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骨髓间充质干细胞及其来源的微泡在慢性肾衰竭中的修复机制
目的:探讨骨髓间充质干细胞及其来源的微泡制备方法及在慢性肾衰竭中的修复机制,为慢性肾衰竭治疗提供方法.方法:①骨髓间充质干细胞制备.选择2只SD大鼠,取大鼠胫骨、股骨髓,利用密度梯度离心法完成单一核细胞分离,采用贴壁方法完成细胞的培养,采用流式细胞仪制备细胞表面特异性抗原,完成细胞的鉴定.②慢性肾衰竭模型制备及处理方法.选择2015年5月～2016年3月医院实验室进行试验的SD大鼠40只,取10只大鼠设为空白对照组,30只大鼠采用肾切除六分之五合并高盐饮食三个月方法建立大鼠慢性肾衰竭模型,随机数字法分为阳性对照组(n=10)、干细胞组(n=10)及微泡干预组(n=10).阳性对照组建模成功后不采取任何措施处理,干细胞组建模成功后采用移植制备的骨髓间充质干细胞进行治疗,微泡干预组移植骨髓间充质干细胞后采用超声微泡辐照,比较不同组大鼠慢性肾衰竭修复效果.结果:①细胞换液一次细胞纯化呈梭状、纺锤状,以旋涡方式生长,细胞贴壁后生长迅速,细胞传代一次需要3 d,经过三代培养后细胞数量相对较多;②流式细胞仪测定结果表明:对照组细胞表面CD29几乎不表达,而MSC细胞表面CD29阳性率为91.54％,符合骨髓间充质细胞表面特征;③Western blot法结果表明:HGF蛋白在4组相对分子量为82000部位存在特异性条带,而EGF蛋白则在4组相对分子量为5500部位存在特异性条带;④微泡干预组TNF-α水平低于干细胞组与阳性对照组(P<0.05),微泡干预组细胞黏附分子1水平高于干细胞组与阳性对照组(P<0.05);⑤阳性对照组建模后未经任何处理,肾脏损伤明显,存在大量炎性细胞;空白对照组未参与建模,肾脏组织完整,未见肾脏组织损伤,干细胞组修复30 d后肾脏损伤缓解,仍存在少许炎性细胞,微泡干预组修复后30 d肾脏组织损伤改善,未见炎性细胞.结论:采用全骨髓法能分离培养骨髓间充质干细胞,将频率为1 MHz、强度1.0 W/cm2脉冲超声辐照微泡用于慢性肾衰竭大鼠骨髓间充质干细胞修复中能抑制炎性反应.
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外周血促甲状腺激素受体mRNA水平在甲状腺癌早期诊断中的意义
1临床资料1.1一般资料选择2009-2011年本院甲状腺肿瘤手术患者126例(良性病变70例、分化型甲状腺癌56例)和非甲状腺疾病手术患者60例,上述患者诊断均经手术病理证实.手术前1d抽取患者静脉血5 mL,使用聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心法分离血浆,采用RT-PCR法检测外周血促甲状腺激素受体(thyroid stimulating hormone receptor,TSHR)mRNA表达情况.
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密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞方法的优化
目的:对密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞的方法进行优化,以提高该方法分离骨髓单个核细胞的收率.方法:骨髓血40份,100 ml/份,分为常规组和优化组,每组20份.常规组骨髓与NS 1:1混合稀释后,直接通过Ficoll分离液分离单个核细胞;优化组通过先将骨髓血洗涤一次,加入等量NS充分吹打混匀,200目筛网过滤,保持细胞悬液和Ficoll分离液1:1的体积比进行分离操作.对每份分离得到的骨髓单个核细胞通过白细胞稀释液稀释后计数,计算单个核细胞的回收率.结果:常规组,分离后的白膜层有12份界面不清晰,同时均混有少量的红细胞.优化组,分离后的白膜层有3份界面不清晰,仅有极少的红细胞混入.两种方法收集的骨髓单个核细胞数比较,优化组多于常规组(P﹤0.01).结论:通过对密度梯度离心法的步骤进行优化,可提高骨髓单个核细胞的分离效果.
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不同样品处理方法对T淋巴细胞亚群及功能分析的影响
目的 研究Ficoll-Hypaque密度梯度离心法、先裂解红细胞后标记抗体、先标记抗体后裂解红细胞3种不同处理方法对T淋巴细胞(T细胞)亚群及功能分析的影响.方法 采用3种方法制备样本后,采用流式细胞术检测T细胞表面分子及亚群比例,台盼蓝染色检测细胞存活率,Con A刺激检测细胞活性.结果 Ficoll-Hypaque密度梯度离心法与两种裂解红细胞法相比,T细胞亚群比例差异无统计学意义(P＞0.05),细胞存活率及细胞活性均较高(P＜0.05).两种裂解红细胞法处理样本结果无差异.结论 Ficoll-Hypaque密度梯度离心法适合研究工作,先标记抗体后裂解红细胞的方法更适合临床检验.
