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尿 exosomes 的分离方法及在临床中应用研究进展
尿 exosomes 是肾和泌尿生殖系统上皮细胞分泌至尿中直径为40~100 nm 的脂质双分子层结构圆形膜性小囊泡,能够反映分泌细胞的生理和功能状态,exosomes 中蛋白质及 RNA 等分子可作为疾病标记物用于疾病诊断。尿液标本易得且无创,其 exosomes 中蛋白质及 RNA 较尿液中可溶性蛋白质和 RNA 稳定,在各种疾病的诊断中具有广泛的应用前景。本文就近年来尿 exosomes分离纯化方法及其作为蛋白或 RNA 标记物应用于各种疾病诊断的研究进展作一综述。
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固相载体法提取胰腺癌患者血清循环DNA的研究
近年研究发现,肿瘤患者血清或血浆中存在较高水平的肿瘤源性DNA(亦称循环DNA),正常人血清或血浆中的含量甚微(<10ng),因而对其遗传学改变进行检测,对肿瘤的诊断、鉴别和治疗预后等具有重要意义[1].然而,血清中含有的大量蛋白质、糖类、脂质等均可影响微量循环DNA的提取,而分离纯化则是准确检测的关键步骤.本研究采用全血基因组DNA提取的异硫氰酸胍-硅胶法[2]与高灵敏度的SYBR GreenⅠ染色技术,建立了一种可提取血清或血浆DNA的固相载体法,并用于胰腺癌患者血清循环DNA检测.
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硫酸铵反抽提法在纯化β内酰胺酶中的应用
硫酸铵价廉,不易导致蛋白质变性,常用于蛋白的分离和纯化.但硫酸铵抽提的分离纯化作用较弱,主要用于蛋白的浓缩.硫酸铵反抽提是根据在硫酸铵溶液中析出的蛋白质再次溶解有较高的选择性原理而建立的纯化方法.本研究采用配对设计对硫酸铵反抽提和抽提两法在纯化超广谱β内酰胺酶(ESBL)中的作用进行了比较,旨在为临床检验科室纯化ESBL提供简便易行的方法.
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载脂蛋白A和B的结构功能与测定方法及其标准化
自1968年shore和Shore[1]用聚丙烯酰胺琼脂凝胶电泳法(polyacrylamide gel electrophoresis)从人高密度脂蛋白(HDL)中分离纯化得到载脂蛋白(apoliprotein/apoprotein,Apo)以来,随着对Apo的生理、生化、病理及分子生物学研究的迅速发展与深入,Apo的基础与临床研究在脂类学(lipidology)中占有很重要的地位.
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胃癌干细胞的研究进展
胃癌是消化系常见的恶性肿瘤之一,病死率居高不下,严重影响人们健康,其发病机制目前仍不清楚.随着对肿瘤与干细胞之间关系的研究,提出了肿瘤干细胞理论,认为肿瘤干细胞是具有正常干细胞特性的恶性细胞,可能是由正常干细胞突变而来.目前已在多种实体肿瘤中鉴定出肿瘤千细胞.近来研究表明胃癌发生部位与胃干细胞定居部位一致,提示胃癌可能是一种干细胞疾病,本文就胃癌干细胞的存在、来源、鉴定及其分离方法等进行综述.
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奥曲肽、乌司他丁联合治疗急性胰腺炎
奥曲肽(善宁)是一种8肽生长抑素类似物,研究表明善宁可诱导胰腺组织EGF表达,刺激胰腺细胞增生,并可诱导损伤的胰腺细胞凋亡,促进损伤胰腺细胞的修复[1,2].乌司他丁是从健康成年男性新鲜尿液中提取分离纯化的一种糖蛋白,对胰蛋白酶、α-糜蛋白酶、透明质酸酶等有抑制作用,另外还具有稳定溶酶体膜、抑制溶酶体酶的释放、清除氧自由基、抑制炎症介质的释放等作用[3].我院自2000年9月至2001年12月联合应用善宁及乌司他丁注射液治疗急性胰腺炎取得较肯定的疗效.
