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钩吻素子大鼠在体肠吸收动力学研究
目的:研究钩吻素子大鼠在体肠吸收动力学特征.方法:采用高效液相色谱法测定钩吻素子含量,以大鼠在体单向灌流法研究药物浓度、吸收部位和灌流液pH对钩吻素子肠吸收的影响.结果:小肠为钩吻素子主要吸收窗、十二指肠、空肠、回肠各段对钩吻素子的吸收无显著差异(P＞0.05);钩吻素子吸收速率不受自身质量浓度影响,吸收机制符合被动扩散方式;钩吻素子在不同pH灌流液中吸收有显著性差异(P＜0.05),碱性条件下钩吻素子吸收优于酸性条件.结论:钧吻素子在全肠段吸收良好,没有特定吸收窗口,提示该药物适合制成缓释制剂.
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瑶药风湿骨痛喷雾剂Ⅲ的质量标准研究
目的:建立瑶药风湿骨痛喷雾剂Ⅲ的质量标准.方法:对制剂中钩吻进行薄层色谱法定性鉴别；用高效液相色谱法测定制剂中钩吻素子.结果:在薄层色谱中能检出钩吻；钩吻素子在0.199 2～3.187μg范围内呈良好的线性关系(r =0.999 7).平均回收率为98.58％,RSD为1.41％(n=6).结论:所建立的方法稳定可靠,可有效控制该制剂的质量.
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HPLC法同时测定钩吻提取物中3种生物碱的含量
目的 建立HPLC同时测定钩吻提取物中钩吻素子、钩吻素甲及16-表伏康树卡平碱3种生物碱含量的方法.方法 采用YMC C18(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱,以乙腈和0.025 mol· L-1磷酸二氢钾(磷酸调pH至3.0)水溶液进行梯度洗脱;检测波长为254 nm,柱温30C,进样量10 μL,流速1.0 mL· min-1.结果 钩吻素子、钩吻素甲和16-表伏康树卡平碱质量浓度分别在32.2～322、34.4～344、6.2～62 μg· mL-1内与峰面积呈良好的线性关系,加样回收率分别为98.6％、101.1％、98.3％,RSD分别为1.7％、1.3％、1.1％.结论 该方法准确、简便、重现性好,可用于钩吻提取物中钩吻素子、钩吻素甲及16-表伏康树卡平碱的含量测定.
关键词： 钩吻提取物 钩吻素子 钩吻素甲 16-表伏康树卡平碱 含量测定 -
钩吻素子对孤立大鼠的抗焦虑作用及其机制
目的 研究钩吻素子连续皮下给药对孤立大鼠抗焦虑样行为的影响,并探讨其作用机制.方法 Wistar大鼠单笼饲养18 d,第12天开始每天皮下注射钩吻素子0.5、1.5 mg/kg 1次,连续给药7d.孤立饲养第17天(即给药第6天)进行高架十字迷宫试验,试验后1 d(即给药第7天)进行自主活动试验和群居接触试验.行为学试验结束后,通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检测动物血浆中促肾上腺皮质激素(ACTH)和皮质酮浓度,并测定海马中孕酮和别孕烯醇酮的含量.结果 钩吻素子连续给药6d能有效提高孤立大鼠在高架十字迷宫开臂区的活动情况,提示钩吻素子具有抗焦虑作用;钩吻素子连续给药7d对大鼠自主活动无影响,但能提高配对孤立大鼠的接触次数和接触时间,进一步证明了钩吻素子的抗焦虑效应.与模型组比较,钩吻素子1.5 mg/kg治疗组能降低孤立大鼠血浆中的皮质酮水平(P＜0.05),钩吻素子0.5、1.5 mg/kg治疗组均能提高大鼠海马中的别孕烯醇酮含量(P＜0.01);而各组动物血浆中的ACTH浓度和海马中的孕酮含量则未见变化.结论 钩吻素子连续给药能增加孤立大鼠的抗焦虑样行为,其抗焦虑作用可能与调节大鼠海马的别孕烯醇酮含量和抑制下丘脑-垂体-肾上腺轴异常活动有关.
