有促进蛋白质合成和增强细胞修复的作用.本实验采用垂直转头密度梯度离心法,梯度在离心过程中的重定向作用使得离心路径大大缩短,离心管插放在转头靠边缘处,使大半径和小半径处的样品均受到较强离心场作用,因而分离时间大大缩短,核糖体降解随之减少;另外,该转头离心管容量大,加之重定向使梯度横断面进一步增大,梯度容量大大增加.该法为快速、大量制备及分析多聚核糖体提供一良好途径.
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分离培养人卵泡液中颗粒细胞两种方法的比较
目的 探讨简便可行分离卵巢颗粒细胞的方法以供化疗保护卵巢功能的体外实验研究.方法 分别采用密度梯度离心法和低渗透性溶解法分离及原代培养16例卵泡液中的颗粒细胞.结果 低渗透性溶解法与密度梯度离心法分离及原代培养的细胞其细胞活率和雌激素的分泌量大体相当,差异无统计学意义(P＞0.05);但低渗透性溶解法耗时明显比密度梯度离心法低,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 低渗透性溶解法并不降低颗粒细胞的活率及其激素的分泌,反而较密度梯度离心法省时,简便高效.
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密度梯度离心法与直接上游法优化处理精液对宫腔内人工授精临床妊娠率的影响
目的：应用密度梯度离心法和直接上游法处理不明原因不孕和轻度精液异常患者的精液，比较两种方法对宫腔内人工授精（IUI）临床妊娠率的影响。方法：回顾性分析2013年1月至2014年12月期间，在我中心进行促排卵＋IUI的571个周期患者，统计其精液优化处理方法和临床妊娠率。结果：总体临床妊娠率为密度梯度离心法（17．8％）显著高于直接上游法（11．4％）（P ＜0．05）；不明原因不孕组的临床妊娠率为密度梯度离心法（33．7％）显著高于直接上游法（20．3％）（P ＜0．05）；轻度精液异常组的临床妊娠率为密度梯度离心法（11．6％）显著高于直接上游法（7．6％）（P ＜0．05）。结论：密度梯度离心法相对直接上游法能有效提高因不明原因不孕和轻度精液异常患者IUI的临床妊娠率。
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密度梯度离心法分离精子在宫腔内人工授精中的应用
目的:探讨密度梯度离心法应用于宫腔内人工授精的精子分离时精子指标的变化及精子形态对回收率的影响.方法:选择2008年9-10月间所有进行宫腔内夫精人工授精的51份精液,采用密度梯度离心法分离精子,记录精子分离前后的各项指标,计算回收率并作统计分析.结果:(1)精子存活率由(53.63±15.94)%提高至(88.75±9.69)%(P＜0.05),平均回收率为(25.84±16.57)%.(2)正常形态精子比例由9%提高至18%(P＜0.05),各类畸形精子均显著减少,尤其颈部和尾部畸形的精子减少为明显.(3)根据处理前精子正常形态的比例分为≤4%、5%～14%、≥15%3组,分离后精子存活率分别为(80.45±14.05)%、(91.32±7.30)%、(90.00±4.33)%(P=0.004),回收率分别为(19.67±10.49)%、(28.51±16.87)%、(41.14±15.02)%(P=0.013).精子正常形态比例与回收率呈正相关(r=0.456,P=0.001).结论:密度梯度离心法可以有效回收活力好、形态正常的精子,对于去除颈部和尾部畸形的精子效果更好,精子正常形态与回收率呈正相关.
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密度梯度离心法处理逆行射精患者尿液内精子用于人工授精的临床效果观察
目的:探讨密度梯度离心法处理逆行射精患者尿液内的精子用于人工授精的可行性.方法:碱化患者尿液,应用两层密度梯度离心法处理尿液内的精子,在配偶排卵期内行宫腔内人工授精.结果:5例逆行射精患者,在经过共18次处理尿液内精子及对配偶实施人工授精术后,有3例成功妊娠并有2例已足月分娩.结论:密度梯度离心法处理逆行射精患者尿液内的精子,方法简单、快捷有效,用于人工授精具有可行性.
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辅助生殖技术中人类精子优化技术的相关研究
人类精子优选技术是辅助生殖技术(assisted reproductive technology,ART)的产物,是指在体外通过人工方法对精液进行处理的一门技术.其目的是减少或去除精液中的活性氧、死精子、去获能因子等物质,以获得优选、浓缩、高活力且具备受精能力的精子悬液,并启动精子获能,进而增加精子的运动能力和穿卵能力,提高临床妊娠率[1].目前常用的精子优选方法有上游法、密度梯度离心法,其他还有磁珠分选法、玻璃纤维滤过法、分子玻璃纤维滤过法等.下面将这些精子优选技术作一综述.