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心肌特异表达基因p93的激酶及丝氨酸结构域在大肠杆菌中的高效表达
目的在大肠杆菌中高水平表达并分离纯化心脏特异表达基因p93的激酶与丝氨酸结构域片段.方法利用DNA重组技术,构建C末端带有6×His标签的p93激酶与丝氨酸结构域(p93-C)片段的原核表达载体pET28a-p93-C.对诱导表达条件和包涵体洗涤条件优化后,用Ni2+金属螯合吸附层析柱纯化.结果成功构建了pET28a-p93-C原核表达载体,诱导后摇床转速在350r/min下表达量高,包涵体洗涤在超声条件下较好,分离纯化后从100ml菌液中可获得2.5mg蛋白.结论建立了高效稳定的p93-C原核表达体系以及较好的包涵体洗涤方法.
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成人胰岛分离纯化的初步研究
目的 初步研究成人胰岛的分离、纯化方法,为司种异体胰岛移植治疗1型糖尿病进行前期准备.方法 采用改良的Ricordi技术消化成人尸体胰腺,然后用连续性密度梯度离心法纯化胰岛.胰岛收获量以国际标准的胰岛当量(islet equivalent,IEQ)表示.结果 完成10例成人胰岛分离和纯化,其中5例完成了胰岛当量的统计,胰岛收获量为6367~108725IEQ/胰腺,平均为47678.8IEQ/胰腺,平均每克组织收获2055IEQ.结论 采用改进的人胰岛分离方法,可以获得较大产量的有活性的胰岛.
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一种改良的小鼠胰岛分离方法
目的 探讨一种简单快捷、廉价高效的小鼠胰岛分离与纯化方法.方法 采用自制的穿刺针由胆总管逆行穿刺并灌注胶原酶Ⅴ消化胰腺,使用仅一种密度梯度介质离心结合手工挑选的方法分离纯化6~8周龄雄性ICR小鼠胰岛.同时,以单纯手工挑选法纯化胰岛作为对照组.双硫腙染色鉴定获取胰岛纯度,吖啶橙/碘化丙啶染色鉴定胰岛活力.采用不同浓度葡萄糖(低糖2.8 mmol/L,高糖20.0 mmol/L)刺激的胰岛素释放实验检测胰岛功能.采用t检验比较两组间的差异.结果 采用自制穿刺针及密度梯度离心的新方法提取5只小鼠胰岛整体耗时152 min,而单纯手工挑选法则耗时347 min;新方法每只小鼠平均可得胰岛(95±8)个,略低于单纯手工挑选组的(124±10)个(t=4.027,P=0.016);但新方法所得胰岛纯度为92.6%±1.3%,显著高于单纯手工挑选法79.2%±5.5%(t=4.075,P=0.015).同时新方法所提取的胰岛活力与手工挑选法获得的胰岛的活力相当.新方法获得的胰岛在低糖和高糖刺激下上清中胰岛素分泌量分别为(66±13)和(256±46)μg/L(t=7.042,P=0.002),提示这种新方法获取的胰岛对糖的反应很灵敏.结论 采用自制的穿刺针及密度梯度离心的方法所得胰岛产量、纯度、活力及胰岛功能都相对良好,是一种简单快捷、廉价高效的小鼠胰岛分离方法.
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骨髓间充质干细胞移植修复心肌梗死的可行性研究
目的初步观察骨髓间充质干细胞(MSCs)移植后在大鼠心肌梗死周边区的定位、存活及分化情况.方法采用密度梯度离心法及贴壁分离法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞术鉴定细胞表面抗原,体外定向诱导分化为具有心肌特异性结构蛋白的心肌样细胞,同时进行形态学及免疫组化鉴定.