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人血浆中钩吻素甲和钩吻素子HPLC-UV测定
目的 建立HPLC法测定人血浆中钩吻素甲(GM)和钩吻素子(KM)的浓度.方法 用Waters HLB-SPE固相萃取小柱提取人血浆中GM及KM.色谱柱为Shim-Pack C18色谱柱(250 mm×4.6mm,5 μm);流动相为甲醇-水-二正丁胺(58∶42∶0.01);体积流量1.0 mL/min;进样量50μL;柱温30℃;检测波长263 nm.结果 GM和KM在0.05～20tg/mL线性关系良好,低定量限为50 ng/mL (S/N≥10),GM和KM的平均提取回收率分别为90.88％、87.84％,平均方法回收率分别为98.65％、96.31％,平均日间精密度RSD分别为9.81％、10.63％,平均日内精密度RSD分别为7.79％、8.24％.含GM和KM的人血浆在室温25℃避光的条件下保存12h、在4℃冰箱保存2d、在-20℃冰箱保存15d、-20℃冰箱反复冻融3次的条件下,低、中、高3个质量浓度(0.05、5.0、20 tg/mL)的GM和KM回收率均在90％以上.结论 建立的人血浆中GM和KM的HPLC测定方法灵敏度高、血浆用量少、操作简便、结果准确可靠,适用于钩吻制剂药动学研究和钩吻中毒时定性和定量分析.
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UPLC测定钩吻素子的含量及其水溶液稳定性
目的 建立超高效液相色谱法测定钩吻素子的含量,并考察其水溶液在室温条件下的稳定性.方法 采用Agilent Extend-C18(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)色谱柱,以乙腈-0.2％正丁胺水溶液(30∶70)为流动相,流速0.5 mL·min-1,检测波长256 nm,测定3个批次钩吻素子的含量,并考察钩吻素子水溶液在室温条件下稳定性.结果 钩吻素子分离度良好;在10.19～112.2μg·mE-1内线性关系良好(r=0.999 7),定量限为0.1 μg·mL-1;平均回收率为100.4％(RSD=0.45％,n=9);3个批次钩吻素子平均含量为99.97％;钩吻素子水溶液室温条件下连续7d稳定性良好.结论 该方法简单易行、专属性强,准确可靠,适用于钩吻素子含量测定,且本品水溶液稳定性良好.
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大鼠肝微粒体中钩吻素子UPLC-MS/MS法测定与酶促反应动力学研究
目的 建立UPLC-MS/MS法测定大鼠肝微粒体中钩吻素子的浓度及其酶促反应动力学研究. 方法 优化钩吻素子与肝微粒体的反应体系,采用UPLC BEH C18色谱柱,流动相为甲醇-水(两者均含0.1％甲酸),梯度洗脱,流速为0.3 mL/min,进样量为1μL,质谱采用正离子,MRM模式检测孵育体系中钩吻素子的浓度,并应用Linewearve-Burk作图分析数据,计算酶促动力学常数. 结果 钩吻素子在0.5～30μM范围内线性良好,回归方程为y=0.1544x-0.0593(r=0.9939,n=5).钩吻素子的酶促反应动力学参数Km为14.2 μmol/L,Vmax为303.03pmol/(min·mg·pro)以及肝清除率CLinx(Vmax/Km)为21.37 μL/(min·mg·pro). 结论 该方法简单、快速、可靠,适应于钩吻素子的体外代谢研究.
