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体内外成熟卵丘复合体中卵丘细胞蛋白质组学差异的研究
目的 比较体内外成熟卵丘复合体的卵丘细胞蛋白质组学差异,探讨体外成熟卵母细胞发育能力差的原因,进一步阐明卵母细胞发育调控机制. 方法 收集20例因男性因素行卵胞浆内单精子注射-胚胎移植(ICSI-ET)的患者成熟卵丘复合体的卵丘细胞为对照组,该20例患者的不成熟卵丘复合体经体外培养成熟后的卵丘细胞为实验组,将两组卵丘细胞进行双向凝胶电泳分析,并通过质谱技术鉴定差异蛋白质. 结果 实验组与对照组相比共有13个蛋白质表达上调(其中7个蛋白质的表达水平,实验组是对照组的3倍以上;6个蛋白质在实验组有表达,而在对照组中无表达),10个蛋白质表达下调(其中2个蛋白质的表达水平,对照组是实验组的3倍以上;8个蛋白质在实验组无表达,而在对照组中有表达),筛选质谱鉴定了6个蛋白点,得到5种蛋白质包括PRO2044蛋白、KIAA1191蛋白、乙酰辅酶A酰基转移酶2、Ⅱ型角蛋白亚基蛋白和ARID2蛋白. 结论 通过蛋白质组学研究技术发现卵丘复合体在体内成熟与体外成熟存在差异,这些差异蛋白质主要与清除自由基、抗凋亡、细胞周期调控等相关,推测这些蛋白质的表达异常可能与体外成熟卵母细胞质量差的原因有关.
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卵母细胞授精前剥除部分卵丘细胞对体外受精-胚胎移植结局的影响
目的 研究授精前剥除部分卵丘细胞的卵母细胞的受精、胚胎发育和临床结局. 方法 授精前用机械法剥除卵母细胞外包裹的部分卵丘细胞,每个卵母细胞采用微滴法单独受精(A组).对照组(B组)采用常规体外受精-胚胎移植(IVF-ET)受精方式进行.比较两组受精率(2PN、1PN和3PN)、卵裂率(2PN、1PN和3PN)、优胚率、临床妊娠率、种植率和流产率. 结果 A组和B组的受精率分别是76.51％和73.74％(2PN受精率分别是60.64％,61.62％;1PN受精率分别是1.61％,0.86％；3PN受精率分别是10.44％,9.69％)、卵裂率分别是98.95％和99.17％(2PN卵裂率分别是97.02,98.01％;1PN卵裂率分别是100％,85.71％；3PN卵裂率分别是100％,100％)、优质胚胎率分别是60.75％,62.68％、临床妊娠率分别是63.89％,61.76％、种植率分别是48.00％,38.78％、流产率分别是9.09％,11.90％.所有指标均无统计学意义. 结论 卵母细胞授精前剥除部分卵丘细胞不会影响IVF-ET的临床结局,为利用卵丘细胞进行非侵入性种植前遗传学诊断提供临床依据.
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雌激素及雌激素受体与卵母细胞成熟的关系
目的 探讨促排卵患者外周血和卵泡液中雌二醇(E2)及卵丘细胞中雌激素β受体(ER-β)与卵母细胞成熟的关系. 方法 选择34例行卵胞浆内单精子注射(ICSI)的患者,收集取卵日外周血、卵泡液及卵丘细胞,电化学发光法(ECLIA)检测血清及卵泡液中E2的水平,采用实时荧光定量聚合酶链反应(Realtime-PCR)检测卵丘细胞ER-β mRNA的表达量,并记录卵母细胞成熟度. 结果 外周血E2水平显著低于卵泡液内E2的水平,两者差异有统计学意义(P=0.000),外周血E2水平/获卵数与每位患者卵泡液中E2平均水平呈正相关(P=0.002);MⅡ期卵母细胞内卵泡液E2水平显著高于MⅠ期和GV期,差异有统计学意义(P＜0.01);MⅡ期卵母细胞的卵丘细胞中ER-β mRNA的相对表达量是MⅠ期的2.34倍(P＜0.01),是GV期的3.78倍(P＜0.01). 结论 外周血E2水平间接反映卵泡液内E2水平,卵泡液内E2水平与卵母细胞成熟度呈正相关,卵丘细胞ER-β mRNA表达量与卵母细胞成熟呈正相关性.
