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藁本内酯在大鼠肝微粒体中代谢的酶动力学
研究体外大鼠肝微粒体藁本内酯代谢的酶动力学及选择性CYP450酶抑制剂对其代谢的影响.建立测定肝微粒体孵育液中藁本内酯含量的LC-MS法,以尼群地平为内标,二者的定量离子m/z分别选择173和315.考察确定佳温孵条件,进行藁本内酯代谢的酶促反应动力学研究,通过特异性抑制试验,探讨参与藁本内酯代谢的丰要同工酶.结果显示,酮康唑、甲氧苄啶、α-萘黄酮显著抑制藁本内酯的体外代谢,而奥美拉唑、4-甲基吡唑、奎尼丁对其体外代谢影响不大.可见CYP3A4、CYP2C9和CYP1A2是参与藁本内酯代谢的主要代谢酶,CYP2C19、CYP2E1和CYP2D6没有明显参与催化其代谢.
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黄皮酰胺对映体在大鼠肝微粒体中的酶促反应动力学
目的研究黄皮酰胺(clausenamide,Clau)对映体在大鼠肝微粒体中的酶促反应动力学并比较其立体选择性差异.方法应用反相HPLC法测定Clau对映体在体外代谢系统中的产物,并用Eadie-Hofstee作图法分析数据、求算酶促反应动力学参数Km和Vmax以及肝代谢速率Vmax/Km.结果在体外代谢系统中,左旋黄皮酰胺主要生成7-羟-Clau、5-羟-Clau和4-羟-Clau,其优势代谢途径为7位羟化;7位羟化代谢的Vmax/Km值高于5位和4位.右旋黄皮酰胺的4位羟化反应Km小、Vmax大, 因此代谢速率高,是左旋体4位羟化的8倍;而其7-羟-Clau和5-羟-Clau 的产生量很小.结论黄皮酰胺对映体在大鼠肝微粒体中的羟化代谢存在明显的底物立体选择性差异.
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蛋氨酸合酶活性筛选体系的建立
钴胺素依赖的蛋氨酸合酶催化N5-甲基四氢叶酸转移甲基至同型半胱氨酸生成蛋氨酸和四氢叶酸,直接参与蛋氨酸循环、叶酸循环及含硫氨基酸代谢,与DNA、蛋白质合成及生物甲基化有密切关系.本研究采用蛋白层析技术,将大鼠肝匀浆经超声破碎和高速离心处理后,依次经过DE-52批处理、Q Sepharose Fast Flow离子交换层析和CHT陶瓷羟基磷灰石吸附柱层析进行纯化,并对纯化产物进行了SDS-PAGE和Western blotting 鉴定.采用分光光度法测定蛋氨酸合酶的活性,对纯化酶的酶促反应动力学进行了研究,确定了佳反应条件,动力学结果显示蛋氨酸合酶的双底物酶促反应的机制为乒乓机制.研究表明,采用层析技术纯化得到的蛋氨酸合酶适用于以其为靶点的化合物高通量筛选.
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蛇床夫内酯在大鼠肝微粒体中的酶促反应动力学研究
目的 研究蛇床夫内酯在大鼠肝微粒体中的酶促反应动力学.方法 以回芹内酯为内标,采用液质联用(LC/MS)的方法测定蛇床夫内酯在体外代谢中的代谢产物3″,8-甲氧基异欧前胡内酯(M1)和5″-羟基-8-甲氧基异欧前胡内酯(M2).用Linewrave-Burk作图分析数据,计算酶促动力学常数.结果 代谢物M1的Vmax=1.152 5μmol·(min·mg pro) -,Km=133.156 6 μmol·L-1,M2的Vmax=1.630 8 μmol·(min·mg pro)-1,Km=292.8571 μmol·L-1.结论 该方法简单、快速、可靠,适用于蛇床夫内酯的体外代谢研究.
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TM-2在大鼠、比格犬和人肝微粒体中的酶促反应动力学研究
目的 建立LC-MS/MS方法,研究TM-2在大鼠、比格犬和人肝微粒体中的酶促反应动力学.方法 建立测定大鼠、比格犬及人肝微粒体中温孵样品TM-2的LC-MS/MS方法,应用GraphPad Prism 5.0软件分析数据,计算酶促反应动力学常数Vmax和Km,并计算体外酶对药物的清除率(CLint).结果 TM-2在大鼠、比格犬和人肝微粒体中的大反应(代谢)速率Vmax分别为16.3、354.6和154.8 nmol·min-1·mg(protein)-1;米氏常数Km分别为25.7、313.8和89.4 μmol·L-1;内在清除速率CLint分别为0.63、1.13和1.73 mL· min-1·mg(protein)-1.结论 比格犬、人肝微粒体中催化TM-2的代谢酶活性显著大于大鼠中催化TM-2的代谢酶活性,而TM-2与大鼠肝代谢酶的亲和力较高.本实验从酶学的角度阐明了TM-2在不同种源间的代谢差异,为进一步研究该药的代谢性相互作用奠定基础.
