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阵发性睡眠性血红蛋白尿症的嗜水气单胞菌溶素变异体检测
目的 建立用荧光标记的嗜水气单胞菌溶素变异体(Flaer)检测阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)的方法,并同传统的CD55、CD59测定进行比较.方法 分离PNH患者和相关的正常对照外周血及骨髓单个核细胞,检测Flaer、CD55、CD59的表达,并进行比较.结果 成功建立了Flaer的检测方法.同传统的CD55、CD59相比,Flaer检测的敏感性及特异性与其相似,从散点图上更为清晰、明显;对外周血微小PNH克隆及骨髓CD34+细胞中的异常克隆的检测,Flaer更为准确(P＜0.05).结论 Flaer是除CD59、CD55以外,检测PNH、尤其是微小PNH克隆的良好方法,将大大提高PNH诊断的准确率.
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铁离子对Caco-2细胞内钙离子转运的影响及钙离子浓度变化与细胞凋亡关系的研究
目的研究细胞外铁离子(Fe3+)浓度变化对钙离子(Caco-2)细胞内Ca2+转运的影响及细胞内钙离子浓度升高与Caco-2细胞凋亡的关系.方法采用激光共聚焦扫描显微镜和流式细胞技术进行观察与检测.结果(1)利用激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)观察发现,随着Caco-2细胞外Fe3+浓度的减少(DFO终浓度为100～300μmol/L),Ca2+向细胞内的转运量增加;而随着细胞外Fe3+浓度的增加(FAC终浓度为10～100μmol/L),Ca2+向细胞内的转运呈降低趋势;(2)经A23187和Fluo-3/AM处理后Caco-2细胞的存活率较高,达90%以上(用荧光素二醋酸酯检测);(3)A23187升高Caco-2细胞的胞内Ca2+浓度,呈剂量依赖性;经流式细胞技术(FCM)检测发现胞内Ca2+浓度增加具有诱导Caco-2细胞凋亡的作用.结论Caco-2细胞外Fe3+浓度的减少有促进Ca2+向细胞内转运的作用,但胞外Fe3+浓度增加时有抑制Ca2+向胞内转运的作用;胞内Ca2+浓度增加对Caco-2细胞凋亡具有诱导作用.
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硒对MNNG诱导大鼠胃癌形成过程中肾上腺皮质酶活性的影响
目的 观察硒在抗肿瘤发生过程中对大鼠肾上腺皮质3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD)、琥珀酸脱氢酶(SDH)和脂类的影响.方法 给断乳1周的雄性Wistar大鼠以N甲基-N'-硝基-N亚硝基胍(MNNG)20 mg/kg灌胃,每天1次,连续10 d,以诱导大鼠胃黏膜异倍体形成(大鼠胃癌模型).在灌胃前和灌胃后以普通饲料、低硒和高硒饲料等分别喂养.第25周时,用流式细胞仪测定硒对大鼠胃幽门黏膜异倍体形成的影响;同时用组织化学方法观察硒(0.2 mg/kg及2.0 mg/kg)在预防大鼠胃黏膜异倍体形成过程中,大鼠肾上腺皮质细胞中脂类以及SDH和3β-HSD的组织化学变化.结果 1.硒能抑制大鼠胃黏膜异倍体形成;2.实验对照组与正常对照组相比,大鼠肾上腺皮质细胞3β-HSD和SDH组织化学反应明显增强(P＜0.01),而肾上腺皮质细胞的脂滴含量明显减少(P＜0.01);3.加硒实验各组与实验对照组相比,大鼠肾上腺皮质3β-HSD和SDH组织化学反应均减弱,尤以给MNNG前喂饲高硒饲料组减弱更明显,具有显著性差异(P＜0.05);而肾上腺皮质细胞的脂滴含量均增多;尤以给MNNG前喂饲高硒饲料组增多更明显,与实验对照组相比具有显著性差异(P＜0.05).结论 硒能抑制大鼠胃黏膜异倍体形成;MNNG所致大鼠胃黏膜细胞异倍体的形成和发展过程中其肾上腺皮质细胞功能发生明显变化;硒在预防大鼠胃黏膜异倍体形成过程中对大鼠肾上腺皮质细胞的功能也有一定的影响.