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卵母细胞代谢及其调节
卵母细胞发育与成熟过程依赖大量ATP,因此物质代谢旺盛.卵母细胞以葡萄糖和/或其中间产物丙酮酸为底物,在线粒体内氧化磷酸化,产生大量ATP,是卵母细胞主要的供能形式.但是,卵母细胞糖代谢模式有种属特异性差异.同时,卵母细胞也存在脂肪酸和氨基酸的代谢.除提供能量外,这些代谢产物在细胞信号传导、渗透压调节等方面也有重要作用.卵母细胞代谢的精确调控受多方面因素的影响如卵母细胞胞内、胞间、胞外的调控等.研究卵母细胞代谢及其机制,对探寻改善卵母细胞质量、提高卵母细胞体外成熟效能具有重要的意义.
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卵丘细胞在卵母细胞发育过程中的作用
卵母细胞能否正常发育成熟是影响女性生育能力的重要因素,目前人们普遍认为,人类卵母细胞和卵丘细胞之间的相互交流,对于卵母细胞发育是不可或缺的.在卵泡窦腔形成过程中,颗粒细胞分化为壁颗粒细胞和卵丘细胞,卵丘细胞与其他卵泡细胞不同,具有本身独特的功能、促进排卵前卵母细胞的生长和成熟及支持排卵后卵母细胞功能的作用.本文主要对卵丘细胞的功能及在卵母细胞发育过程中的作用进行论述.
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小鼠卵母细胞体外成熟过程中卵丘细胞上细胞周期蛋白D2的表达
目的 检测在小鼠卵母细胞体外成熟过程中卵丘细胞(CCs)上细胞周期蛋白D2(CCND2)表达水平的变化,探讨其在卵母细胞成熟中的作用. 方法 从3周龄雌性ICR小鼠获取GV期卵丘-卵母细胞复合体(GV-COCs),体外培养至MⅡ期卵丘-卵母细胞复合体(MⅡ-COCs).收集对应的CCs,分成GV-CCs和MⅡ-CCs二组,实时定量逆转录聚合酶链反应和蛋白印迹方法检测CCND2 mRNA和蛋白水平的表达;激光共聚焦免疫荧光技术观察COCs成熟前后CCND2的亚细胞定位.结果 GV-CCs的CCND2 mRNA相对表达量(7.03±1.11),显著高于MⅡ-CCs组(1.40±0.11)(P＜0.01);同样,GVCCs组CCND2蛋白相对表达水平(1.98±0.16)也显著高于MⅡ-CCs组(1.16±0.14)(P＜0.01).免疫荧光显示,COCs中CCND2定位于CCs,卵母细胞亦有表达;CCs中CCND2主要定位于胞核,胞质中少量表达,且GV-CCs主要表达在内层CCs,而MⅡ-CCs则失去这种表达极性,同时MⅡ-CCs的表达强度较GV CCs减弱. 结论 卵母细胞体外成熟培养过程中,其周围的CCs上CCND2表达水平下降,且伴随细胞定位的改变,提示CCs上CCND2与卵母细胞成熟密切相关,可能参与了卵母细胞成熟过程.