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染料木苷在大鼠肝微粒体中的代谢及酶促反应动力学研究
目的 建立HPLC-MS法,初步鉴定染料木苷在大鼠肝微粒体中的代谢产物,并研究其酶促反应动力学.方法 建立大鼠肝微粒体体外孵育体系对染料木苷进行代谢研究,应用HPLC-MS鉴定其体外代谢产物.以磺胺甲(噁)唑为内标,采用代谢物生成法,对代谢产物染料木素进行定量测定.应用GraphPad Prism 5.0软件分析数据,计算酶促反应动力学常数Vmax和Km.结果 染料木苷在体外孵育体系中生成代谢产物,经鉴定其为苷元染料木素.染料木苷在大鼠肝微粒体中佳温孵时间为40 min,佳蛋白质量浓度为1 mg·mL-1,底物浓度为50 μmol·L-1,代谢产物染料木素酶促反应的Vmax=(0.1042±0.003 3)μmol·min-1·mg(pro)-1,Km=(28.96±2.80) μmol·L-1.结论 染料木苷在大鼠肝微粒体中通过水解反应,生成相应苷元.代谢物生成法是一种可靠、简便测定肝微粒体酶促反应动力学参数的方法,所得到的酶促反应动力学参数为染料木苷进一步研究提供了重要参数.
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延胡索与白芷组分配伍对延胡索乙素在大鼠肝微粒体中酶促反应动力学的影响
目的:研究延胡索总生物碱(TA)中延胡索乙素(TET)在肝微粒体中的酶促反应动力学,并比较白芷有效组分白芷香豆素(Cou)、挥发油(VO)与TA配伍后对TET酶促反应动力学的影响.方法:超速离心法制备大鼠肝微粒体,采用高效液相色谱法测定孵育液中TET原形药物的浓度.比较TA、TA-Cou、TA-VO、TA-Cou-VO配伍各组中TET的酶促反应动力学,推导出药物米氏常数(Km)和大反应速度(Vmax.)；并计算TET肝内清除率(CLint).结果:TA配伍组中的TET在大鼠肝微粒体内代谢反应的Vmax、Km和CLint分别为0.12μmol/(L·min·mg)、5.40μmol/L、0.022L/(min·mg)；TA-Cou组分别为0.27μmol/(L·min·mg)、40·18μmol/L、0.006L/(min·mg);TA-VO组分别为0.57μmol/(L.min.mg)、22.60μmol/L、0.025L/(min.mg)；TA-Cou-VO组分别为0.84μmol/(L.min.mg)、23.25μmol/L、0.036L/(min·mg).结论:TA配伍白芷有效组分可降低TA中TET在肝内的Cint.
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大鼠肝微粒体中间尼索地平的HPLC法测定与酶促反应动力学
建立了HPLC法测定大鼠肝微粒体中的间尼索地平及相应的酶促反应动力学.采用C18色谱柱,乙腈-水(62:38)为流动相,检测波长237nm,样品经氢氧化钠溶液碱化后用乙醚-正己烷(1:1)萃取.间尼索地平在1.56～100μmol/L浓度范围内线性关系良好.本法的相对回收率为93.0%,RSD为3.75%;日内、日间RSD分别为6.04%和1.53%.
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葛根素及葛根提取物在大鼠肝微粒体内代谢动力学研究
为了研究葛根素单体和葛根提取物中的葛根素在大鼠肝微粒体中的代谢是否存在差异,建立微粒体孵育体系.采用高效液相色谱法测定葛根素在肝微粒体代谢系统中的含量,并应用GraphPad Prism 5.0软件分析数据,计算酶促反应动力学参数.在体外代谢系统中,葛根素单体的酶促反应动力学参数Km为(0.93±0.17)μmol/L,Vmax为(93.59±2.82) nmol/min·mg,CLint(Vmax／Km)为(100.6±1.07) mL/min·mg；葛根提取物中葛根素的相应的动力学参数分别为(1.02±0.09)μmol/L,(22.48±1.53) nmol/min· mg和(22.04±1.72) mL/min·mg.葛根素单体和葛根提取物中的葛根素在大鼠肝微粒体的代谢存在明显的差异,葛根素单体的代谢速度快于葛根提取物中的葛根素的代谢速度.结果提示中药提取物中的其它成分可影响有效成分单体的代谢过程.