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Percoll非连续等密度梯度离心法纯化牛肾上腺嗜铬细胞
肾上腺髓质嗜铬细胞是具有合成、储存和分泌儿茶酚胺功能的神经元样细胞[1,2],对疼痛和帕金森病的治疗具有显著效果[3].但是,肾上腺髓质嗜铬细胞在体外无增殖能力,只能依赖于肾上腺髓质的分离来获取.牛的肾上腺髓质细胞(Bovine Chromaffin Cells, BCC)由于产量高,易分离获取而成为首选的细胞来源,同时建立一种能够满足临床移植需要的BCC分离纯化方法也显得十分重要.但目前通常采用的方法[4～7]很少考虑细胞的产率、纯度及工艺成本.为此,本文建立了一种稳定、经济、简单的BCC分离纯化方法,为细胞临床移植提供充足、健康的细胞来源.
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蛔虫感染期幼虫的分离
长期以来,对人蛔虫感染期幼虫的分离和收集,主要是①采用盖玻片人工孵化法[1,2],②用玻璃匀浆器匀浆使幼虫孵化[3,4],③将感染期虫卵悬液加玻璃珠,用磁力搅拌器搅拌[1,2].前两种方法一次只能分离少量幼虫,操作步骤烦琐,费时;第③种方法虽能一次性分离出大量幼虫,但幼虫与卵壳较难分开.为了获取大量纯净的幼虫,我们在第③种方法的基础上,用淋巴细胞分离液通过密度梯度离心法将幼虫与卵壳分开,获得纯度较高的幼虫,操作简便易行.
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利用流式细胞术分离大鼠肝脏库普弗细胞
库普弗细胞是定居于肝脏的吞噬细胞,占机体单核-巨噬细胞系统的80%～90%,在免疫调节及肝移植后的免疫耐受诱导中占有重要地位[1].为在体外有效地探讨库普弗细胞的作用,目前已建立多种分离纯化库普弗细胞的方法,如酶消化法、Percoll密度梯度离心法、非实质细胞贴壁培养法及联合多种分离纯化法等[2,3],流式细胞术(flow cytometry)是一种快速分析大量特定材料的技术,当液体介质流经激光源时,可迅速、敏感、准确及高质量的分析细胞悬液中特定细胞群,成为研究细胞功能及纯化细胞群强有力的手段.本研究通过流式细胞术分离纯化大鼠肝脏库普弗细胞,建立一种简便、快速、敏感、高效的分离纯化库普弗细胞的新方法.
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人外周血淋巴细胞和粒细胞褪黑素受体亚型mt1的鉴定及生物学特征
目的:检测人外周血淋巴细胞和粒细胞是否存在褪黑素(Mel)受体亚型mt1,为进一步研究Mel对免疫系统的调节作用提供证据.方法:选择健康成年人,抽取外周血,应用密度梯度离心法分离淋巴细胞和粒细胞.采用免疫组织化学法、RT-PCR和基因序列法,检测其mt1蛋白及mRNA的表达.结果:(1)免疫组织化学染色结果显示,人外周血淋巴细胞和粒细胞均存在mt1受体蛋白,分布于细胞膜、细胞质和细胞核,以细胞膜和细胞质为主.(2)RT-PCR产物电泳均出现阳性条带,大小均相当于370核苷酸左右,经测序证实与GenBank的人mt1受体亚型的基因序列相吻合.结论:人外周血淋巴细胞和粒细胞中均存在mt1受体蛋白及mRNA的表达,提示Mel对外周血淋巴细胞和粒细胞有直接作用.