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钩吻素子抗焦虑作用及其对海马区神经甾体水平的影响
目的：进一步明确钩吻素子的抗焦虑作用并探讨其对大鼠海马区神经甾体水平的影响。方法以地西泮为阳性对照药，大鼠高架十字迷宫为动物模型，评价钩吻素子的抗焦虑活性及特点；采用固相萃取结合高效液相色谱-质谱联用技术测定大鼠海马区中神经甾体的含量。结果与空白对照组相比，钩吻素子不影响大鼠在高架十字迷宫中的总入臂次数（ P＞0.05），并且能显著增加大鼠进入开臂次数和在开臂的停留时间百分率（P＜0.01）。钩吻素子处理组大鼠海马区孕烯醇酮和别孕烯醇酮含量较空白对照组显著增高（P＜0.05）。结论钩吻素子具有抗焦虑作用，其作用机制可能与提高海马区神经甾体孕烯醇酮和别孕烯醇酮水平有关。
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钩吻素子在大鼠肝微粒体中的酶促反应动力学研究
目的 建立体外实验法研究钩吻素子在大鼠肝微粒体中的酶促反应动力学.方法 以钩吻碱甲标准品为内标,采用液质连用(UPLC/MS)的方法测定钩吻素子在体外代谢30min后剩余钩吻素子的含量.UPLC采用BEH C18色谱柱(2.1×50mm,1.7μm),流动相为0.1%甲醇酸-0.1%甲醇水(20:80),流速为0.3mL·min-1,进样量为1μL,柱温为40℃,MS采用正离子、多反应监测(MRM)模式监测,离子监控通道m/z 307.1＞69.76(钩吻素子),m/z 323.1＞69.76(钩吻碱甲),毛细管电压2.8kV,锥孔电压35V,离子源温度110℃,脱溶剂温度300℃,锥孔气(N2)流速50L·h-1,脱溶剂气(N2)流速450L·h-1.用Linewrave-Burk作图分析数据,计算酶促动力学参数.结果 钩吻素子在0.5～30uM范围内线性良好Y=0.1544X+0.0593,r=0.9939结论此方法简单、快速、可靠,适用于钩吻素子的体外代谢研究.
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钩吻素子抗外周神经损伤导致诱发痛的效应
目的：观察钩吻素子抗外周神经损伤致神经病理性疼痛中诱发痛的效应及其时效关系，分析脊髓是否为钩吻素子抗神经病理性疼痛的可能作用部位。方法在大鼠坐骨神经慢性束缚损伤（CCI）致神经病理性疼痛模型上，以热痛觉过敏为指标，观察连续皮下注射给予钩吻素子（0．28、7．0 mg/kg ，CCI术后第3～9 d ，每天2次）对CCI大鼠诱发痛的效应；观测单次皮下注射给予7．0mg/kg钩吻素子后第0．5，1，2，4，6h对CCI大鼠诱发痛的效应及时效关系；Dixon序贯法分别测定钩吻素子皮下和鞘内注射抗CCI大鼠诱发痛作用的ED50，分析脊髓是否为钩吻素子抗神经病理性疼痛的可能作用部位。结果连续皮下注射7．0 mg/kg钩吻素子组在术后第3 d首次给药后，痛阈即显著高于溶剂对照组，术后第9 d效应显著（翻转率为93．8％，有效率达100％）。单次皮下注射给予7．0mg/kg钩吻素子0．5h术侧足痛阈显著高于溶剂对照组（翻转率达62．9％，有效率达55．6％）；1h痛阈高（翻转率达70．8％，有效率达77．8％），随后痛阈有所下降，但6 h仍显著高于CCI＋ saline组。单次皮下注射钩吻素子抗CCI大鼠诱发痛作用的ED50为1．074 mg/kg ，单次鞘内注射的ED50为每只41．4μg ，远低于皮下注射的ED50。结论钩吻素子具有抗外周神经损伤致神经病理性疼痛中诱发痛的效应，单次给予0．5 h内起效，持效约5．5h；脊髓可能是其发挥抗神经病理性疼痛效应的作用部位。
