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基因修饰的永生化成纤维细胞移植治疗帕金森病研究
在体外实验的基础上,探索酪氨酸羟化酶(TH)和GTP环水解酶-1(GCH)修饰的永生化成纤维细胞混合移植对帕金森病(PD)的治疗作用.一、材料与方法1.永生化成纤维细胞制备及成纤维细胞TH基因和GCH基因修饰[1].2.大鼠偏侧PD模型制备及细胞移植:雄性SD大鼠50只,6-羟基多巴胺注射至右侧内侧前脑束制备偏侧大鼠PD模型.25只成功模型随机分为两组,治疗组14只,对照组11只.TH基因及绿色荧光蛋白(EGFP)基因修饰的成纤维细胞悬液按4∶1(v/v)的比例分别与GCH基因修饰的成纤维细胞悬液混合,分别用于治疗组和对照组.移植细胞分4点通过立体定向注射至右侧纹状体.每只大鼠移植细胞总数为2×105(体积10 μl),每点移植细胞数为4×104(体积2.5 μl).
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帕金森病大鼠黑质细胞凋亡与Bax蛋白表达的相关性
鉴于在体研究帕金森病 (Parkinson disease ,PD)模型成功前黑质细胞凋亡的研究罕见报道,我们采用神经损毁剂6-羟基多巴胺(6-OHDA)制作大鼠PD模型,采用免疫组织化学、电镜观察的方法,动态观察PD大鼠模型成功前促凋亡基因Bax蛋白表达与6-OHDA诱发的黑质细胞凋亡的关系.
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丘脑底核立体定向手术治疗帕金森病
早年认为,丘脑底核(STN)受损后有造成偏身投掷症的严重危险,故应用STN立体定向手术治疗帕金森病(PD)以往研究较少.近20年来,随着人们对基底节生理功能的进一步认识,发现STN与PD运动症状密切相关.多项动物实验证实,毁损或高频电刺激STN能减少其神经递质谷氨酸(Glu)的输出,对抗1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)和6-羟基多巴胺(6-OHDA)对多巴胺(DA)能神经元的毒性,改善动物PD症状.同时,在临床治疗上也得到初步应用,并取得较好效果.
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6-羟基多巴胺帕金森病大鼠模型的制作和行为学评价
6-羟基多巴胺能与多巴胺竞争性结合多巴胺转运体而进入细胞,通过诱发氧化应激反应、抑制线粒体功能等选择性地损害多巴胺能神经元.将这种神经毒素于大鼠中脑黑质注射,神经元发生损伤至多巴胺耗竭;于纹状体注射神经元损伤较慢呈渐进性过程.在这些情况下,神经元丢失程度都与注射部位相关.在大鼠第三脑室注射能诱发出与人类极为相似的神经元退变模式,即中脑内不同区域的DA能神经元因敏感性不同损伤程度也不同.大鼠模型的行为学评估包括药物诱发试验和非药物诱发试验,前者使用多,而后者种类较多.两种方法结合使用能使评估结果更有效、可靠.
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帕金森病动物模型的研究进展
帕金森病(Parkinson's disease,PD)动物模型的制作是PD研究的基础和关键.几十年来,建立了多种多样的PD动物模型.从早的利血平模型、甲基苯丙胺模型到6-羟基多巴胺模型和1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶模型.近发现系统的给予农药杀虫剂鱼滕酮能在大鼠模型上产生明确的PD症状.高度表达α-synuclein的转基因动物模型正被用于研究这种蛋白在多巴胺能神经元变性中的作用.在众多的模型中,6-羟基多巴胺大鼠模型和1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶灵长类模型的病理改变以及行为学表现与人类PD表现相类似,成为目前常用经典的PD动物模型.
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6-羟基多巴胺两点注射法建立帕金森病模型大鼠的行为学与组织病理学特征
目的:探讨提高6-羟基多巴胺(6-hydroxy dopamine,6-OHDA)诱发帕金森病大鼠模型成功率,并能缩短其成模周期的方法.方法:实验于2004-05-08/07-12在暨南大学医学院解剖教研室进行.采用SD雄性大鼠24只,随机分为实验组(18只),对照组(6只),通过脑内立体定向术,将6-OHDA注入实验组大鼠左侧黑质致密部(substantia nigra pars compacta,SNC)和中脑腹侧被盖区(ventral tegmental area,VTA)以建立帕金森病模型,观察大鼠行为变化及黑质细胞形态学改变.结果:实验组大鼠经APO诱导后,有15只(83.3%)向右侧旋转速度>7 r/min(30min旋转>210r),术后2周与术后3,4周之间大鼠旋转行为差异无显著性意义(P>0.05).成功模型鼠经Nissl染色可见左侧SNC和VTA区神经元数目较对侧明显减少,对照组无旋转行为和形态学改变.结论:应用6-OHDA于单侧SNC,VTA两点注射可明显提高帕金森病大鼠模型成功率,加大6-OHDA的注射剂量可以缩短其成模周期.同时,注射部位的准确性和注射速度及留针时间都至关重要.