关键词： 卵丘细胞 细胞周期蛋白D2 卵丘-卵母细胞复合体 卵母细胞体外成熟 细胞增殖 -
卵丘细胞上AIFM2和FDX1的表达及其与小鼠卵母细胞成熟的关系
目的 检测小鼠卵母细胞体外、体内成熟过程中卵丘细胞(CCs)上线粒体相关凋亡因子2(AIFM2)和铁氧化还原蛋白1(FDX1)的表达,探讨其在卵母细胞成熟中的作用. 方法 从3周龄ICR雌性小鼠获取体内成熟卵丘-卵母细胞复合体(IVV-COCs)以及GV期卵丘-卵母细胞复合体(GV-COCs),并将GV期体外培养至MⅡ期卵丘-卵母细胞复合体(IVM-COCs).收集对应的CCs,分成GV-CCs、IVM-CCs和IVV-CCs 3组.实时定量逆转录聚合酶链反应检测AIFM2和FDX1 mRNA水平的表达,以GAPDH为参照;激光共聚焦免疫荧光技术观察COCs的AIFM2和FDX1的亚细胞定位. 结果 IVM-CCs和IVV-CCs的AIFM2 mRNA相对表达量[分别为(0.72±0.01)和(0.67±0.02)]显著高于GV-CCs组[(0.10±0.06)](P<0.01);同样,IVM-CCs和IVV-CCs的FDX1 mRNA相对表达量[分别为(1.58±0.35)和(1.82±0.34)]也显著高于GV-CCs组[(0.10±0.03)](P<0.01);而IVM-CCs和IVV-CCs的AIFM2和FDX1表达水平均无显著性差异(P>0.05).免疫荧光显示,AIFM2和FDX1主要定位于CCs胞质中,在GV-COCs中各层均有表达,且GV期卵母细胞中也有表达;IVM-COCs和IVV-COCs中表达阳性的细胞数目较GV期增加. 结论 卵母细胞成熟后,其CCs上AIFM2和FDX1的表达升高,表明AIFM2和FDX1参与了卵母细胞成熟过程,有望作为预测卵母细胞成熟的生物标记物.
关键词： 卵丘细胞 AIFM2 FDX1 卵丘-卵母细胞复合体 线粒体代谢 -
昆明鼠自体卵丘细胞与早期胚胎序贯共培养对胚胎体外发育潜能的影响
目的:评价昆明鼠胚胎与自体卵丘细胞序贯共培养对提高早期胚胎体外发育潜能的影响.方法:分两组进行实验,序贯共培养组使用分离培养的卵丘细胞与序贯培养液构建培养体系,与昆明鼠早期胚胎进行共培养;序贯培养组使用序贯培养液对早期胚胎进行序贯培养,观察两组胚胎各阶段囊胚形成率,检测囊胚总细胞数、囊胚细胞凋亡数,囊胚进一步培养获得的干细胞系数.结果:序贯共培养3d后总的囊胚形成率为68.13%,序贯培养组囊胚形成率为45.31%(P<0.05);囊胚总细胞数分别为76.52和38.57(P<0.05),细胞凋亡率分别为7.44%和16.28%(P<0.05).将囊胚进一步培养,共培养组干细胞建系率为12.50%,序贯培养组未能建系.结论:昆明鼠胚胎与自体卵丘细胞序贯共培养与序贯培养比较,前者能更好地模拟体内环境,提高早期胚胎体外发育潜能.
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小鼠成熟卵子重构及胚胎发育
目的使用小鼠的卵丘细胞为供核,去核的成熟卵浆为受体进行卵子重构,观察受精、胚胎发育情况.方法昆明小鼠超排卵后获取生殖泡期卵子,进行体外成熟.成熟卵子去核后将卵丘细胞核与精子直接注入,观察其受精和胚胎发育情况.结果卵子去核存活率为69.2%(258/373),注核存活率为44.1%(112/254).20.9%(19/91)重构卵子排出1个极体并形成两原核,卵裂率为78.9%(15/19).15个重构卵子于D2分裂至2～3个细胞后阻滞,无囊胚形成.结论将小鼠的卵丘细胞核移植到成熟的去核卵浆中,同时注射精子进行激活,可以形成重构卵子并受精,但出现2细胞阻滞,发育潜能较差.