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密度梯度离心法加上游法处理精液对精子运动参数及形态学的影响——附102份标本分析
目的:了解密度梯度离心法加上游法处理精液对精子各运动参数和形态学的影响.方法:采用密度梯度离心法加上游法处理102份男性精液标本,应用计算机辅助精液分析系统软件分析精子各项运动参数,并运用改良巴氏染色法观察精子形态.结果:经密度梯度离心法加上游法处理后,精子活动率、活动力、曲线速度、直线速度等运动参数值均明显提高(均为P＜0.01).经该法处理后,畸形精子百分率、精子畸形指数均明显降低(均为P＜0.01).结论:密度梯度离心法加上游法可使精子的运动参数及形态学均得到明显改善,是较好的体外处理精液方法.
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全骨髓贴壁法与密度梯度离心法培养小鼠内皮祖细胞的方法比较
目的:比较全骨髓贴壁法与密度梯度离心法分离培养小鼠内皮祖细胞(EPCs)的差异.方法:取8周龄雄性近交系昆明小鼠,提取原代EPCs,分别采用全骨髓贴壁法和密度梯度离心法分离培养细胞,观察细胞形态、细胞摄取DiI-acLDL、结合FITC-UEA-I双阳性率及细胞生长增殖情况.结果:全骨髓贴壁法培养第4天,可见较多贴壁细胞,呈圆形、短梭形,部分为长梭形;第6～8天贴壁细胞多为梭形及类圆形;随着培养时间的延长,梭形细胞数量渐渐增多,可出现细胞集落,10d后EPCs大量增殖,14d细胞长满培养瓶底部.密度梯度离心法接种24 h后可见圆形贴壁细胞,并逐渐增多变形;培养至第4～7天,可以观察到贴壁细胞明显增多且体积变大,细胞为类圆形、梭形或多边形,第7～9天,细胞呈集落生长,多数细胞呈多边形或长梭型;培养至第2周可见贴壁细胞生长呈“铺路石”样外观.全骨髓贴壁法细胞摄取DiI-acLDL和结合FITC-UEA-I双阳性率高于密度梯度离心法(P＜0.05),但两种方法细胞增殖率比较无明显差异(P＞0.05).结论:全骨髓贴壁法与密度梯度离心法均可培养出EPCs,且两种方法培养的细胞增殖活性相当,但前者更简单易行,EPCs培养成功率更高.
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嗜酸性粒细胞的分离与纯化
以往关于嗜酸性粒细胞分离与纯化的有关资料介绍得比较简单,实验中往往分离不到理想纯度和活性的嗜酸性粒细胞.我们用Percoll不连续密度梯度离心法[1]提取嗜酸性粒细胞,效果满意,现介绍如下.
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预处理联合 IUI／ICSI治疗逆行射精致不育的效果观察
目的：观察预处理联合宫腔内人工授精（ IUI ）／卵胞浆内单精子显微注射（ ICSI ）治疗逆行射精致不育的临床效果。方法12例逆行射精致不育患者，在取精前10 d低蛋白饮食及碱化尿液，采用密度梯度离心法或密度梯度离心法加上游法处理尿液，以获得更多有活力的精子。获取精子后，其中8例行IUI助孕，4例因女方双侧输卵管梗阻行ICSI助孕。结果8例行IUI助孕患者中，助孕成功获得妊娠1例，助孕失败7例，其中有1例患者行3个周期IUI助孕失败改行ICSI助孕，新鲜胚胎移植未孕，3个月后冷冻胚胎移植获得妊娠。4例行ICSI助孕患者中，首次新鲜移植成功1例，经皮附睾穿刺抽吸术取精后行ICSI助孕成功1例，失败2例。结论取精前低蛋白饮食及碱化尿液联合IUI／ICSI方法治疗逆行射精致不育患者有助于妊娠。
关键词： 逆行射精 宫腔内人工授精 卵胞浆内单精子显微注射 碱化尿液 密度梯度离心法 -
两种处理方法对精子顶体完整性和DNA损伤的影响
目的 研究上游法和密度梯度离心法处理对精液常规参数、顶体完整性及DNA损伤的影响. 方法 90例男性精液标本用上游法和密度梯度离心法处理,检测处理前后精液常规参数、精子顶体完整率及精子DNA碎片指数. 结果 两种方法处理后,精子浓度明显下降(P＜0.01),精子活率、活力明显提高(P＜0.01)；正常形态精子比例和顶体完整率显著提高(P＜0.05),DNA碎片指数显著降低(P＜0.01),两种处理方法比较差异无统计学意义.结论 两种处理方法均可以使顶体完整精子比例较处理前明显提高,DNA损伤精子比例较处理前明显降低,但两法之间无统计学差异.两种处理方法均可以不同程度优化精液质量,实验室可根据精液情况选择处理方法.