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钩吻素子亲水凝胶骨架缓释片的处方优化及其体外释放度研究
目的：优化筛选钩吻素子亲水凝胶骨架缓释片处方，并考察其体外释药行为。方法以羟丙甲基纤维素（HPMC）为缓释骨架材料，以累积释放度为指标，采用正交试验优化制剂处方；采用粉末直接压片法制备钩吻素子亲水凝胶骨架缓释片，并对缓释片体外释药行为进行考察。结果钩吻素子亲水凝胶骨架缓释片优化处方为：钩吻素子10 mg ，HPMC K4M 112 mg ，乳糖22．4 mg ，预胶化淀粉132．8 mg ，微粉硅胶1．4 mg ，硬脂酸镁1．4 mg ；以此法制备的缓释片2 h内钩吻素子释放度为35％～40％，6 h内释放度为60％～65％，12 h内释放度为90％以上；钩吻素子亲水凝胶骨架缓释片体外释放度符合Ritger-Peppas方程（r＝0．9983），释放指数 n＝0．5454，符合0．45＜ n＜0．89，该制剂体外释药机制为扩散和骨架溶蚀的协同作用。结论本钩吻素子亲水凝胶骨架缓释片具有良好的缓释效果。
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钩吻素子研究专题
钩吻为马钱科植物胡蔓藤的全草，其生物碱单体具有重大的研发价值。课题组一直致力于钩吻生物碱单体的药理作用与成药性研究，已在包括《Psychopharmacology》等学术期刊发表研究论著10篇；获国家发明专利授权6项，并申报国际发明专利1项。钩吻生物碱单体钩吻素子有望开发成为拥有自主知识产权、高效低毒的国家1类治疗神经病理性疼痛新型药物。本期设置“钩吻素子研究”专题，刊登的内容包括钩吻素子的理化性质及稳定性等药学研究、抗神经病理性疼痛自发痛药效学研究、药动学研究、药物依赖性研究和药剂学研究、钩吻素子成药性评价。希望通过这些特约的研究论文，将钩吻素子的新研究内容呈现给读者，以促进钩吻研究的发展。
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钩吻素子无吗啡样药物依赖性
目的：评价钩吻素子产生吗啡样药物依赖性的潜力。方法采用离体豚鼠回肠药物依赖模型、小鼠药物依赖催促戒断模型和自然戒断模型，分析钩吻素子诱导吗啡样身体依赖性的潜力；进而通过小鼠条件性位置偏爱实验评价钩吻素子诱导吗啡样精神依赖性的潜力。结果钩吻素子孵育的离体豚鼠回肠未出现吗啡样纳洛酮催促的戒断反应；小鼠连续给予钩吻素子，未出现吗啡样纳洛酮催促的跳跃、体质量下降和自然戒断的体质量下降等戒断反应；也未见吗啡样条件性位置偏爱效应。结论钩吻素子可能无吗啡样药物身体依赖性和精神依赖性的潜力。
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钩吻素子在大鼠体内的药物代谢动力学及组织分布
目的：建立 HPLC测定大鼠血液和组织钩吻素子含量的方法，进而研究单次灌胃给予钩吻素子的大鼠体内药动学以及组织分布。方法采用萃取法预处理大鼠的血液和组织样品；建立HPLC-紫外检测法测定生物样品的钩吻素子含量。大鼠单次灌胃给予钩吻素子15 mg/kg后，于不同时间点收集血液和组织样本，HPLC法测定大鼠血浆和组织中的钩吻素子含量，计算药代动力学参数。结果建立的 HPLC测定血液和组织钩吻素子含量的方法，专属性好，线性范围分别为0．06～10．00μg/mL和0．08～5．00μg/mL ，日内和日间RSD均＜9％，提取回收率分别为80．03％～83．55％和64．20％～76．82％，方法回收率分别为99．21％～110．36％和91．87％～109．25％。雄性SD大鼠单次灌胃给予15 mg/kg钩吻素子，达峰时间为（19．95±0．53）min ，消除半衰期为（234．11±17．