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细胞色素氧化酶P450(CYP4F3A)的纯化及动力学研究
目的:纯化细胞色素氧化酶P450(CYP4F3A)以及测定酶促反应动力学参数.方法:应用免疫共沉淀技术纯化CYP4F3A酶,通过LTB4降解实验测定其米氏常数.结果:纯化的CYP4F3A浓度为0.12 mg/ml,Km=2.643±0.106 μmol/L,Vmax=24.97±1.163 nmol/(min·nmol).结论:获得从哺乳动物细胞中纯化的CYP4F3A具有较强LTB4降解活性,并通过测定其酶动力学常数,为研究CYP4F3A活性调节机制打下基础.
关键词： 细胞色素P450酶系统 CYP4F3A 白三烯B4 酶联免疫吸附测定 米氏常数 -
一种诊断用谷氨酸脱氢酶酶学性质研究
目的 研究一种国产谷氨酸脱氢酶的热稳定性、酸碱耐受性、适温度、适pH和动力学参数等性质.方法 以α-酮戊二酸、铵离子及还原型辅酶Ⅰ(NADH)为底物,在谷氨酸脱氢酶催化作用下,转变为谷氨酸和氧化型辅酶Ⅰ(NAD),利用NADH在340 nm处有吸收峰,监测其反应速率(-△A/min),计算谷氨酸脱氢酶的活力单位,采用Linewaeaver-Burk作图法(双倒数作图法)对谷氨酸脱氢酶的米氏常数进行测定.结果 谷氨酸脱氢酶于50℃保温20 min保留活力约为87.5％,而在60 ℃保温20 min后残存活力为54％;适反应温度为45℃;适反应pH为7.5;在pH为5～10范围内酸碱耐受性较好,25℃放置20 h残留活力为90％以上.结论 动力学研究表明该酶与国外知名厂家产品相差不大.
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从米氏常数(Km)的测定谈药学生物化学实验教学
在生物化学试验中,酶的米氏常数的测定实验是经典的实验.通过Km 测定这一实验的改进,指导学生怎样认识和把握理论知识,并将之应用科学研究中.在生物化学实验教学中,注意提高学生的动手能力,提高解决问题和分析问题的能力,从而形成对待实验结果和教材的正确观点.
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一种新型蚯蚓纤溶酶组分的部分性质研究
目的获得一种高效的溶栓药物.方法从赤子爱胜蚓(Eisenia foelida)中共提取6种纤溶酶组分,分别命名为F1～F6.取F1用Lowry法测定蛋白质浓度,SDS-PAGE鉴定纯度及表观相对分子质量(Mr),纤维蛋白平板法测定其纤溶活性,测定其水解BAEE(Nα-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐)、血浆纤溶酶特异性底物Chromozym PL(苄氧羰酰甘氨酰脯氨酰精氨酰对硝基苯胺盐酸盐)及组织型纤溶酶原激活剂Chromozym t-PA(N-甲磺酰苯丙酰甘氨酰精氨酰对硝基苯胺盐酸盐)的活性,并进行N端氨基酸序列测定.结果F1纯度为100%,表观Mr为28 500,总纤溶活性为65.51×103mm2/mg,水解BAEE的米氏常数(Km)为2.808 7×10-2mol/L.对chromozym PL及chromozymt-PA的亲和力较低.F1的N端氨基酸序列为ⅡGGSNASPGEFPWQ,且对天然凝血块有较强的溶解作用.结论F1为纯度很高的单一组分,纤溶活性较高.
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龙葵碱对HepG2人肝癌细胞NAT酶动力学常数的影响
目的 探讨龙葵碱对HepG2细胞NAT酶米氏常数Km及大反应速率Vmax的影响.方法 MTT法测定龙葵碱对消化系统SGC-7901人胃癌、HepG2人肝癌、Ls-174人大肠癌3种肿瘤细胞株的细胞毒作用,采用高效液相色谱(HPLC)法,以2-AF为底物,以2-AF的浓度为底物浓度,在以HepG2完整细胞及细胞质内2-AF被NAT酶乙酰化为2-AAF的速度为NAT酶的反应速率,采用双倒数作图法,以底物2-AF浓度的倒数1/S对NAT反应速率的倒数1/V作直线,得出回归方程,计算Km和Vmax.结果 MTT法测定表明龙葵碱对HepG2人肝癌细胞比较敏感,酶动力学研究表明,以2-AF为底物,对于HepG2完整细胞,阴性对照组的Km和Vmax分别为(2.37×10-3±8.37×10-5) mmol·L-1、(9.16×10-4±7.54×10-5) nmol·106 cells-1,龙葵碱组的Km和Vmax分别为(2.22×10-3±9.05×10-5) mmol·L-1和(5.14×10-4±3.72×10-5) nmol·106 cells-1.对于HepG2细胞质,阴性对照组的Km和Vmax分别为(8.95×10-3±2.61×10-4) mmol·L-1、(2.55×10-6±1.92×10-8) μmol·min-1g-1 Pro,龙葵碱组的Km和Vmax分别为(9.48×10-3±3.63×10-4) mmol·L-1和(2.43×10-6±1.32×10-8) μmol·min-1 g-1 Pro,统计学表明对于HepG2完整细胞和细胞质,阴性对照组和龙葵碱组的Km没有差异,而Vmax差异有显著性(完整细胞P<0.01,细胞质P<0.05).结论 龙葵碱是HepG2人肝癌细胞NAT酶2-AF底物的非竞争性抑制剂.