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两种精子优选法对正常形态活动精子回收率的对比研究
目的:探讨两种精子优选法对正常形态活动精子回收率的对比情况.方法:选取我院生殖中心门诊就诊的50例正常精液样本作为研究对象,每份标本分成上游法组和PureSperm法组,观察两组精子优选法优选后精子运动参数、回收效果以及回收率.结果:上游法和PureSperm法其优选后a级精子率、a+b级精子率、VCL、VSL、VAP、ALH、BCF、LIN、WOB、STR等指标均明显优于优选前(P＜0.05),但两组优选法后精子运动参数比较均无统计学差异(P＞0.05);优选后上游法和PureSperm法其密度、活力、头部、中段和尾端畸形率、SDI均明显优于优选前(P＜0.05),其中PureSperm法优选后密度明显高于上游法,但活力明显低于上游法(P＜0.05),活力、头部、中段和尾端畸形率、SDI等两种优选法比较无统计学差异(P＞0.05);PureSperm密度梯度离心法a级活动精子和a+b级活动精子和正常形态活动精子回收率明显高于上游法(P＜0.05),差异有统计学意义.结论:两组精子优选法均可获得较好的优选精子,PureSperm密度梯度离心法的精子回收率更高,但活力较低.
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SD大鼠肾小管上皮细胞的原代培养及鉴定
目的:建立一种良好的SD大鼠肾小管上皮细胞原代培养、传代及鉴定方法.方法:选用4周龄SD幼鼠的肾皮质进行细胞培养,采用机械研磨、胰酶消化、过滤,Percoll密度梯度离心法分离纯化肾小管后,选择含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基进行原代培养及传代.制作细胞爬片,用免疫细胞化学(Cytokeratin 18表达阳性)进行鉴定.结果:肾小管上皮细胞围绕肾小管节段呈岛屿状向四周生长,4～5 d后基本达到融合,细胞呈多边鹅卵石样,透明度及折光性强.结合形态学及免疫细胞化学鉴定,原代培养及传代的细胞98%以上为肾小管上皮细胞.结论:采用此方法分离培养的肾小管上皮细胞数量多,均一性生长佳,可重复性操作良好.
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人外周血晚期内皮祖细胞中的高糖记忆效应
目的:探索人外周血晚期内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是否存在高糖代谢记忆.方法:密度梯度离心法分离获取人外周血中的单个核细胞,诱导培养2周时间待细胞呈现立体的鹅卵石状后,即为晚期EPCs,采用细胞免疫化学染色对分离培养的细胞进行鉴定.MTIT比色法摸索出高糖作用的浓度和时间梯度后,分3组处理细胞,即正糖组(NG,5.5 mmol/LD-葡萄糖×6 d),高糖组(HG,30 mmol/L D-葡萄糖×6d),记忆组(MG,30 mmol/L D-葡萄糖×6 d+5.55 mmol/L D-葡萄糖×6d)处理细胞,采用粘附实验、MTF比色法、EdU实验、Transwell小室实验、成管实验,测定3组细胞的粘附、增殖、迁移、成管功能.结果:粘附结果显示高糖组(38.296±6.615)、记忆组(37.815±6.196)均较正糖组(63.370±10.363)粘附能力下降(P＜0.05);MTT结果显示高糖组(79.041±19.678)、记忆组(81.524±6.710)均较正糖组(100.000±0.000)增殖能力下降(P＜0.05);EdU结果显示高糖组(45.809±7.945)、记忆组(37.740±8.206)均较正糖组(88.858±5.727)增殖能力下降(P＜0.05);迁移结果显示高糖组(25.111±6.051)、记忆组(25.778±6.037)均较正糖组(64.889±10.729)迁移能力下降(P＜0.05);成管结果显示高糖组(12.690±3.616)、记忆组(14.198±4.073)均较正糖组(64.407±6.358)成管能力下降(P＜0.05);记忆组与高糖组相比,粘附、增殖、迁移、成管功能均未能改善(P＞0.05).结论:晚期EPCs存在高糖代谢记忆.