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不孕症患者宫腔内人工授精精子优选方法分析
目的:比较分析精子不同优选方法与官腔内人工授精(IUI)成功率的相关性,以提高IUI妊娠率.方法:回顾性分析本院生殖中心门诊不孕症患者452例671个IUI周期,按精子优选方法分为3组:含5%人血清白蛋白(HSA)的Earle's液上游法、SpermRinse上游法、SupraSperm密度梯度离心法.比较各组患者的处理前后精子密度与活动率及临床妊娠结局.结果:3种精子优选方法处理后精子活动率及a+b级精子百分率显著增加(P＜0.01).含5%HSA的Earle's液上游法221个IUI周期,妊娠21个周期,周期临床妊娠率9.5%;SpermRinse上游法215个IUI周期,妊娠34个周期,周期临床妊娠率15.8%,与含5%HSA的Earle's液上游法比较有显著性差异(P＜0.05);SupraSperm密度梯度离心法235个IUI周期,妊娠34个周期,周期临床妊娠率14.5%,与含5%HSA的Earle's液上游法比较无统计学差异(P＞0.05).结论:SpermRinse上游法的IUI临床妊娠率明显高于含5%HSA的Earleg液上游法,适用于各类不孕症患者.SupraSperm密度梯度离心法也具有较高的周期临床妊娠率,洗涤效果好,操作便捷高效,尤其适用于含炎症细胞、死精子和畸形精子等不良成分较多的精液.
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两种精子处理方法的卵细胞胞质内单精子显微注射结局的比较
目的:评价密度梯度离心和改良上游法两种处理活动精子的分离方法在卵细胞胞质内单精子显微注射(ICSI)中的效果,从而指导临床应用. 方法:选取2004年10月～2005年4月在本中心完成的42例患者42个周期为研究对象,前瞻性比较了两种精子分离方法的受精率、卵裂率、优质胚胎率、临床妊娠率、精子畸形率、精子回吸收率等. 结果:两种方法分离精子所获得的ICSI胚胎移植(ICSI-ET)中,受精率、卵裂率、优胚率、临床妊娠率均无明显差异,但是改良上游法所获得的精子畸形率明显高于密度梯度离心法(P《0.01);重度少精子症密度梯度离心法回吸收精子优于改良上游法(P《0.01). 结论:在辅助生育技术ICSI-ET中,密度梯度离心法分离活动精子临床妊娠结局与改良上游法无明显差异;除对重度少精子症者外,均可以采用改良上游法.
关键词： 精子 改良上游法 密度梯度离心法 细胞胞质内单精子显微注射 胚胎移植 -
系统性硬化病患者外周血CD4+T细胞CD40L DNA甲基化研究
[目的]探讨系统性硬化病(SSc)患者外周血CD4+T细胞中CD40L基因调控序列的甲基化状态.[方法]密度梯度离心法分离SSc患者(女16例,男10例)和健康对照组(女15例,男10例)外周血单一核细胞,磁珠分选CD4+T细胞,提取DNA,亚硫酸氢钠处理DNA,巢式PCR扩增CD40L基因调控序列片段(包括启动子和增强子),转化进入大肠杆菌,每个样本挑取8个克隆进行测序.[结果]亚硫酸盐基因组测序结果显示,健康女性CD40L基因调控序列一半为甲基化,一半为去甲基化,女性SSc患者CD40L基因启动子和增强子区域平均甲基化水平均显著低于女性健康对照(P值均＜ 0.01)；男性SSc患者和男性健康对照CD40L基因启动子和增强子区域几乎全部为去甲基化,两组平均甲基化水平差异无统计学意义(P值均＞0.05).[结论]女性SSc患者CD4+T细胞中失活的X染色体上CD40L调控序列低甲基化,可能是导致CD40L在女性SSc患者CD4+T细胞中过度表达的原因之一.
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小鼠原代胸腺上皮细胞分离方法的比较与优化
目的 比较几种小鼠原代胸腺上皮细胞(TEC)分离方法的效果,筛选简单、高效、实用的分离方法.方法 将小鼠胸腺组织根据所用的消化分离方法分为以下几组:胶原酶Ⅰ组 (Collagenase Ⅰ, Col IE组, 1 mg/ml)、DispaseⅡ组 (DisⅡ组, 3 mg/ml)、Col IE+低浓度DisⅡ组 (Col IE/Dis Ⅱ-L组, 0.75 mg/ml)、Col IE+中浓度DisⅡ组 (Col IE/Dis Ⅱ-M组, 1.5 mg/ml)、Col IE+高浓度DisⅡ组(Col IE/DisⅡ-H组, 3 mg/ml).优选出适消化方法后,将所得单细胞悬液分成Percoll实验组以及Percoll对照组.采用血细胞计数板进行总细胞数计数,台盼蓝染色法观察细胞的活性;使用流式细胞术检测胸腺基质细胞(TSC)以及TEC的比例.结果 与单独使用DisⅡ与Col IE相比,Col IE与不同浓度Dis Ⅱ联合使用均能加快胸腺组织消化(P<0.01),获取单个胸腺的总细胞数较多,尤以中、高浓度DisⅡ与Col IE联合消化效果更佳(P<0.05或P<0.01).与单独使用酶消化组相比,Col IE与中、高浓度DisI联合消化均可不同程度地增加获取TSC和TEC的比例(P<0.01).与Percoll对照组相比,Percoll密度梯度离心进一步提高获取TSC和TEC的比例(P<0.05).此外,各种消化分离方法均可获得高活细胞率的细胞.结论 Col IE与DisⅡ联合消化,结合Percoll密度梯度离心可获取数量多、活性高的小鼠原代TEC.