关键词： 龙葵碱 HepG2人肝癌细胞 NAT酶 米氏常数 最大反应速率 -
Hirulog-s纤溶酶促反应动力学的常数测定
Hirulog-s为军事医学科学院通过对水蛭素结构改造获得的一种新型合成水蛭肽,其序列为：( D)-FPRP-GK( Stearic acid)-GG-QGDFEPIPEDA-YDE-NH2, Hirulog-s 半衰期达到T1/2=212．2±58．4 min[1]。水蛭素具有间接促进尿激酶诱导的纤溶作用[2],为考察新型水蛭肽Hirulog-s 影响纤溶因子亲和性的程度,本文基于单链尿激酶型纤溶酶原激活剂( pro-uPA)和纤溶酶原( plg)的相互活化作用[3]研究Hirulog-s通过酶促反应动力学参数体现出来的纤溶特性。
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硼酸盐缓冲液制备尿酸酶复合脂质体及尿酸酶的特性
目的：研究硼酸-硼砂缓冲液制备的尿酸酶-过氧化氢酶脂质体（BUCLP）中尿酸酶的体外特性。方法采用逆向蒸发法制备BUCLP，并考察其部分理化性质特性。结果 BUCLP中尿酸酶适温度保持在40℃，适pH值由8.5降为8.0，而Km值也由14.207μmol/L降为13.623μmol/L；尿酸酶-过氧化氢酶（UAC）与空白纳米脂质体作用后，再与FITC结合，其荧光强度高于游离UAC与FITC结合的荧光强度，且BUCLP在280 nm处的荧光强度高于游离UAC。结论尿酸酶和过氧化氢酶联合制备成BUCLP后尿酸酶的活性增加。
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低于米氏常数底物浓度下酶动力学参数的测定
目的:联用设定底物浓度下初速度(initial velocity,Vi)和过程分析法所得酶大反应速度(maximal reaction rate,Vm)与米氏常数(Michaelis-Menten constant,kn)比值(Vm/Km),据米氏方程推算酶的Km和Vm.方法:以苛求芽孢杆菌尿酸酶(Bacillus fastidious uricase,BFU)及其突变体(A1R,A1R/V144A)、牛小肠碱性磷酸酶(calf intestinal alkaline phosphatase,CIAP)及大肠杆菌碱性磷酸酶突变体R168K为模型.用A293 nm记录尿酸酶反应曲线、A450 nm记录碱性磷酸酶水解4-硝基-1-萘基磷酸酯(4-nitro-1-naphthyl phosphate,4NNPP)反应曲线;以反应时间为自变量、用积分速度方程拟合不超过10％ Km初始底物浓度下酶反应曲线测定Vm/Km,分析设定底物浓度下初速度反应数据确定初速度Vi;据相同酶量Vi和Vm/Km按米氏方程计算Km;据所得Vm/Km和Km推算Vm.结果:以E-H(Eadie-Hofstee)法分析50％～200％ Km底物浓度下Vi所得Km均值为其参考值;联用策略测定Vi所设定的底物浓度越高,则所得Km相对偏差越小;测定Vi所设定的底物浓度从35％Km逐渐升高到120％ Km,所得Km趋于稳定且相对偏差不超过20％.据此联用策略发现,苛求芽孢杆菌尿酸酶在生理pH下活性降低的原因不是其Km明显升高,而是其Vm下降.结论:当底物溶解度低于Km时,这种联用策略更适合测定酶的Km和Vm.