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Hirulog-s纤溶酶促反应动力学的常数测定
Hirulog-s为军事医学科学院通过对水蛭素结构改造获得的一种新型合成水蛭肽,其序列为：( D)-FPRP-GK( Stearic acid)-GG-QGDFEPIPEDA-YDE-NH2, Hirulog-s 半衰期达到T1/2=212．2±58．4 min[1]。水蛭素具有间接促进尿激酶诱导的纤溶作用[2],为考察新型水蛭肽Hirulog-s 影响纤溶因子亲和性的程度,本文基于单链尿激酶型纤溶酶原激活剂( pro-uPA)和纤溶酶原( plg)的相互活化作用[3]研究Hirulog-s通过酶促反应动力学参数体现出来的纤溶特性。
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大鼠肝微粒体中钩吻素子UPLC-MS/MS法测定与酶促反应动力学研究
目的 建立UPLC-MS/MS法测定大鼠肝微粒体中钩吻素子的浓度及其酶促反应动力学研究. 方法 优化钩吻素子与肝微粒体的反应体系,采用UPLC BEH C18色谱柱,流动相为甲醇-水(两者均含0.1％甲酸),梯度洗脱,流速为0.3 mL/min,进样量为1μL,质谱采用正离子,MRM模式检测孵育体系中钩吻素子的浓度,并应用Linewearve-Burk作图分析数据,计算酶促动力学常数. 结果 钩吻素子在0.5～30μM范围内线性良好,回归方程为y=0.1544x-0.0593(r=0.9939,n=5).钩吻素子的酶促反应动力学参数Km为14.2 μmol/L,Vmax为303.03pmol/(min·mg·pro)以及肝清除率CLinx(Vmax/Km)为21.37 μL/(min·mg·pro). 结论 该方法简单、快速、可靠,适应于钩吻素子的体外代谢研究.
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钩吻素子在大鼠肝微粒体中的酶促反应动力学研究
目的 建立体外实验法研究钩吻素子在大鼠肝微粒体中的酶促反应动力学.方法 以钩吻碱甲标准品为内标,采用液质连用(UPLC/MS)的方法测定钩吻素子在体外代谢30min后剩余钩吻素子的含量.UPLC采用BEH C18色谱柱(2.1×50mm,1.7μm),流动相为0.1%甲醇酸-0.1%甲醇水(20:80),流速为0.3mL·min-1,进样量为1μL,柱温为40℃,MS采用正离子、多反应监测(MRM)模式监测,离子监控通道m/z 307.1＞69.76(钩吻素子),m/z 323.1＞69.76(钩吻碱甲),毛细管电压2.8kV,锥孔电压35V,离子源温度110℃,脱溶剂温度300℃,锥孔气(N2)流速50L·h-1,脱溶剂气(N2)流速450L·h-1.用Linewrave-Burk作图分析数据,计算酶促动力学参数.结果 钩吻素子在0.5～30uM范围内线性良好Y=0.1544X+0.0593,r=0.9939结论此方法简单、快速、可靠,适用于钩吻素子的体外代谢研究.
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1种新型合成水蛭肽的纤溶动力学研究
目的 研究水蛭肽Hirulog-s影响单链尿激酶型纤溶酶原激活剂和纤溶酶原相互活化作用考察新型合成水蛭肽的纤溶作用特性.方法 构筑单链尿激酶型纤溶酶原激活剂(pro-uPA)和纤溶酶原(plg)相互活化反应体系,添加Hirulog-s成反应体系不同浓度,比较pro-uPA和plg相互活化反应体系中纤溶酶(plm)作用于pro-uPA反应的酶促反应动力学常数(Km,kcat),分析Hirulog-s对plm作用于pro-uPA反应的催化速率及亲和性.纤溶活性作用检测采用底物酶促反应法,酶促反应动力学常数的测定基于单链尿激酶型纤溶酶原激活剂激活纤溶酶原的反应.结果 在plm作用于pro-uPA的反应体系中,30 μmol·L-1 Hirulog-s与对照相比kcat值增大了3.1倍,Km值减小了1.6倍,表明Hirulog-s可以显著提高plm的大催化速率同时增强亲和性.30 μmol·L-1 Hirulog-s与对照相比kcat/Km值增大了4.75倍,表明Hirulog-s明显提高了plm的催化效率.通过活性对比表明Hirulog-s的纤溶活性强于水蛭肽Hirulog-1.结论 Hirulog-s促进单链尿激酶型纤溶酶原激活剂和纤溶酶原相互活化作用而发挥纤溶作用,新型合成水蛭肽从酶促反应动力学参数显示出优良的纤溶作用特性.