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卵丘细胞凋亡对体外培养卵母细胞发育潜能的影响
目的 研究体外培养中卵丘细胞凋亡对卵母细胞结构的影响,探讨体外受精中可用卵丘细胞凋亡率预测卵母细胞发育潜能的原因.方法 对GV期人卵丘-卵母细胞复合体进行体外成熟培养,用HE染色、DAPI染色和原位末端标记(TUNEL)法标记3种方法对单卵卵丘细胞凋亡率进行检测.分为凋亡率高和低的2组,用光镜和透射电镜观察卵母细胞的结构.对MⅡ期卵母细胞进行体外受精,培养2d后在光镜下评价胚胎质量.结果 卵丘细胞凋亡率低的卵母细胞结构和发育潜能良好;卵丘细胞凋亡率高的卵母细胞发育潜能差,存在各种结构异常,包括围卵周隙不均,对应不同部位的细胞质发育不同步;细胞质中出现堆积不均的细胞器团、次级溶酶体、及可能由溶酶体降解造成的大量空隙;线粒体外膜和嵴模糊、膨大,呈现凋亡迹象;第一极体碎裂;透明带异常增厚或变薄.相应的卵丘细胞微绒毛和细胞连接减少.结论 揭示了卵丘细胞凋亡对卵母细胞结构的影响,揭示了卵丘细胞凋亡率影响卵母细胞发育潜能的原因.
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精子顶体反应及其临床应用价值的研究进展
哺乳动物的顶体是一个膜包裹的溶酶体样细胞器，位于精子核膜与质膜之间，是一个膜结合的帽状结构，其内含多种酶。顶体反应（ acrosome reaction ，AR）是精子与卵透明带（ zona pellu-cida，ZP）结合之后，精子的顶体破裂，释放一系列的顶体酶的过程。受精是精子与卵子融合，精子将所携带的单倍体遗传物质与卵子的单倍体遗传物质相融合形成双倍体合子的过程［1］。这是一个非常复杂和严格有序的生理过程，不同种类的动物，其受精方式及过程有所不同。人类受精过程包括：（1）精子获能；（2）精子与卵丘细胞之间的相互作用；（3）精子活动力的改变如超活化；（4）精子与透明带结合、透明带诱发精子顶体反应；（5）精子顶体酶激活；（6）精子穿入透明带；（7）精卵质膜融合；（8）卵子激活；（9）精子染色质解凝；（10）精卵核融合［2］。 AR发生的主要部位是卵丘颗粒细胞间隙及透明带，顶体反应通常是在卵丘细胞团的间隙中启动，在精子穿入ZP时，AR发生的程度更大，速度更快，能使卵子受精的精子，很可能是在卵丘细胞间隙就发生AR的精子［3］。
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多囊卵巢综合征患者卵丘形态与未成熟卵母细胞发育潜能关系
目的 研究多囊卵巢综合征患者无刺激周期取出的不同形态未成熟卵母细胞的发育潜能.方法 43例PCOS不孕患者进行了47个未成熟卵母细胞体外成熟培养(IVM)周期.所有患者均未经促卵泡素刺激,予以HCG 36 h后取卵.根据取出的卵-冠-丘复合物形态将其分为3组:卵丘紧密组、卵丘松散组、无卵丘组.比较3组的体外成熟率、受精率和优质胚胎率.结果 47个IVM周期共收集未成熟卵母细胞874枚,体外成熟率61.19%,受精率71.07%,着床率13.13%.卵丘松散组的体外成熟率明显高于卵丘紧密组(72.26% vs 49.54%, P<0.05),受精率、优质胚胎率三组间无差异.结论 PCOS患者无刺激周期取出的未成熟卵母细胞中,卵丘松散、扩张的卵母细胞具有更好的体外成熟潜力.