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MSCs 2种分离培养方法及其培养液中的 VEGF、SDF-1α浓度比较
目的：通过2种分离培养方法所得骨髓间充质干细胞（MSCs）的生长特征和微环境中细胞因子的比较，提供一种可以快速、安全、高效地为临床和实验提供大量优质MSCs的方法。方法提取C57BL／c小鼠的骨髓，分别作密度梯度离心法和全骨髓贴壁培养分离法分离培养MSCs ，通过流式细胞仪检测细胞表面CD29＋、CD31－、CD34－、CD45－表达水平，并比较各自所得细胞的生长曲线；ELISA检测培养液中的血管内皮生长因子（VEGF）、SDF‐1α浓度并比较二者的差异。结果与密度梯度离心法比较，全骨髓贴壁分离法所得原代细胞有较快的生长速度，较短的生长周期；培养液中VEGF和SDF‐1α浓度也稍高于密度梯度离心法。结论全骨髓贴壁培养法可以快速、方便、有效地为临床和实验提供大量MSCs ，所得细胞的培养环境优于密度梯度离心法，减少了对细胞功能的损害。
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全骨髓培养法和密度梯度离心法分离hBMSCs的比较研究
目的 比较全骨髓培养法和密度梯度离心法对hBMSCs的分离效果.方法 取健康成年人自愿捐赠的骨髓,分别采用全骨髓培养法和密度梯度离心法分离、培养hBMSCs并进行传代.采用倒置相差显微镜观察原代细胞形态变化;取第2代细胞培养7 d后行HE染色;对比原代及第2、3代细胞传代时间;流式细胞仪检测表面标志物;并检测细胞经成骨诱导后3、6、9 d的ALP含量,于第9天采用Kaplow法染色观察细胞ALP染色情况.结果 全骨髓培养法分离的原代细胞呈聚集样生长,而密度梯度离心法分离的原代细胞呈单个、散在生长.HE染色示两种方法分离培养的第2代细胞轮廓清晰,大小及形态均匀一致.全骨髓培养法原代细胞的传代时间(15.36±1.67)d;明显快于密度梯度离心法的(18.57±1.05)d,差异有统计学意义(P<0.01);第2、3代细胞的传代时间两种分离方法差异无统计学意义(P>0.05).经流式细胞仪检测,两种方法培养的hBMSCs上阳性表面标志物CD29、CD44、CD71、CD105、CD166含量和阴性表面标志物CD34含量比较差异无统计学意义(P>0.05),阴性表面标志物CD14、CD45含量差异有统计学意义(P<0.01).两种方法分离的第2代细胞经成骨诱导后各时间点ALP含量比较差异无统计学意义(P>0.05);成骨诱导后第9天ALP染色程度基本一致.结论 全骨髓培养法可分离出hBMSCs,其分离效果与密度梯度离心法相似.
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密度梯度离心法与直接上游法在宫腔内人工授精中的应用效果分析
目的 探讨密度梯度离心法与直接上游法两种方法优化处理精液行宫腔内人工授精对精子动态参数和受孕率的影响.方法 对116例患者共254个IUI治疗周期作回顾分析,将254个周期随机分为A、B两组,两组精子的动态参数无显著性差异,A组采用直接上游法,B组采用密度梯度离心法优化处理精液后行宫腔内人工授精,比较两种方法的精子检测结果与妊娠结局.结果 两种方法处理前后精子密度、活率、活力(a+b)、畸形率的差异均有显著性(P＜0.05)；两种方法处理后精子密度的差异有显著性(P＜0.05)；密度梯度离心法高于直接上游法,但活率、活力、畸形率的差异无显著性(P＞0.05),两组间的临床妊娠率及流产率的差异也无显著性(P＞0.05).结论 两种方法处理精液均可改善精子动态参数,但行宫腔内人工授精得到的临床妊娠率差异无显著性(P＞0.05).
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内皮祖细胞与心血管危险因素研究进展
1 内皮祖细胞的来源、表面标志、分离方法内皮组细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)的来源主要包括人脐静脉血、成人外周血、骨髓,并且发现外周血中的EPCs起源于骨髓,而脐血中的EPCs起源于胎儿的肝脏.迄今为止,EPCs尚无统一的鉴定标准,一般将表达CD34/CD133/KDR (VEGFR2或Flk(1))这3种基因标志物的细胞定义为EPCs.EPCs的分离方法很多,常见的有密度梯度离心法配合直接贴壁筛选法,除此以外还有细胞分离装置、免疫磁珠分选法、双色荧光流式细胞仪分离法、生物素二抗生物素亲和吸附法、单克隆抗体铺展贴壁细胞分离法等[1].
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Nycodenz密度梯度离心法提取及纯化大鼠心肌线粒体
目的 建立一种利用Nycodenz密度梯度离心法提取组织线粒体的方法.方法 传统离心方法得到粗提线粒体后,在Nycodenz密度梯度介质中超高速离心得到纯化线粒体,进一步在经改良的线粒体分离介质中重复离心2次,得到高纯度的线粒体.利用透射电镜和Western Blot检测线粒体纯度.结果 使用Nycodenz密度梯度离心法和线粒体分离介质提纯的线粒体量多、纯度较高(COXⅣ含量纯化组:粗提组=220％ ±26％vs.160％ ±34％,P＜0.05),且电镜照片显示结构完整.结论 使用Nycodenz密度梯度离心法可获得高纯度且结构较完整的线粒体.
