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大鼠胎肝干细胞的鉴定和分化研究
胚胎肝脏中含有的原始肝细胞具有成体肝干细胞的基本特性,即具有自我增殖和向肝细胞或胆管细胞分化的双分化潜能[1].鉴定潜在的干/祖细胞,主要依赖离心法或细胞表面标志来实现.经典的利用细胞表面标志实现分选方法是流式细胞分选法和免疫磁珠分选法,但肝干细胞表而标志目前尚无公认的金标准[2]且标志分选策略的代价高,限制了其在肝干细胞分选中的应用.
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小鼠胚胎肝干细胞的分离和鉴定
肝干细胞在成体肝脏中分离难度较大,目前认为采用胎肝分离纯化是一较好途径,我们在Suzuki等[1]利用荧光活化细胞分类法获取肝干细胞的方法基础上予以适当改进,建立以下方法.
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碱性成纤维细胞生长因子基因转染对鼠胎肝干细胞培养的优化作用
目的 观察以重组腺相关病毒(rAAV)为载体介导碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因转染对体外培养的鼠胎肝干细胞增殖及细胞周期的影响.方法 体外培养鼠胎肝干细胞,经rAAV作为载体介导bFGF基因转染,分为对照组、空载病毒转染组和bFGF转染组.用逆转录PCR和蛋白质印迹法检测鼠胎肝干细胞转染前、后bFGF基因和蛋白的表达.应用细胞生长曲线和CCK-8法观察细胞生长速度;采用流式细胞术测定细胞周期分布的变化.结果 转染bFGF后,bFGF转染组与对照组、空载病毒转染组相比,bFGF基因和蛋白水平均有表达,细胞的生长速度增快(q=20.43,P=0.001;q=26.52,P=0.001),G0/G1期细胞减少,S期细胞增多(q=72.56,P=0.000;q=32.28,P=0.001).结论 通过rAAV作为载体介导bFGF基因转染能促进体外培养的鼠胎肝干细胞增殖,对其培养有优化作用.
关键词： 大鼠 碱性成纤维细胞生长因子 胎肝干细胞 基因转染 -
人胎肝干细胞体外感染乙型肝炎病毒模型的建立
目的 建立一种稳定的基于人胎肝干细胞的维持乙型肝炎病毒(HBV)复制和传代的体外细胞培养模型,为深入研究乙肝病毒的生命周期和发病机制提供必要的工具.方法 原代分离12～20周胎龄的胎肝干细胞,用乙肝病毒阳性血清感染胎肝干细胞;荧光定量PCR追踪检测细胞上清和细胞内乙肝病毒DNA及细胞内乙肝病毒复制中间体-闭合环状双链DNA(cccDNA);化学发光法检测HBsAg、HBeAg分泌情况;免疫细胞化学法鉴定HBcAg表达情况;原位杂交检测细胞内病毒DNA.结果 在经HBV感染的细胞上清液中可持续检测出乙肝病毒DNA、HBsAg和HBeAg,细胞内可检测出HBV-cccDNA和HBcAg.结论 乙肝病毒可感染胎肝干细胞,并在细胞内增殖、分泌、传代,这一模型可模拟乙肝病毒自然感染人体的病理生理过程,为HBV感染机制研究和抗病毒药物的研发提供了必要的工具.
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小鼠胎肝干细胞的分离培养与鉴定
背景:胎肝细胞可能具有比骨髓干细胞等更强的增殖分化能力和更低的免疫原性,但目前涉及胎肝干细胞直接分离、培养的报道甚少.目的:拟在体外分离培养小鼠胎肝干细胞,并对其生物学特性进行初步鉴定.设计、时间及地点:细胞学体外观察.于2008-03/06在重庆市神经病学重点实验室完成.材料:SPF级13.5 d龄昆明种胎鼠9只,由重庆医科大学实验动物中心提供.方法:采用胶原酶+EDTA联合消化法与差速贴壁法体外分离胎鼠肝干细胞,按2×108L-1接种,待细胞80%一90%汇合后消化传代.采用链霉亲和素一生物素-过氧化酶复合物技术对原代接种后5 d的贴壁细胞进行多种肝干细胞表面标志物的标记.主要观察指标:原代胎肝干细胞形态变化,胎肝干细胞的传代扩增情况.胎肝十细胞表面标志的表达.结果:原代培养24 h细胞贴壁,呈致密圆形,边缘清楚:3 d左右部分细胞呈梭形,7 d后细胞铺展呈上皮样:传代后细胞扩增速度无明显变化,至第5代仍保持较均一的上皮细胞状.原代接种后5d的贴壁细胞,人干细胞因子受体与甲胎蛋白呈阳性表达,白蛋白与细胞角蛋白19呈阴性.结论:胎肝干细胞原代培养早期表达甲胎蛋白与人干细胞因子受体,不表达白蛋白和细胞角蛋白19,提示所分离的胎肝干细胞可能足一种较原始的干细胞,尚处在未分化的早期阶段.