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卵丘细胞对成熟卵母细胞玻璃化冷冻保存及临床妊娠结局的影响
随着体外受精-胚胎移植等辅助生殖技术的发展,低温保存技术的作用越来越重要.由于卵母细胞本身所特有的一些生物学特性,使其冷冻效果尚不能像胚胎冷冻一样大规模地用于临床.影响卵母细胞冻存的因素很多,卵丘细胞的存在能否有效改善卵母细胞冷冻保存效果,各研究结果存在较大差异[1-3].本研究回顾性分析保留卵丘细胞对成熟卵母细胞玻璃化冷冻保存、胚胎发育及临床妊娠结局的影响,现将结果报道如下.
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卵丘细胞线粒体移植对年老小鼠早期胚胎发育的影响
目的 探讨线粒体对早期胚胎发育的影响.方法 采用昆明小鼠为动物模型,以其卵丘颗粒细胞、卵母细胞、受精卵为试验材料,提取年老小鼠卵丘细胞线粒体,将其注入年老小鼠卵母细胞和体内冲出的受精卵中.结果 与结论 通过卵丘细胞线粒体移植,给卵子补充了一定量的线粒体,可以部分弥补卵母细胞因变异引起的功能不足.为第2次减数分裂、受精卵和胚胎发育提供足够的能量,明显改善了胚胎的质量.
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卵丘细胞在未成熟卵母细胞玻璃化冷冻保存中的作用
卵母细胞冷冻技术是生殖医学的一大热点,未成熟卵母细胞冻存是保存女性生育力的重要方法,具有广阔的临床应用前景.卵丘细胞与卵母细胞共处同一微环境,二者通过缝隙连接进行复杂的双相调控和物质交换,目前已知卵丘细胞在人类未成熟卵母细胞体外成熟过程中具有重要作用,但在冷冻过程中的作用尚无定论.随着玻璃化冷冻技术的发展,卵丘细胞对未成熟卵母细胞冷冻的影响有了较多的研究,卵丘细胞可减缓冷冻剂渗透速率,从而避免细胞渗透压的突变对未成熟卵母细胞的损伤,提高细胞冻融后存活率和受精率并支持未成熟卵母细胞的体外成熟.就卵丘细胞在人类未成熟卵母细胞玻璃化冷冻保存中的作用进行综述,为癌症化疗、延迟生育年龄等需进行的未成熟卵母细胞冷冻提供重要的理论基础及可靠的实验依据.
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前列腺素E2及其受体在卵泡发育中的作用
前列腺素E2（PGE2）作为传递黄体生成激素（LH）信号的关键旁分泌因子，主要由颗粒细胞合成，其分泌至胞外后结合至卵丘细胞上的前列腺素E2受体2和前列腺素E2受体4（PTGER2、PTGER4），这两种受体都通过活化胞内偶联的Gas蛋白，进而激活腺苷酸环化酶，增加胞内环磷酸腺苷（cAMP）含量并促进透明质酸合酶2（HAS2）和肿瘤坏死因子α介导蛋白6的合成，引起卵丘细胞扩展。此外PGE2还通过调控颗粒细胞芳香酶（CYP19）和孕酮表达，从而在排卵后调节黄体的功能。PGE2的调控异常与多种生殖相关疾病有关，如未破裂卵泡黄素化综合征（LUFS）和受精障碍等。
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人卵丘细胞内基因表达与胚胎发育潜能的关系
缺乏准确、客观、非侵入性的胚胎评估标准是目前体外受精-胚胎移植技术所面临的主要挑战之一。本文对卵丘细胞内基因表达与胚胎及卵子发育潜能之间的相关研究进行了总结，发现卵丘细胞内特定基因的表达与胚胎发育、成熟及发育潜能之间存在紧密的联系。近年来，通过实时定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）及微阵列技术筛选出一系列颗粒细胞中能够预测受精结局、胚胎形态学评分、妊娠结局等胚胎发育潜能的候选标记基因，这些基因主要涉及卵丘扩展、脂类代谢、细胞凋亡等过程。然而，卵母细胞及胚胎的发育受卵泡内、外多种因素的影响。欲确立一种全面、准确、非侵入性的胚胎发育潜能评估方法仍需更深入的研究。