37）min ，表观分布容积为（10．45±0．36）L/kg ，曲线下面积为（142．35±5．86）mg?min?L-1。给药5 min后，待检组织均检出钩吻素子，且多数组织浓度已达峰，组织浓度在胃、体脂、肝、肾、脾、小肠较高；随后，多数组织中的药物含量随时间推移而下降，但肝脏和小肠含量在给药后15 min高；给药60 min后多数组织药物含量较低，其中骨骼肌和睾丸已低于检测限。结论本 HPLC测定生物样品钩吻素子含量的方法操作简便，准确灵敏，可用于钩吻素子体内药动学研究；钩吻素子在大鼠体内的药代动力学符合二室模型；钩吻素子在大鼠体内分布迅速广泛，以消化道浓度为高，可透过血脑屏障，消除速度快。
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钩吻素子抗外周神经损伤致神经病理性疼痛中自发痛的效应
目的：观察钩吻素子抗外周神经损伤致神经病理性疼痛（NPP）中自发痛的效应。方法在大鼠坐骨神经慢性束缚损伤（CCI）NPP 模型上，以术侧自发性抬足时间和足姿势评分为指标，观察单次（7．0，1．4，0．28 mg/kg）、连续多次（7．0，0．28 mg/kg ，每日2次，连续7 d）皮下注射给予钩吻素子对 NPP中自发痛的效应。结果单次皮下注射给予钩吻素子剂量依赖性减少自发性抬足时间，其中7．0 mg/kg组与对照组比较差别有统计学意义（P＜0．01）；单次皮下注射给予钩吻素子剂量依赖性降低足姿势评分，其中1．4，7．0 mg/kg组与对照组比较差别有统计学意义（P＜0．05和 P＜0．01）。连续多次给予钩吻素子减少自发性抬足时间，7．0 mg/kg组在术后第3，5，7，9 d自发性抬足时间均低于对照组（P＜0．01）；连续多次给予钩吻素子降低足姿势评分，7．0 mg/kg组在术后第3，5，7，9 d评分均低于对照组（P＜0．05或 P＜0．01），到术后第9 d疗效强。结论钩吻素子具有抗外周神经损伤致NPP中自发痛的效应。
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钩吻素子的基本理化性质及其水溶液稳定性
目的：探讨钩吻素子的基本理化性质及其水溶液稳定性。方法高效液相色谱法测定钩吻素子在不同介质中的平衡溶解度和表观油/水分配系数；考察钩吻素子在不同pH水溶液、不同温度下的稳定性。结果钩吻素子在纯水中的平衡溶解度为141 mg/mL ，在碱性介质中的平衡溶解度降低；酸性条件下钩吻素子的表观油/水分配系数对数值Lg P＜-1，碱性条件下Lg P＞1；4℃和25℃时钩吻素子水溶液在 pH 3～9稳定性良好，37℃时在强酸（pH 3）条件下稳定性较差。结论钩吻素子的水溶性较强，碱性条件下其亲脂性比酸性条件下高，高温条件下其强酸性水溶液稳定性较差。
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钩吻素子在猪及大鼠肝微粒体中代谢表征的研究
目的 研究钩吻素子在猪和SD大鼠2种不同种属肝微粒体体外代谢差异,评价它们对钩吻素子的代谢作用,初步揭示猪肝脏细胞色素P450酶系的解毒作用. 方法 用相同蛋白浓度的猪与SD大鼠的肝脏微粒体与钩吻素子共同孵育,用高效液相色谱法对二者孵育液进行检测,检测条件:依利特色谱柱150 mm×4.6 mm,乙腈∶0.1％三-乙胺(20∶80)洗脱,柱温30°C,流速1.0 mL/min,检测波长为254 nm,进样量为20 μL. 结果 在孵育条件相同的情况下,钩吻素子与猪肝微粒体的孵育液在21 min出现了一个色谱峰,且钩吻素子峰面积有所减小,而钩吻素子与大鼠肝微粒体孵育液中未出现任何物质,且峰面积未有变化. 结论 在相同孵育条件下,猪肝微粒体可以代谢钩吻素子,而SD大鼠却无此现象.