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大鼠骨髓基质细胞的培养
目的：探讨骨髓基质细胞的分离、体外培养方法，观察骨髓基质细胞的形态。方法：从SD大鼠中分离骨髓基质细胞，采用密度梯度离心法结合贴壁筛选法将分离的骨髓基质细胞体外扩增，倒置显微镜下观察细胞形态学特征。结果：倒置相差显微镜观察发现，接种后24 h内细胞开始贴壁，贴壁细胞呈梭形或扁平形。48 h后贴壁细胞沿培养瓶壁伸展开，圆形，折光性强，细胞壁完整，胞核隐约可见，胞质丰富。传至第5代MSCs纯度高，增殖能力旺盛，呈梭形或纺锤形的细胞，呈漩涡状、菊花状排列生长。结论：骨髓基质细胞可通过体外培养纯化获得，传至第5代的骨髓基质细胞纯度高，密度梯度离心法结合贴壁筛选法可作为是一种较理想的骨髓基质细胞培养方法。
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自体骨髓干细胞移植治疗急性心肌梗死三例
例1,男性,60岁.因反复发作活动后胸骨后疼痛3年,加重3 h于2003年8月18日入院.查体:P 70次/分,BP110/70mmHg,颈静脉不充盈,双肺呼吸音清,心界向左下扩大,心率70次/分,律齐,心音S1低钝,心尖部闻及2/6级吹风样SM,双下肢无水肿.心电图Ⅱ、Ⅲ、aVF导联ST水平型或下斜型压低0.2～0.4 mV.血CK-MB106 U/L.诊断:急性下壁非Q波心肌梗死.予常规药物治疗.第7d用超声心动图评估患者左室收缩功能(国际通用16节段半定量法),左室壁节段运动指数(WMSI=各节段积分之和)总积分11.髂骨抽取骨髓约50 ml,密度梯度离心法提取骨髓基质细胞(MSC).行冠脉造影示右冠两处病变(近中段80%狭窄、后降支90%狭窄),送入球囊导管,准确定位于右冠近中段狭窄处,予球囊扩张,同时经球囊导管高压注入8 ml细胞悬液.术后6周复查心电图显示Ⅱ、Ⅲ、aVF导联压低的ST恢复至基线水平,超声心动图测定WMSI为9.
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直接贴壁法体外分离培养大鼠骨髓内皮祖细胞
取90 g SPF级SD大鼠的双后肢骨髓，分别使用直接贴壁法和密度梯度离心法获得大鼠骨髓单个核细胞，用内皮培养体系EGM-2培养基进行定向诱导分化7~14 d获得大鼠内皮祖细胞。免疫荧光染色和细胞功能学鉴定内皮祖细胞，观察内皮祖细胞出现的时间和数量， CCK-8法鉴定细胞的增殖能力。与密度梯度离心法相比，直接贴壁法在内皮祖细胞出现的时间、数量和增殖能力差异有统计学意义(P<0．01)。因此，相对于密度梯度离心法，直接贴壁法培养出的内皮祖细胞分化时间更短、数量更多且增殖能力更强。
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两种精液优化法在宫腔内人工授精中的应用效果分析
目的 探讨密度梯度离心法与直接上游法两种方法优化处理精液行宫腔内人工授精(IUI)对精子动态参数和10.妊娠率的影响.方法 根据精液检查结果将IUI妇女分为2组,A组:采用直接上游法；B组:采用密度梯度离心法,优化处理精渡后行IUI.比较两种方法处理后的糟子检测结果与妊娠结局.结果 两种方法处理前、后精子密度、活率、活力(a+b)、前向运动精子总数(rMs)的差异具有统计学意义(P＜0.05)；两种方法处理后,各项指标的差异无统计学意义(P>0.05),两组间临床妊娠率的差异也无统计学意义(P＞o.05).结论 两种方法处理精液均可改善精子动态参数,但行IUI后临床妊娠率差异无统计学意义(P>0.05).
