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人干细胞因子受体膜外区1～3免疫球蛋白样结构域的表达、纯化及活性
目的在原核和真核细胞中表达人干细胞因子受体(c-Kit)配体结合区膜外N端1～3免疫球蛋白样结构域(c-Kit/Ig1～3),研究其配体结合活性.方法采用重叠延伸PCR定点诱变法合成c-Kit/Ig1～3双突变片段(c-Kit/Ig1～3DM),构建pET16b-c-Kit/Ig1～3DM表达质粒,转化E.coli BL21(DE3)诱导表达,稀释复性,镍柱纯化.将C端添加组氨酸标签的c-Kit/Ig1～3基因克隆入真核表达载体pEAK12中,转染HEK293 ET细胞构建c-kit/Ig1～3高效表达细胞株,从细胞培养上清中使用镍金属螯合柱收集纯化蛋白.His-tag pull-down和酶联免疫结合实验检测融合蛋白配体结合活性.结果在大肠杆菌中c-Kit/Ig1～3DM以包涵体形式表达,复性后配体结合活性很低.在HEK293 ET细胞中筛选到2个高效表达c-Kit/Ig1～3的细胞株,上清表达量为2μg/ml,融合蛋白相对分子质量为58 000;受体配体结合实验显示真核表达的c-Kit/Ig1～3有明显的干细胞因子特异结合活性,解离常数Kd值为9.39 nmol/L.结论获得了具有较高配体结合活性的c-Kit/Ig1～3融合蛋白.
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小鼠胎肝干细胞的分离培养与鉴定
背景:胎肝细胞可能具有比骨髓干细胞等更强的增殖分化能力和更低的免疫原性,但目前涉及胎肝干细胞直接分离、培养的报道甚少.目的:拟在体外分离培养小鼠胎肝干细胞,并对其生物学特性进行初步鉴定.设计、时间及地点:细胞学体外观察.于2008-03/06在重庆市神经病学重点实验室完成.材料:SPF级13.5 d龄昆明种胎鼠9只,由重庆医科大学实验动物中心提供.方法:采用胶原酶+EDTA联合消化法与差速贴壁法体外分离胎鼠肝干细胞,按2×108L-1接种,待细胞80%一90%汇合后消化传代.采用链霉亲和素一生物素-过氧化酶复合物技术对原代接种后5 d的贴壁细胞进行多种肝干细胞表面标志物的标记.主要观察指标:原代胎肝干细胞形态变化,胎肝干细胞的传代扩增情况.胎肝十细胞表面标志的表达.结果:原代培养24 h细胞贴壁,呈致密圆形,边缘清楚:3 d左右部分细胞呈梭形,7 d后细胞铺展呈上皮样:传代后细胞扩增速度无明显变化,至第5代仍保持较均一的上皮细胞状.原代接种后5d的贴壁细胞,人干细胞因子受体与甲胎蛋白呈阳性表达,白蛋白与细胞角蛋白19呈阴性.结论:胎肝干细胞原代培养早期表达甲胎蛋白与人干细胞因子受体,不表达白蛋白和细胞角蛋白19,提示所分离的胎肝干细胞可能足一种较原始的干细胞,尚处在未分化的早期阶段.