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不同方法测定黄嘌呤对Bacillus fastidiosus胞外尿酸酶抑制效力的比较
筛选酶抑制剂常需测定米氏常数(Km)和大反应速度(Vm)来确定抑制常数(Ki)[1,2].双倒数分析法测定Ki效率低,且靶酶Km越高则成本越高.积分法[3,4]和线性动力学法[5,6]测定Ki所需底物浓度都高于Km,至今对高Km靶酶都测定极低底物浓度下的半抑制浓度,或再换算成抑制常数表示抑制效力.但测定低浓度底物下的初速度要求高灵敏度的定量方法.实际上在低浓度底物下用简化积分法也可测定Ki[7].Bacillusfastidiosus胞外尿酸酶Km接近0.2 mmol/L,黄嘌呤是其竞争性抑制剂[4～6].本文用低浓度尿酸,比较测定初速度确定黄嘌呤半抑制浓度和简化积分法测定黄嘌呤抑制常数的差异.
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用积分法考察黄嘌呤对Candida species尿酸酶的抑制作用
目的: 以Candida species尿酸酶为模型,考察用积分法筛选抑制剂的条件. 方法: 用293 nm吸收记录尿酸酶反应. 用反应时间为自变量的积分速度方程拟合反应曲线确定表观米氏常数(apparent Michaelis-Menten constant, Kmapp)和表观大反应速度(apparent maximal reaction rate, Vmapp). 据上述参数随抑制剂浓度的变化确定抑制类型和抑制常数(inhibition constant, Ki). 结果: 被分析数据中的畸异值显著降低结果可靠性. 通常终点底物<1/6 Kmapp而起始底物足够高,此积分法测定Kmapp的偏差和变异低于20%而Vmapp精度更高. 用积分法所得Kmapp与双倒数法一致,且和黄嘌呤浓度成正比,对应Ki为(5.4±0.8) μmol/L (n=3),也与双倒数法一致. 结论: 被分析数据精度足够高,用无抑制剂时米氏常数(Michaelis-Menten constant, Km)4倍以上的起始底物浓度并固定终点底物浓度<1/6 Km,此积分法能用于筛选特殊类型的抑制剂.
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用线性动力学方法考察黄嘌呤对尿酸酶的抑制作用
目的:以米氏常数相差较大的两种尿酸酶为模型,考察用两个底物浓度下标定比活性确定酶动力学参数和筛选抑制剂的可靠性.方法:用293 nm吸收监测尿酸酶反应.通过两个底物浓度下标定比活性确定表观米氏常数(apparent michaelis-menten constant,Kmapp)和表观大反应速度(apparent maximal reaction rate,Vmapp).据表观动力学参数随抑制剂浓度的变化确定抑制类型和抑制常数(inhibition constant,Ki).结果:只要所用尿酸浓度中较小者(the lower concentration of uric acid,SL)大于待测Km的0.8倍且较大者(the higher concentration of uric acid,SH)在SL的1.4倍以上,此线性动力学法能可靠测定Bacillusfastidiosus和Candida species尿酸酶的米氏常数,且与双倒数法结果一致.如SL大于Km的3.8倍而SH为SL的3倍,此线性动力学法所得Candida species尿酸酶Kmapp与抑制剂浓度成正比,Ki为(4.8±0.5)μmol/L,与双倒数法结果一致.Bacillus fastidiosus尿酸酶Km太高,底物浓度有限时不能用此方法筛选其抑制剂.结论:此线性动力学方法仅用高于Km的底物浓度也能可靠确定酶动力学参数,有利于用常规定量方法筛选对底物具有高亲合力特殊靶酶的抑制剂.
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一种新型蚯蚓纤溶酶的部分性质研究
为获得一种高效的溶栓药物.从赤子爱胜蚓(Eisenia foelida)中分离纯化得到了一种纤溶酶组分.用Lowry法测定蛋白质浓度,SDS-PAGE 鉴定纯度为98%,表观相对分子质量(Mr)为14850,纤维蛋白平板法测定其总纤溶活性为65.51×103 mm2/mg,直接纤溶活性为15.61×103mm2/mg,间接纤溶活性为26.34×103mm2/mg.水解BAEE的米氏常数(Km)为1.82×10-5 mol/L.水解Chromozym PL的米氏常数(Km)3.98×10-5mol/L,水解Chromozym t-PA的米氏常数(Km)5.55×10-5mol/L活性,N端氨基酸序列测定的结果为VIGGTNAIPGEFPYQ.结果表明该纤溶酶分子量较小,间接活性较高,适宜作为一种新型的溶栓药物.