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颗粒细胞与卵母细胞关系研究进展
颗粒细胞与卵母细胞共处于同一个微环境中，颗粒细胞通过复杂的缝隙连接与卵母细胞进行细胞之间的“对话”，并调控卵母细胞的生长与成熟。卵母细胞成熟后发生排卵，卵丘细胞通过自身及分泌作用影响着精卵结合及雄原核的形成。在哺乳动物的研究中发现，卵丘细胞与胚胎共培养能够克服发育阻滞，并对胚胎的发育起很好的支持作用。随着人类辅助生殖技术的发展，学者们越来越重视在基因及转录水平上对卵丘细胞的检测，从而对卵子及胚胎质量进行预测。综述颗粒细胞在卵子生长与成熟、受精及胚胎发育等方面的作用。
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表皮生长因子卵丘细胞对卵母细胞体外成熟的影响
目的探讨表皮生长因子(EGF)、卵丘细胞对人类生殖泡(germinal vesicle,GV)期不成熟卵母细胞体外成熟的影响.方法将EGF和促性腺激素(gonadotropin,Gn)联合应用于不成熟卵母细胞的体外培养,并同单纯应用Gn相对照观察EGF的影响;同时将卵母细胞分为卵丘卵母细胞复合物(CEO组)及裸卵(DO组)进行培养,了解卵丘细胞在体外培养中的作用.结果EGF可以提高DO组的MII期率(P＜0.01);对于CEO组应用EGF后可以促进胞质的成熟,提高受精能力(P＜0.05).关于卵丘细胞的作用,CEO组的MII期率为68.8%,明显高于DO组的46.7%(P＜0.01);CEO组的卵裂率为72.7%,高于DO组的35.7%(P＜0.05).结论EGF可以直接促进不成熟裸卵体外成熟,提高其MII期率;与Gn联合应用后可进一步促进卵丘卵母细胞复合物胞质的成熟,提高受精率.保留卵丘细胞利于卵母细胞胞质的发育,提高不成熟卵母细胞的体外成熟能力,使MII期率、卵裂率升高.
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人卵丘细胞GREM1基因表达与卵母细胞发育潜能关系研究
目的 探讨辅助生殖技术中人卵丘细胞GREM1基因表达水平与卵母细胞发育潜能的关系.方法 回顾性分析福建泉州市妇幼保健生殖医学中心2012年3月至2014年3月接受卵胞浆内单精子显微注射-胚胎移植(ICSI-ET)治疗的男方因素不孕妇女42例的160个卵母细胞,以形态学评分标准将正常受精的胚胎分为优质胚胎30个和非优质胚胎70个,移植后剩余胚胎冷冻保存或囊胚培养.根据卵母细胞成熟与否、D3胚胎质量及D5/D6囊胚培养情况,实时荧光PT-PCR分别检测其卵丘细胞中GREMl表达水平的差异.结果 成熟卵母细胞的卵丘细胞GREMl表达水平比不成熟卵母细胞高(1.9739±0.5114 vs.J.5105±0.2629,P＜0.001),同样在D3优质胚胎中,检测其卵丘细胞GREMl表达水平比非优质胚胎中的高(2.2693±0.4193 vs.1.9263±0.4912,P＜0.05);进一步的囊胚培养发现,D5/D6囊胚培养成功的卵丘细胞GREM1表达水平比失败纽的明显升高(2.3874±0.2999 vs.1.5943±0.2078,P＜0.001)结论 卵丘细胞GREM1表达水平与卵母细胞成熟及胚胎质量有关,成熟的卵母细胞与后期形成的胚胎质量密切相关,检测卵丘细胞GREM1表达可预测胚胎发育潜能.