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白血病干细胞生物学特性的研究
目的 通过对白血病原代细胞的体外培养,研究白血病干细胞(LSC)的生物学特性.方法 分离18例白血病患者骨髓或外周血中单个核细胞(MNC),在体外进行培养观察,并用流式细胞术方法检测分离的MNC中LSC的数量及和细胞表面标记.结果 从白血病患者中分离的MNC在体外培养1周后基本死亡.流式检测分离的MNC中免疫表型是CD34+CD38-CD123+的细胞群约有0.676%(0.03%～2%).结论 白血病干细胞难以在体外培养生长及扩增.外周血及骨髓中分离白血病患者的单个核细胞中,极少部分细胞表达干细胞标志.
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用改良地高辛标记原位杂交方法检测Ly49CmRNA表达
由Ly49C在细胞免疫调节中传导抑制性信号,推测该分子与移植免疫耐受有关.国内外大多数的研究是用单克隆抗体方法检测该分子的膜表达,但是试剂价格昂贵,且需要特殊实验设备(如免疫荧光显微镜、流式细胞仪等),不利于推广应用.我们根据核酸杂交原理,从减少组织细胞的破坏、降低成本两方面,对地高辛标记原位杂交方法进行了改良,并应用改良后的原位杂交方法在培养细胞的甩片上检测Ly49CmRNA的表达,具有特异、清晰、低成本、简单等特点[1].介绍如下.
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从组织切片上分离单个细胞的相关技术及其应用前景
1 从组织切片上分离单细胞方法的建立从组织切片上进行单个细胞分离,并扩增出靶DNA片段的技术是1993年由德国科隆大学的Hansmann等[1]建立起来的一项新技术,并将其称为分子组织学技术(molecular histology).该方法的大优点在于能够针对所需研究的细胞,将组织形态和分子生物学技术密切结合,特别适用于细胞组成复杂的病变.同年,Trumper等用霍奇金病(HD)淋巴结制备细胞悬液,结合免疫组织化学,用微操纵器从细胞悬液中提取单个Reed-Sternberg(RS)细胞,并成功地进行了聚合酶链反应(PCR)[3].两种方法相比较,前者更具优势,因为从组织切片上提取单个细胞,能密切结合形态学特征,更为直观和准确,同时也能将目的细胞与周围微环境中的背景细胞作相关性研究.获得单个细胞还有其他方法,如流式细胞仪、密度梯度离心、高梯度磁性细胞筛选,但细胞体积较大时,这些方法易导致细胞碎裂,而从组织切片上提取单个细胞不存在类似问题[4].
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激光照射对弓形虫速殖子作用的流式细胞分析
用流式细胞术(FCM)检测分析了激光照射对弓形虫RH株速殖子的作用.结果显示,激光照射后弓形虫速殖子群体DNA含量分布发生改变, DNA含量的第1道数峰值(平均值)左移,第1峰值分布范围内速殖子数占总速殖子数百分率增加,3.5 W和4.5 W剂量照射组与对照组相比差异存在显著性(P<0.05).提示激光照射能抑制弓形虫DNA的合成,减少弓形虫群体DNA的含量.
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细粒棘球蚴囊液对外周血淋巴细胞的影响
目的研究细粒棘球蚴囊液对健康人外周血单个核细胞(PBMC)及Jurkat T淋巴细胞等的影响. 方法 PBMC及Jurkat T淋巴细胞用含不同浓度(1 000、100和10 μg/ml)囊液的DMEM培养基培养5 d后,台盼蓝染色检测细胞活力.用含植物血凝素(PHA)的DMEM培养基培养PBMC,以 MTT法观察PBMC增殖情况,用流式细胞仪检测CD4+、CD8+细胞数量及CD4+/CD8+值,用原位末端标记法和Hoechst33258荧光染色法检测PBMC细胞凋亡. 结果各浓度囊液对PBMC和Jurkat T淋巴细胞未显示出毒性作用.囊液不影响PHA 对PBMC的增殖功能.在1 000 μg/ml囊液组CD4+、CD8+细胞数量与空白对照组(CD4+: 72.08±4.10,CD8+:29.32±2.62)相比,CD4+(49.32±8.32)显著减少(P<0.05),CD8+数量(32.02±6.57)略增加(P>0.05),CD4+/CD8+比值减少.未见细胞凋亡现象.结论细粒棘球蚴囊液对外周血单个核细胞的生长无抑制作用,但可以使CD4+、CD8+细胞的数量和比例改变,向Th2免疫抑制方向转变.