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exosome与肿瘤免疫治疗的研究进展
exosome是由细胞内多泡体(muhivesicularbody,MVB)与细胞膜融合后,释放到细胞外基质中的一种膜性囊泡,它可从一种细胞到达另一种细胞,在细胞问传递多种分子,具有与抗原提呈细胞(antigen presenting cell,APC)相似的功能,能诱发和增强机体的免疫反应.exosome由Johnstone等[1]初报道,他们在研究网织红细胞向成熟红细胞转变过程中,从体外培养羊网织红细胞的上清液中分离纯化了这种囊泡状沉淀物.后来,exosome又从其他类型的造血和非造血细胞的培养基中被分离出来,如肥大细胞[2]、血小板[3]以及多种肿瘤细胞[4-6].不同细胞来源的exosome所含的蛋白质不同,其生物学功能也有差异.
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胰岛移植的新进展
胰岛移植具有创伤小、风险低、可阻止或延缓慢性并发症、有望根治糖尿病等优点,但是胰岛的分离、纯化及移植技术含量高,导致胰岛的回收率仍然较低;另外,供体短缺、移植后移植物及其功能的维持、免疫排斥反应等限制了胰岛移植在临床的广泛应用.
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小鼠胚胎肝干细胞的分离和鉴定
肝干细胞在成体肝脏中分离难度较大,目前认为采用胎肝分离纯化是一较好途径,我们在Suzuki等[1]利用荧光活化细胞分类法获取肝干细胞的方法基础上予以适当改进,建立以下方法.
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乌司他丁研究进展
1909年,Beuer和Reich首次报道了尿液中存在蛋白酶抑制剂(ulinary trypsin inhibitor,UTI),现多称为乌司他丁(ulinastatin)],能有效抑制多种酶的活性。后来研究发现,在感染、肿瘤、妊娠、休克、手术,给予糖皮质激素等生物体受到刺激时,尿液中该物质活性升高,从而引起研究者的浓厚兴趣。现就乌司他丁在国内、国外的研究、应用进展作一简要介绍。 一、乌司他丁的生化与药效学作用 1.生化性质:乌司他丁是从男性尿中分离纯化的尿胰蛋白酶抑制剂,为糖蛋白,含有143个氨基酸,分子量约67000 Dal,是一种典型的Kuniz型的蛋白酶抑制剂,具有两个活性功能区。由于两个活性功能区均有很广的抑酶谱,且不完全重叠,能够同时抑制胰蛋白酶、磷脂酶A2、透明质酸酶、弹性蛋白酶等多种水解酶的活性;另外,乌司他丁分解形成的低分子量成分也具有很强的抑制水解酶的作用。
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重度哮喘患儿血浆内皮素水平变化及其临床意义探讨
内皮素(ET)是近年来从血管内皮细胞中分离纯化出的生物活性多肽,由21个氨基酸残基组成.现已证明,ET-1不仅存在于血管内皮细胞,而且气管、支气管黏膜、肺血管及肺泡上皮也含有ET.它不仅具有强烈的缩血管作用,而且是强烈的支气管收缩剂[1].近年来研究发现ET-1在肺内含量高,并与某些心肺疾病密切相关.本文测定了58例哮喘儿,24例正常儿ET-1水平并动态观察其变化,希冀从免疫学角度探讨ET-1在哮喘发病机制中的作用及临床意义.
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改良法体外培养大鼠成肌细胞的实验研究
目的:探索一种新型体外分离培养新生大鼠骨骼肌成肌细胞的途径.方法:取新生Wistar大鼠的四肢骨骼肌适量,采用混合酶一步消化分离获取成肌细胞,将差速贴壁法和胰酶消化法相结合进行纯化,观察分离纯化成肌细胞的形态学特点、生长状况,绘制细胞生长曲线,利用扫描电镜观察成肌细胞表面结构并进行结蛋白免疫细胞化学特异性鉴定.结果:采用改良方法分离成肌细胞产量高、耗时短;在培养过程中双重纯化获取的细胞生长状态良好,接种后3~5 d增殖达高峰;在扫描电镜下可观察到成肌细胞膜表面有微绒毛突起;体外培养的成肌细胞中94%的细胞胞质呈结蛋白抗体染色强阳性.结论:改良方法分离纯化大鼠骨骼肌成肌细胞效果理想,是成肌细胞体外培养的有效途径之一.