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大鼠肝细胞液体外甲基化代谢丹酚酸A的酶促反应动力学
目的 筛选大鼠肝细胞液作为儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)供体,建立丹酚酸A(SAA)体外孵育甲基化代谢的酶促反应.方法 采用HPLC-UV法检测孵育体系中底物SAA的浓度,根据底物消耗量计算SAA的体外酶促代谢反应速度和动力学参数.结果 在大鼠肝细胞液体外温孵体系中,SAA的酶促甲基化代谢反应呈现饱和动力学特征,符合Michaelis-Menten曲线,大反应速率(Vmax)和米氏常数(Km)分别为30.4 nmol· mol-1·min-1,0.179 mmol·L-1.结论 大鼠肝脏的COMT酶对SAA有较强的亲和力,可催化SAA发生快速、完全的甲基化代谢,大鼠肝细胞液与SAA在控制条件下体外温孵是高收率、选择性制备SAA甲基化代谢产物的一种有效手段.
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黄芩素在正常及早期肝纤维化模型小鼠体外肝、肠微粒体中Ⅱ相代谢差异
目的 考察肝纤维化模型小鼠肝、肠微粒体对黄芩素体外葡萄糖醛酸化代谢影响和酶促反应动力学研究.方法 小鼠每周3次灌胃20％ CCl4油溶液,持续6周,检测血清肝功能指标ALT和AST,ELISA试剂盒检测血清中HA,天狼猩红染色和免疫组化染色α-SMA评估肝纤维化模型.检测正常和肝纤维小鼠肠道内容物β-葡萄糖醛酸苷酶活性,同时建立小鼠肝、肠微粒体孵育体系对黄芩素葡萄糖醛酸化反应的酶促反应动力学进行研究,评估其代谢动力学类型,并对比在正常和肝纤维化模型中大反应速率(Vmax)和米氏常数(Km).结果 经过6周CCl4诱导后,模型组的血清、病理和免疫组化检测结果显示肝纤维化模型复制成功.体外实验结果显示,黄芩素在小鼠肝微粒体中的代谢方式符合米氏方程,而在肠微粒体中属于底物抑制型.与正常组相比,黄芩素在肝纤维化后的肝微粒体中的代谢速率要显著提高(P＜0.01),而在肠微粒体中则相反,但差异无统计学意义,同时发现肝纤维化后肠道菌群中的β-葡萄糖醛酸苷酶活性要显著高于正常组(P＜0.01).结论 肝纤维化状态对葡萄糖醛酸苷转移酶等Ⅱ相代谢酶的活性带来显著的改变,这值得我们关注肝纤维化疾病状态下药物的代谢特征和临床疗效,促进安全合理用药.
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黄芩素在溃疡性结肠炎模型大鼠肝、肠微粒体中酶促反应动力学研究
目的 考察黄芩素在正常和溃疡性结肠炎大鼠肝、肠微粒体中的酶促反应动力学差异.方法 采用3％葡聚糖硫酸钠连续自由饮用10d,诱导溃疡性结肠炎大鼠模型,分别制备正常和溃疡性结肠炎大鼠肝、肠微粒体,通过建立大鼠肝、肠微粒体体外孵育体系对黄芩素代谢进行研究,采用HPLC-DAD检测方法对代谢产物黄芩苷进行定量测定,应用GraphPad Prism 5.0软件分析数据,对比黄芩素在正常和溃疡性结肠炎模型中的酶促反应动力学常数大反应速率(Vmax)和米氏常数(Km).结果 黄芩素(5～150 μmol·L-1)在正常和溃疡性结肠炎大鼠肝微粒体中的代谢属于经典的米氏方程,Km分别为(59.13±7.756)、(57.45±6.699) μmol·L-1,Vmax分别为(6.086±0.3234)、(7.447±0.347)μmol/(min·mg),而在肠微粒体中符合底物抑制动力学特征,抑制速率(Ki)分别为(166.4±58.31)、(141.7±41.17) μmol·L-1,Vmax分别为(4.130±0.6035)、(5.797±0.7903) μmol/(min·mg).不管是正常组还是模型组,黄芩素在肝脏中的代谢速率要显著高于肠微粒体;与正常组相比,溃疡性结肠炎大鼠肝、肠微粒体中黄芩素葡萄糖醛酸化反应的速率显著升高,同时发现了黄芩素的一个新代谢产物,可能为黄芩苷的同分异构体.结论 溃疡性结肠炎疾病状态能够显著升高葡萄糖醛酸化转移酶的活性,可能是导致黄芩苷在疾病状态下体内暴露强度增加的因素之一.