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流式细胞术检测红细胞渗透脆性试验方法的建立
目的:建立流式细胞术检测红细胞渗透脆性的方法.方法:将红细胞悬浮于由Nacl液和去离子水制备的不同浓度低渗盐溶液(0.70 ml生理盐水+0.3 ml去离子水,0.60 ml生理盐水+0.40 ml去离子水和0.55 ml生理盐水+0.45 ml去离子水)中,利用流式细胞仪及时测定残留红细胞数量.结果:3种NaCl稀释浓度中,流式细胞仪检测的不同时间区域剩余红细胞数量百分比差别不大.选取B+C+D+E+F+G区域比较,不同NaCl稀释浓度下3组的剩余红细胞数量百分比均有差异;正常对照组的剩余红细胞百分比显著低于血红蛋白病组;遗传性球形红细胞增多症(hereditary spherocytosis,HS)组显著低于血红蛋白病组和正常组(P＜0.05).3种不同稀释浓度比较发现,第2种浓度(0.60 ml N.S.+0.40 ml H2O)更适合于本实验室Beckman-Coulter流式细胞仪FC500对遗传性球形红细胞增多症的筛查.结论:选用流式细胞术检测红细胞渗透脆性简单、快速、客观、经济.本方法可能是一种非常有效的对遗传性球形红细胞进行初筛的方法.
关键词： 遗传性球形红细胞增多症 流式细胞仪 红细胞渗透脆性 -
以天青A染料显示DNA的染色方法
对肿瘤细胞核中的脱氧核糖核酸(DNA)含量进行测定,根据其倍体及细胞周期情况对肿瘤细胞的良恶性、恶性程度以及预后加以判断,称为DNA定量分析.能进行这种测定的主要有流式细胞仪和图像细胞仪两种.图像细胞仪分析由于具有直观、标本适用性广等特点深受广大病理工作者的青睐.DNA图像细胞分析首先必须进行DNA染色,传统的染色方法是Feulgen法,所用染料为碱性品红.我们采用天青A作为染料,替代碱性品红,取得了良好的DNA染色效果.
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呼吸道病毒感染患儿外周血淋巴细胞亚群测定及临床意义
目的 分析呼吸道合胞病毒(humanrespiratory syncytial virus,HRSV)、副流感病毒3型(humanparainfluenza virus Ⅲ,HPIV3)和鼻病毒(human rhinovirus,HRV)感染患儿外周血T淋巴细胞亚群、B淋巴细胞及NK细胞的变化,并探讨其临床意义.方法 病例对照研究.收集2014年2月-2014年11月河北省儿童医院146例急性呼吸道感染患儿标本,应用GeXP多重基因表达系统及RT-PCR扩增技术检测20种常见呼吸道病毒,选择呼吸道合胞病毒感染50例,副流感病毒Ⅲ型感染46例,鼻病毒感染50例.50名健康儿童作为对照组.采用流式细胞仪检测病毒感染患儿及健康对照组儿童外周血T淋巴细胞亚群、B淋巴细胞和NK细胞值.病毒感染组与正常对照组的比较采用两独立样本比较的Mann-Whitney U检验,不同病毒感染组间的比较采用多个独立样本比较的Kruskal-Wallis H检验.结果 HRSV组、HPIV3组和HRV组患儿外周血CD3+、CD8+、CD3+ CD4+ CD8+、CD56+水平均明显低于健康对照组(P1均分别为＜0.001,＜0.001,＜0.001,和0.002;P2分别为＜0.001,＜0.001,0.002和0.043;P3分别为＜0.001,＜0.001,0.001和＜0.001),CD19+水平及CD4 +/CD8+比值较对照组均显著升高(P1为0.004和＜0.001;P2、P3均＜0.001).HRSV组和HPIV3组患儿的外周血CD4+水平较对照组明显升高(P分别为＜0.001和0.001),但HRV组患儿外周血CD4+水平与对照组相比,差异无统计学意义(P=0.319);三组病毒感染组分别比较,HRSV组和HRV组CD4+水平(P =0.034)和CD4+/CD8+比值(P=0.018)差异有统计学意义,其他均无统计学意义.结论 HRSV、HPIV3及HRV感染均可导致机体细胞免疫功能明显紊乱,且三种病毒感染后外周血淋巴细胞亚群变化趋势一致,均可使病情恶化或病程延长.及时准确的了解病毒感染患儿外周血淋巴细胞亚群的变化能更好地认识疾病的转归,且有助于指导临床的治疗.