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外周血β－HCG mRNA 表达与妊娠滋养细胞肿瘤血行转移的相关研究
目的：研究妊娠滋养细胞肿瘤患者外周血β－HCG mRNA 表达情况，评价其表达与不同临床指标的关系。方法收集28例妊娠滋养细胞肿瘤、15例葡萄胎、10例正常妊娠妇女和10例非妊娠妇女外周血。运用外周血密度梯度离心法提取单个核细胞和滋养细胞后采用 RT－PCR 方法检测四者β－HCG mRNA 表达水平，并与妊娠滋养细胞肿瘤临床指标做相关分析。结果10例非妊娠妇女外周血β－HCG mRNA 表达均阴性，10例正常妊娠妇女外周血中3例见β－HCG mRNA 扩增条带，15例葡萄胎患者外周血中8例见β－HCG mRNA 扩增条带，28例妊娠滋养细胞肿瘤患者外周血中24例见β－HCG mRNA 扩增条带，正常妊娠妇女β－HCG mRNA 表达水平低于葡萄胎、妊娠滋养细胞肿瘤患者（P ＜0．05）。妊娠滋养细胞肿瘤患者外周血β－HCG mRNA 表达与治疗前血β－HCG 水平、肺转移及临床分期有关（P ＜0．05）。28例随访病例中只有1例进展，无复发病例。结论外周血中单个核细胞不表达β－HCG mRNA。正常妊娠、葡萄胎及妊娠滋养细胞肿瘤均有滋养细胞脱落入血。外周血滋养细胞β－HCG mRNA 可能成为评估妊娠滋养细胞肿瘤早期血行转移的有效指标。
关键词： 妊娠滋养细胞肿瘤 β-HCG 密度梯度离心法 逆转录-聚合酶链反应 -
密度梯度离心法优选精液22周期宫腔内人工授精的临床分析
目的 探讨密度梯度离心法优选精液行IUI的临床疗效.方法 采用密度梯度离心法制备精液行IUI 22个周期,并对制备前后的精液进行常规分析、改良巴氏染色、混合抗球蛋白反应实验.结果 洗涤后的精子,其密度、活力、精子正常形态比率明显升高,精子畸形指数及精子包被抗体阳性率明显下降.结论 密度梯度离心法优选精液行IUI可增加受孕机率.
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大鼠肝内淋巴细胞的分离与培养
目的 建立一种简单易行的大鼠肝内原代淋巴细胞分离与培养方法,为肝脏免疫学研究提供可靠的体外细胞模型.方法 采用原位灌注及密度梯度离心法分离培养,即在无菌条件下取大鼠正常肝脏组织,研磨后,利用离心法及淋巴细胞分离液进行纯化,通过倒置生物显微镜对所培养细胞进行形态学观察,并结合流式细胞术来鉴定大鼠T淋巴细胞.结果 通过倒置生物显微镜观察到细胞呈典型的淋巴细胞形态,流式细胞术分析显示,T细胞比例为51.2％.结论 本实验利用原位灌注及密度梯度离心法相结合的方式,成功分离和培养了大鼠肝内淋巴细胞,操作简单,重复性好,成功率高,为进一步开展肝脏的免疫学研究提供了非常好的体外细胞模型.
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改良法分离培养兔骨髓源性早晚期内皮祖细胞
目的 探索简单有效分离培养兔骨髓源性内皮祖细胞的方法,并比较两种内皮祖细胞生物学性状.方法 4周龄左右的新西兰兔,于每侧胫骨取骨髓2mL,密度梯度离心后取单个核细胞接种于培养瓶,48h后将悬浮的细胞收集再次贴壁,血管内皮生长因子诱导其向内皮祖细胞分化.免疫细胞化学鉴定其表面标志物、免疫荧光功能学测定,对比前后两种贴壁细胞生长状况.结果 早期获取的单个核细胞,半小时后就开始贴壁,3天左右即可长出长梭形的细胞,胞体较大,有血岛样克隆形成,随后培养可形成管腔样结构,10天左右即可呈漩涡状融合整个培养瓶,但这种细胞传代能力差,为早期内皮祖细胞;第2次贴壁的晚期细胞于贴壁后呈椭圆形生长,贴壁后5-7天即可出现集落,片状生长,后呈铺路石样融合,并可连续传至10代以上,为晚期内皮祖细胞.第2次贴壁的内皮祖细胞在分化过程中明显失去CD133+,而CD34+表达有所升高,大部分第1次贴壁内皮祖细胞可以吞噬乙酰化低密度脂蛋白和荆豆凝集素1,第2次贴壁内皮祖细胞功能学鉴定结果与第1次贴壁的结果类似.结论 改良后的密度梯度离心法结合差速贴壁法能有效分离培养兔骨髓源性内皮祖细胞,第2次贴壁的内皮祖细胞生长能力更强.