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小分子干扰RNA介导的RhoA 沉默优化胎肝干细胞培养
背景:细胞移植治疗是目前的研究热点之一,寻找良好的细胞来源并有效扩增,是大量临床应用的基础.目的:通过沉默RhoA 基因优化胎肝干细胞培养方法.方法:体外培养胎肝干细胞,经小分子干扰RNA 转染以沉默RhoA 基因表达,分为3 组:A 组为干细胞组,B 组为经随机打乱顺序的小分子干扰RNA转染干细胞组,C组为经小分子干扰RNA转染的干细胞组.应用反转录-聚合酶链反应、Westernblot 法检测胎肝干细胞在转染前后RhoA 基因和蛋白的表达;四甲基偶氮唑蓝比色法观察细胞生长的优化作用;流式细胞术测定细胞周期分布的变化.结果与结论:转染小分子干扰RNA后C组与A、B组相比,RhoA基因和蛋白表达量明显降低(P < 0.05),细胞的生长速度明显增快,细胞周期G0/G1期减少,S期细胞数增多,各组间差异有显著性意义(P < 0.05).提示通过沉默RhoA基因的方法可以促进胎肝干细胞增殖,对其培养有优化作用.
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不同浓度HGF、EGF优化大鼠胎肝干细胞体外培养的研究
目的:研究不同浓度肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)和表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)对大鼠胎肝干细胞体外增殖的影响,探索二者间有无协同作用.方法:取孕14天胎龄F344大鼠胚胎的胎肝,经三步分离法分离纯化后,配置不同浓度HGF、EGF及HGF和EGF联合组培养基,将胎肝干细胞分组培养.光镜下观察细胞增殖状况,MTT法观察不同浓度和不同时间HGF、EGF及HGF和EGF联合对大鼠胎肝干细胞增殖的影响,并进行统计学分析.结果:HGF 10～80 ng/mL各浓度组,EGF 10～80 ng/mL各浓度组增殖效应均大于对照组.当HGF为20ng/mL,增殖效应明显大于对照组(P＜0.01),当HGF浓度继续增高时,增殖效应无明显增高.将20 ng/mL HGF组与不同浓度EGF组合后分组培养细胞,发现20 ng/ml HGF和10 ng/mLEGF联合组增殖效应明显升高,继续升高联合组中EGF浓度,增殖效应无明显提高.结论:HGF和EGF具有明显改善大鼠胎肝干细胞体外无血清培养条件的作用,二者对大鼠胎肝干细胞体外培养具有协同促进作用.其中20 ng/mL HGF和10 ng/mL EGF联合培养促进大鼠胎肝干细胞增殖效果明显.
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大鼠门静脉分支残端置管模型构建及细胞移植途径的评价
目的:大鼠肝部分切除模型被广泛的应用于肝脏疾病的研究,随着干细胞治疗肝损伤及护肝药物研究的发展,对大鼠肝损伤模型也提出了很多新的要求.本实验拟在大鼠肝部分切除术的基础上改进以建立大鼠肝断面门静脉分支残端的静脉置管模型,并进行细胞移植实验,对比分析新模型的优劣.方法:60只F344大鼠分为三组.A、B组行行85％肝切除术;C组行85％肝切除术+肝断面门静脉分支残端置管术.术中B组经门静脉注入4×105个表达GFP(green fluorescence protein,GFP)的胎肝干细胞(fetal liver stem/progenitor cells,FLSPCs).C组经留置导管注射入同等量的FLSPCs,A组注射同等剂量的培养液.72小时取血清,测定肝功能ALT、AST,统计死亡率;取肝脏组织切片观察其修复情况.统计学采用方差分析和LSD-t检验.结果:B、C组F344大鼠72小时肝功指标(ALT、AST)均明显优于A组;B组、C组肝脏组织学的病理损伤的恢复分别较A组快.B、C组间肝功指标无统计学意义.结论:经门静脉分支残端置管途径移植FLSPCs效果等同于经门静脉穿刺途径,且该模型具有可反复、可选时、减少创伤等优点.
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Tg737基因参与胎肝干细胞正常分化的机制研究
目的 探讨Tg737基因对胎肝干细胞(Fetal liver stem cells,FLSCs)正常分化的影响及相关机制.方法 三步分离法富集FLSCs;在HGF诱导FLSCs的不同时间点,RT-PCR检测AFP、ALB、Tg737及HNF4α的mRNA表达,Western blot检测Tg737和HNF4α的mRNA和蛋白表达;慢病毒Tg737-shRNA转染FLSCs,观察转染后Tg737的抑制效果;Tg737抑制后,RT-PCR检测不同诱导时间AFP和ALB的mRNA表达;Western blot检测Tg737抑制后HNF4α的蛋白表达.结果 三步分离法能有效富集FLSCs;在HGF诱导FLSCs的过程中,AFP的mRNA表达呈逐渐降低的趋势,ALB的mRNA表达逐渐升高,Tg737及HNF4α的mRNA和蛋白表达均呈逐渐升高的趋势;shRNA能有效下调Tg737的mRNA和蛋白表达;在HGF诱导过程中,Tg737抑制组AFP和ALB的mRNA水平均无明显变化;Tg737抑制后HNF4α的蛋白表达显著下调.结论 Tg737和HNF4α参与了FLSCs的正常分化,Tg737的表达缺失会抑制FLSCs的正常分化,其抑分化机制可能是通过下调HNF4α来实现的.