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针对Fas基因RNA抑制作用前后帕金森病细胞相关因子变化的凋亡作用
近年来研究表明,细胞凋亡在帕金森病的病理机制中起重要作用.细胞凋亡涉及多种基因的复杂变化,其中凋亡促进基因Fas与之关系密切[1,2].基因干预可通过降低凋亡基因的表达而对细胞凋亡起到干预作用.本实验用6-羟基多巴胺作用于NGF诱导后PC12细胞,建立帕金森病细胞模型,用RNAi方法对Fas基因表达进行抑制,从而观察该方法以帕金森病细胞凋亡的影响.
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6-OHDA制备的帕金森病大鼠黑质多巴胺能神经元的形态观察
帕金森病(Parkinson's disease,PD)主要病理改变是中脑黑质多巴胺(DA)能神经元变性、死亡、缺失,黑质-纹状体DA能系统功能减退及嗜酸性包涵体(Lewy小体)形成.PD在动物中没有自发的倾向,进行PD实验研究需要建立适当的动物模型.应用神经毒素6-羟基多巴胺(6-OHDA)直接注入黑质纹状体系统毁损多巴胺能神经元所制成的模型,已被广泛应用于PD的研究.本研究旨在从超微结构水平来研究6-OHDA对DA能神经元的影响及可能的作用机制.
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帕金森病模型大鼠脑D2受体与血流灌注的对比研究(摘要)
目的对偏侧帕金森病(PD)模型大鼠脑多巴胺(DA)D2受体改变与脑血流灌注进行对比研究。方法立体定位脑黑质、腹侧被盖区,以6-羟基多巴胺定向损毁制作偏侧PD大白鼠模型,通过阿朴吗啡(Apo)诱发其向健侧旋转的转数筛选模型;并用高效液相-电化学检测器(HPLC-ECD)检测PD模型及对照组大鼠脑纹状体DA含量;采用125I-左旋-3-碘-2-羟基-6-甲氧基-N[Cl-乙基-2-吡咯烷)甲基]苯酰胺(IBZM)放射自显影图分析、99mTc-6-甲基丙二胺肟(HMPAO)大鼠脑内分布观察进行D2受体与脑血流灌注研究。结果 PD模型大鼠损毁侧(右侧)纹状体DA及其代谢产物含量比左侧(健侧或未损毁侧)及假手术对照组明显降低(P<0.05);模型组损毁侧纹状体/小脑125I-IBZM摄取比值为8.04±0.71,比健侧及假手术对照组明显增高(P<0.05),提示损毁侧纹状体D2受体出现上调效应,损毁侧比健侧增高(30.11±4.53)%,这与Apo诱导偏侧PD模型大鼠向健侧旋转的30 min转数呈良好的正相关(r=0.98)。血流灌注研究显示偏侧PD模型大鼠两侧脑区内的放射性分布差异无显著性(P>0.05)。结论偏侧PD模型大鼠损毁侧纹状体DA及其代谢产物含量降低、D2受体出现上调反应,后者与Apo诱导的行为学改变呈良好的相关性;与脑血液灌注相比较,放射性标记IBZM揭示的D2受体变化更能特异及时地反映实验性偏侧PD模型的脑功能变化。 [全文刊登于中华核医学杂志2000.20(2):59]
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侧脑室注射改构体酸性成纤维细胞生长因子对帕金森病大鼠旋转行为的影响
目的 观察改构体酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)对帕金森病大鼠模型行为学的影响.方法 采用SD雄性大鼠72只,随机分为假手术组,PD模型组,PD模型加生理盐水组(PD+NS组),PD模型加改构体aFGF组(PD+aFGF组),每组18只.通过脑内立体定向术,将6-OHDA注入后3组大鼠左侧黑质致密部(substantia nigra pars compacta,SNC)和中脑被盖腹侧区(ventral tegmeatal area,VTA)以建立帕金森病模型,PD+Ns组于术后第1天起每隔2d于右侧侧脑室注射10μl Ns,PD+aFGF组于术后第1天起每隔2d于右侧侧脑室注射10μl改构体aFGF(0.2μg/μl),假手术组只进行假手术处理,分别于术后4d,1,2,3,4周用阿扑吗啡(apomorphine,APO)给大鼠腹腔注射(0.5mg/kg),观察并记录大鼠行为学变化情况.结果 假手术组均未出现旋转行为,PD模型组和PD+Ns组大鼠旋转启动时间逐渐缩短,持续时间逐渐延长,旋转速度逐渐加快,至术后2周旋转行为趋于稳定;在术后2周,PD+aFGF组旋转启动时间[(5.50±1.18)min],较PD模型组[(3.60±1.17)min,P<0.05]和PD+Ns组[(3.10±1.02)min,P<0.05]明显延长;PD+aFGF组旋转持续时间[(25.90±8.80)min],较PD模型组[(55.40±10.14)min,P<0.05]和PD+Ns组[(53.90±12.27)min,P<0.05]明显缩短;PD+aFGF组旋转平均速度[(6.52±1.34)r/min],较PD模型组[(12.90±2.21)r/min,P<0.05]和PD+Ns组[(11.80±3.65)r/min,P<0.05]明显减慢.术后3周、4周,大鼠旋转行为各项指标统计学分析结果 与术后2周相同.结论 PD模型大鼠具有明显得行为学改变,改构体aFGF能明显改善大鼠的旋转行为.