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民族药石柑子化学成分研究
目的 对民族药石柑子〔Pothos chinensis(Raf.)Merr.〕全草的化学成分进行系统研究.方法 利用硅胶柱色谱、Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱色谱、半制备HPLC、制备薄层色谱及重结晶等技术进行分离纯化.通过理化性质及1H NMR、13C NMR和MS等技术进行结构鉴定.结果 从石柑子全草中分离得到16个化合物,分别鉴定为:甘草素(1)、对羟基苯甲酸(2)、丁香酸(3)、E-4-羟基肉桂酸(4)、N-反式香豆酰酪胺(5)、N-反式桂皮酸酰对羟基苯乙胺(6)、N-反式阿魏酰对羟基苯乙胺(7)、异黑麦草内酯(8)、新海胆灵A(9)、牡荆苷(10)、勾儿茶素(11)、(±)-丁香脂素(12)、野樱苷(13)、4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲醛(14)、β-谷甾醇(15)和β-胡萝卜苷(16).结论 化合物1和9~14为首次从该属植物中分离得到.
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大孔吸附树脂分离纯化何首乌有效成分二苯乙烯苷的研究
目的 研究不同型号大孔吸附树脂纯化何首乌中二苯乙烯苷的工艺条件及参数.方法 以静态饱和吸附量、洗脱量、静态洗脱率为考察指标,比较了7种大孔树脂,并对HPD500树脂的动态比上柱量、比吸附量、比洗脱量进行了考察,以二苯乙烯苷转移率和纯度为指标对树脂吸附工艺条件进行了筛选.结果 所比较的 7种树脂中,HPD500型树脂具有佳的吸附及洗脱参数,其动态饱和吸附量达到151.7mg·g-1干树脂,其佳工艺为以6倍柱体积去离子水、4倍柱体积10%乙醇、6倍柱体积60%乙醇依次洗脱,二苯乙烯苷转移率为95%,其纯度为75.3%.结论 HPD500树脂吸附性能较好,适合于何首乌中二苯乙烯苷的纯化.
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蛋氨酸合酶活性筛选体系的建立
钴胺素依赖的蛋氨酸合酶催化N5-甲基四氢叶酸转移甲基至同型半胱氨酸生成蛋氨酸和四氢叶酸,直接参与蛋氨酸循环、叶酸循环及含硫氨基酸代谢,与DNA、蛋白质合成及生物甲基化有密切关系.本研究采用蛋白层析技术,将大鼠肝匀浆经超声破碎和高速离心处理后,依次经过DE-52批处理、Q Sepharose Fast Flow离子交换层析和CHT陶瓷羟基磷灰石吸附柱层析进行纯化,并对纯化产物进行了SDS-PAGE和Western blotting 鉴定.采用分光光度法测定蛋氨酸合酶的活性,对纯化酶的酶促反应动力学进行了研究,确定了佳反应条件,动力学结果显示蛋氨酸合酶的双底物酶促反应的机制为乒乓机制.研究表明,采用层析技术纯化得到的蛋氨酸合酶适用于以其为靶点的化合物高通量筛选.
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大孔吸附树脂对川芎中阿魏酸及总酚酸的分离纯化
目的:研究D-101大孔吸附树脂分离纯化川芎中阿魏酸及总酚酸的工艺条件及参数.方法:以阿魏酸及总酚酸的吸附容量和洗脱率为考察指标,研究大孔吸附树脂分离纯化的吸附性能和洗脱参数.结果:D-101大孔树脂对阿魏酸的吸附容量为4.93 mg·g-1,对总酚酸的吸附容量为51.3 mg·g-1;洗脱率阿魏酸为96.3%,总酚酸为96.7%.终产品中总酚酸的含量可达51.7%.结论:采用本法分离纯化川芎中阿魏酸及川芎总酚酸是可行的.