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断肠草中毒的GC-MS-MS检测方法
断肠草为马钱科胡蔓藤属植物,该植物产于亚洲和北美,我国主要分布于浙、闽、粤、滇、黔、桂等地的灌木丛中[1].民间俗名繁多,常称有钩吻、大茶叶、大茶药、胡蔓藤、大炮叶、黄藤根、吻荞、野葛、冶葛、胡蔓草、烂肠草、虎狼草等.因其名称混乱,有的与中草药名容易混淆,群众难以鉴别,使用时常发现有掺杂,误服导致中毒,也可见采摘钩吻植物而自杀或谋害他人的案例.断肠草引起的食物中毒,轻则头晕、恶心、呕吐、腹痛、乏力,重则出现抽搐、昏迷、肺水肿、呼吸和循环衰竭,甚至死亡.因此建立快速、准确的测定断肠草中钩吻素甲的分析方法,对快速诊断食物中毒或药物中毒原因、及时救治具有重要意义.钩吻植物全株有毒,尤其嫩叶毒性更大.从中分离出多种生物碱:钩吻素子(Koumine),钩吻素寅(Kouminicine),钩吻素卯(Kouminidine),钩吻素甲(Gelsemine),钩吻素丙(Sempe rvine),钩吻素辰(Kounidine)等,钩吻生物碱可因植物品种与产地不同,有毒成分存在差异[2,3].我国断肠草中所含钩吻碱以钩吻素甲含量高,广西玉林、百色、南宁地区等地钩吻植物中均检出钩吻素甲成分.
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钩吻素子在人与小型猪、SD大鼠、恒河猴、比格犬肝微粒体中的体外代谢比较
目的 采用超高效液相色谱法(UPLC)研究钩吻素子在肝微粒体的体外代谢,比较其在人与各种实验动物代谢的相似情况,作为体内代谢研究的动物选择和分析的依据.方法 建立UPLC法测定条件;通过对孵育时间、肝微粒体蛋白含量和钩吻素子浓度等条件的考察,优化钩吻素子与肝微粒体的反应体系;分析比较钩吻素子在各种属肝微粒体中代谢产物种类、生成量和代谢速率等差异.结果 所建立的测定方法灵敏度、分离度高,经方法学考察表明其线性关系、准确度等指标均符合要求.在优化的反应体系下,钩吻素子在人、小型猪、SD大鼠、恒河猴、比格犬肝微粒体的代谢产物分别可检测到2、2、6、6、7种,主要代谢产物(代谢物Ⅴ)相同,占各种属所有代谢物的百分比分别为97.73％、58.09％、89.53％、90.40％和79.06％;其他代谢产物中,除了小型猪的1个(占41.91％)、比格犬的2个(分别占6.69％和7.35％)以外,均在3％以下.钧吻素子在人肝微粒体代谢较慢,且仅代谢22.28％,而在比格犬、恒河猴代谢近50％,代谢速率和代谢率高低顺序为:恒河猴、比格犬、SD大鼠、小型猪、人.结论 不同种属肝微粒体对钩吻素子的代谢具有一定的差异,其中小型猪的主要代谢产物构成与人有明显差别,SD大鼠、恒河猴、比格犬的主要代谢产物与人相同,但代谢率和代谢速率以及其他代谢产物的构成方面也有一定的差异.
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钩吻素子对小鼠CD4+T淋巴细胞Th1类及Th2类细胞因子分泌的影响
目的:研究钩吻素子(Koumine,Kou)对小鼠CD4+T淋巴细胞Th1类及Th2类细胞因子分泌的影响.方法:分离纯化小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞,经刀豆球蛋白A(ConcanavalinA,ConA)刺激诱生细胞因子,然后加入不同浓度的Kou,继续培养24小时后离心收集细胞培养上清.用酶联免疫法(ELISA法)检测细胞上清中Th1类细胞因子IL2、IFN-γ以及Th2类细胞因子IL-4、IL-10的含量变化情况,观察药物对CD4+T淋巴细胞因子表达的影响.结果:对于Th1型细胞因子,各浓度组Kou作用24 h后均可显著降低IL-2、IFN-γ的水平,并呈剂量依赖性;对于Th2型细胞因子,Kou对IL-4表达影响不大,但中浓度组Kou(100μg/ml)可显著升高IL-10的水平.结论:对CD4+T细胞Th细胞因子分泌的调节可能是Kou治疗银屑病等T细胞活化异常炎症性疾病的免疫药理机制之一.