关键词: 帕金森病 改构体酸性成纤维细胞生长因子 羟基多巴胺 大鼠 旋转行为 -
帕金森病模型大鼠中脑腹侧被盖区酪氨酸羟化酶免疫阳性神经元的改变
目的 探讨帕金森病(PD)模型大鼠中脑腹侧被盖区(VTA)酪氨酸羟化酶(TH)免疫阳性神经元的改变.方法 将6-羟基多巴胺(6-OHDA)分别注入实验组大鼠左侧黑质致密部和中脑被盖腹侧区以建立帕金森病模型,于术后4d、7d、14d、21d、28d腹腔注射阿扑吗啡(apomorphine,APO),观察并记录大鼠行为学变化情况,利用Nissl染色、酪氨酸羟化酶(TH)免疫细胞化学染色观察大鼠中脑腹侧被盖区神经组织及TH免疫阳性神经元的改变.结果 APO诱发实验组PD大鼠均向健侧(右侧)旋转,旋转启动时间逐渐缩短,持续时间逐渐延长,旋转速度逐渐加快,至术后2周旋转行为趋于稳定;Nissl染色见实验组PD大鼠损毁侧(左侧)中脑VTA区神经元数目显著减少,尼氏体模糊,颗粒及密度均降低,伴有大量胶质细胞增生,术后2周、4周注射侧神经元数目较术后1周明显减少(P<0.05);实验组PD大鼠损毁侧(左侧)中脑VTA的TH阳性神经元明显减少,神经元胞体轮廓及突起不清晰,TH阳性纤维也明显减少,分布稀疏,术后2周、4周注射侧阳性神经元数目较术后1周明显减少(P<0.05).结论 PD大鼠损毁侧中脑VTA神经组织有明显破坏,TH阳性神经元显著减少,提示中脑腹侧被盖区TH免疫阳性神经元的改变参与了PD模型大鼠的病理学变化.
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毁损大鼠纹状体帕金森病模型的建立
近来研究发现,经典黑质损伤帕金森氏病(Parkinson's disease,PD)大鼠模型有以下不足:①毁损为急性(24 h内)过程,不符合人类PD进行性变性特征;②对黑质损伤较完全彻底,即建立的仅是晚期PD动物模型;③黑质致密部(substantia nigra pars compacta, SNc)相对较小、定位困难,模型成功率较低,一般为30%~40%左右[1].近,Ichitani[2]和Espino等[3]将6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)注入纹状体,发现黑质也可出现不同程度变性.借此,我们将6-OHDA注入纹状体,通过行为及免疫组化证实,成功地建立了纹状体损伤PD大鼠模型,为早、中期PD研究奠定了实验基础.
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应用6-羟基多巴胺建立帕金森病模型大鼠黑质神经组织病理学变化
目的 观察帕金森病(PD)模型大鼠黑质神经组织病理学及黑质神经元超微结构的变化,探讨这些变化在PD发病过程中的作用.方法 将6-OHDA分别注入实验组大鼠左侧黑质致密部和中脑被盖腹侧区以建立帕金森病模型,利用Nissl染色、酪氨酸羟化酶(TH)免疫细胞化学染色观察大鼠黑质神经组织病理学改变;利用电子显微镜观察黑质神经元超微结构的变化.结果 实验组大鼠在术后各时间点左侧(损毁侧)黑质TH阳性神经元均较右侧有显著减少,比较实验组各时间点大鼠左侧黑质TH阳性神经元发现,术后14,28 d均较同组术后7d有显著减少,实验组大鼠黑质神经元超微结构明显受损,出现核固缩,线粒体肿胀、嵴消失,粗面内质网扩张、脱颗粒,以及突触前后膜肿胀,突触间隙消失等改变;对照组大鼠无形态学改变.结论 PD大鼠损毁侧黑质TH阳性神经元显著减少,黑质神经元超微结构有明显改变,这种超微结构的改变可能是神经元坏死减少的原因之一.