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奥美拉唑在大鼠肝微粒体中的酶促反应动力学研究
目的:研究奥美拉唑在大鼠肝微粒体中的酶促反应动力学.方法:采用高效液相色谱法测定奥美拉唑在体外代谢系统中的产物5'-羟基奥美拉唑,并用Eadie-Hofstee作图法分析数据,计算酶促反应动力学参数大反应速率(Vmax)、米氏常数(Km).结果:在体外代谢系统中,奥美拉唑生成5'-羟基奥美拉唑的Vmax为2 010nmol/(min·mg protein)、Km为50.3μmol/L.结论:本分析方法符合方法学验证的要求,体外代谢常数准确,可满足奥美拉唑体外代谢的研究.
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雷公藤甲素在大鼠肝微粒体中代谢及酶促反应动力学研究
目的:研究雷公蘼甲素在大鼠肝微粒体中代谢及酶促反应动力学.方法:将雷公藤甲素与5种不同诱导剂(地塞米松(DEX)、苯巴比妥(PB)、β-萘黄酮(β-NF)、吡啶(PD))诱导的大鼠肝微粒体进行体外共孵育;并与8种选择性CYP酶抑制剂(酮康唑、醋竹桃霉素、磺胺笨吡唑、二乙基二硫代氨基甲酸酯(盐)、奎尼丁、呋拉茶碱、毛果芸香碱、奥芬那君)在空白肝微粒体中共孵育.采用液相色谱-质谱联用技术测定孵育后剩余雷公藤甲素的含量.结果:酮康唑和醋竹桃霉素能明显抑制雷公藤甲素的代谢;磺胺苯吡唑和奥芬那君对其代谢也有一定抑制作用,但不及酮康唑和醋竹桃霉素.结论:雷公藤甲素在大鼠肝微粒体中代谢主要由CYP3A介导,其次由CYP2C和CYP2B介导.
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基于酶促反应动力学的无标准品ELISA抗体滴度定量方法
目的 建立无标准品的酶联免疫吸附测定(ELISA)抗体滴度定量方法.方法 对血清抗体ELISA检测设置非特异、阴性对照、特异和总抗体检测组.显色早期的时间-吸光度数据经线性拟合的斜率即吸光度变化速度 ,分别记为ν0 、νC 、νS 、νT .基于底物过量时ν值与待测抗体浓度(C)呈直线关系 ,设计ν值函数计算待测样本与阴性对照样本的抗体浓度倍比.以鱼胶原蛋白免疫昆明小鼠的血清特异Ig G抗体检测进行实例分析.结果 函数C/CC = (ν-ν0 )/(νC -ν0 )可计算待测样本与阴性对照样本的特异抗体浓度倍比(滴度).结论 该动力学ELISA抗体滴度检测方法适用于无标准品半定量分析.
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间尼索地平对映体在人肝微粒体中的酶促反应动力学研究
目的:研究间尼索地平对映体在人肝微粒体中的酶促反应动力学,计算其酶促反应动力学参数,并对R型和S型间尼索地平的酶促反应动力学过程进行比较.方法:以尼莫地平为内标,建立液相色谱-质谱联用(LC-MS)方法分别测定体外孵育人肝微粒体后R型、S型间尼索地平含量,采用Linewrave-Burk作图法处理数据,以底物消除法计算酶促动力学参数Km和Vmax.结果:R-间尼索地平Km=71.67 μmol·L-,Vmax=2.513 μmol·min-1·mg-1;S-间尼索地平Km=72.86 μmol·L-1,Vmax=2.534 μmol·min-1·mg-1.结论:该方法简单、可靠,适用于间尼索地平的体外代谢研究,R型和S型间尼索地平的酶促反应动力学过程无明显差异.