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HNF4α在胎肝干细胞促肝组织损伤修复中的作用
目的 探讨肝细胞核因子(HNF)4α在胎肝干细胞促大鼠肝组织损伤修复中的作用.方法 胶原酶结合机械消化法制备14 d胎龄大鼠胎肝干细胞悬液并进行体外长期培养.采用四氯化碳制作SD大鼠急性化学性肝损伤模型,造模成功后将肝损伤大鼠随机分为移植组(20只)和对照组(20只),移植绍将胎肝干细胞经门静脉移植至大鼠肝脏,对照组注射等容计量的生理盐水,分别于注射前6 h,注射后1,3,5周检测大鼠血清谷氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST),并检查肝组织病理学变化,观察肝脏修复情况.采用免疫组化及Western-blot方法检测肝脏治疗前后HNF4α表达情况.结果 对照组大鼠肝功能改善缓慢,ALT,AST明显高于移植组(P＜0.05),移植组大鼠损伤的肝组织逐渐修复,肝功能恢复正常.第5周移植组大鼠术后存活率显著高于对照组(P=0.002).肝组织损伤后,HNF4α在肝组织的表达明显升高;随着肝组织的逐渐修复,HNF4α表达逐渐下降.westernblot及免疫组化检测亦证实此结果.结论 HNF4α在肝脏损伤初期起保护作用.可能系通过促进胎肝干细胞向正常肝细胞分化增殖,并迁移至损坏的肝小叶从而替代损伤的肝实质,从而提高肝损伤后的恢复能力.
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绿色荧光蛋白转基因小鼠胎肝干细胞在体内外定向分化的潜能
目的 探讨绿色荧光蛋白转基因小鼠胎肝干细胞(FLSCs)在体内及体外定向分化的潜能.方法 取孕13d绿色荧光蛋白(GFP)转基因C57BL/6J小鼠胚胎肝脏,经机械消化和胶原酶消化获得FLSCs并扩大培养;成熟肝细胞来自于同品系小鼠成体肝脏,通过两步灌注胶原酶消化法提取,流式细胞仪鉴定其干细胞标志物的表达及自我增殖能力,RT-PCR及Western blot测定AFP表达;分别将FLSCs经肝细胞生长因子(HGF)及TGF-3诱导分化后,Real-time PCR检测Alb、角蛋白CK-7、8、19 mRNA以及Western blot检测Alb、角蛋白CK-7、8、19蛋白在诱导前后的表达变化,鉴定其向肝细胞和胆管细胞双向分化的能力;经尾静脉注射FLSCs到野生型C57BL/6J肝切除小鼠体内,观察其在肝内重构肝组织的能力.计量资料采用t检验,各时相点比较采用重复测量的方差分析,两两比较采用LSD-t检验.结果 成功克隆FLSCs细胞.流式细胞仪检测分离的FLSCs表达上皮细胞黏附分子(EpCAM)、CD133、CD49f干细胞标志物,其阳性表达率分别为78.6％±3.3％、31.7％±2.5％、47.6％±1.8％.AFP mRNA在FLSCs和成熟肝细胞中的相对表达量分别为0.640±0.115和0.053 ±0.012,蛋白相对表达量分别为1.383±0.265和0.243±0.227,两者比较,差异有统计学意义(t=8.772,5.354,P＜0.05).超低黏附培养皿培养FLPCs和成熟肝细胞,其形成克隆球数目分别为(234.0±57.0)个和(5.0±2.0)个,两者比较,差异有统计学意义(t=12.711,P＜0.05).体外HGF诱导FLSCs分化,Alb、CK-8 mRNA表达分别在8、10 d到达峰值,分别为0.851±0.030和0.771±0.031;两者蛋白水平于第10天达峰值,分别为4.573±0.015和1.562±0.029.体外TGF-β诱导FLSCs分化,CK-7、CK-19 mRNA在第12天达峰值,分别为15.454±2.152和10.675±1.822;两者蛋白水平于第14天达峰值,分别为3.423±0.105和1.892 ±0.081.在移植有FLSCs的肝切除小鼠体内可检测到表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的成熟肝细胞及胆管细胞.结论 分离的绿色荧光蛋白转基因FLSCs能够稳定表达绿色荧光,具有显著的肝干细胞特征和向肝细胞和胆管细胞双向分化的潜能,且在体内研究中具有良好的示踪性.
关键词： 绿色荧光蛋白转基因小鼠 胎肝干细胞 分离 鉴定 示踪