关键词： 呼吸道感染 GeXP多重基因表达系统 淋巴细胞亚群 流式细胞仪 -
内毒素诱导的肺损伤与CD26/CD30表达的动态研究
目的 探讨脓毒症小鼠外周血淋巴细胞TH1/TH2应答模式偏移的动态性变化.方法 采用尾静脉注射LPS建立小鼠肺损伤模型,用流式细胞术检测CD26+/CD30+,以判断TH1、TH2细胞的分化情况及TH1/TH2应答模式的偏移状况.结果 LPS组的CD26+T细胞在注射后7 h已有明显增多,并在注射后14 h达到峰值,38 h降至低点,而后各时点表达率的变化则趋于平稳,保持在正常对照组水平附近.CD30+T细胞亦从注射后7 h开始增加,并于注射后38 h达峰值,随后缓慢下降(P＜0.01).肺组织病理切片显示注射后38 h小鼠发生肺组织损伤.结论 TH1/TH2应答模式向TH2方向的偏移以及细胞免疫抑制可能是LPS诱导的肺损伤的重要因素.
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IL-2调节人外周血T淋巴细胞CTLA-4表达
目的探讨人外周血T淋巴细胞CTLA-4的表达情况及IL-2对其表达的调节作用. 方法采用流式细胞仪定量测定人外周血T淋巴细胞内及细胞膜上CTLA-4的水平,半定量RT-PCR检测T淋巴细胞内CTLA-4 mRNA的水平,并在体外用IL-2刺激T淋巴细胞后观察CTLA-4及CTLA-4 mRNA水平的变化. 结果人外周血T淋巴细胞膜表面几乎不表达CTLA-4,7.6%～18.0%的T淋巴细胞有胞内表达,CD4+T淋巴细胞表达CTLA-4的阳性比例略高于CD8+T淋巴细胞;人T淋巴细胞可溶性形式的CTLA-4 mRNA半衰期短于全长CTLA-4 mRNA;IL-2可以通过诱导人T淋巴细胞CTLA-4 mRNA的转录上调CTLA-4的表达,IL-2诱导的细胞多为CD25+T淋巴细胞. 结论 CTLA-4多存在于人外周血T淋巴细胞内,参与T淋巴细胞活化过程的调节.IL-2的免疫抑制作用可能与其诱导T淋巴细胞内CTLA-4 mRNA转录,从而上调CTLA-4的表达有关.
关键词： 淋巴细胞相关性抗原-4 T淋巴细胞 白细胞介素-2 流式细胞仪 聚合酶链式反应 -
再生障碍性贫血骨髓T淋巴细胞高表达肿瘤坏死因子
由免疫介导的造血功能抑制在再生障碍性贫血(AA)的发病过程中起重要作用,本研究应用流式细胞仪跟踪分析T细胞活化与TNF-α释放的相关性,并观察其在AA中不同T细胞亚群的变化,探讨T细胞极化与AA临床转归的相关性.
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以Rev依赖性凋亡增强HIV-1gp160的抗原性
目的检测Rev(HIV的调控基因)依赖性肿瘤坏死因子受体(TNFR-1)和gp160双重表达质粒pDM128-TNFR-1(pT128)的凋亡诱导功能. 方法采用基因枪转导及流式细胞仪检测新质粒的表达功能. 结果新结构具有特异的选择性表达作用.当Rev存在时,能间接表达TNFR-1,明显诱导HeLa细胞凋亡,使绿荧光细胞百分率非常显著地低于阴性对照(P＜0.01).等质量转染时,TNFR-1表达量少于Hu p60 TNFR-1的pDC302(pT60),故间接表达不及单纯pT60的直接表达,绿荧光细胞百分率显著高于pT60转染组(P＜0.01).培养40?h,才有明显杀伤功能并接近单纯pT60,差异无显著性(P＞0.01).单纯pT128不能直接表达TNFR-1,绿荧光细胞百分率非常显著地高于单纯pT60转染组(P＜0.01),接近阴性对照,培养40?h时差异无显著性(P＞0.01).当AD8或pMD+pRnv存在并表达Rev时,pT128均能表达TNFR-1,杀伤HeLa细胞,绿荧光细胞百分率非常显著地低于阴性对照(P＜0.01).pT128与pRev或AD8转染人正常的角质生成细胞时,能表达TNFR-1,诱导细胞凋亡.培养72?h后,阴性对照和单纯pT128组的绿荧光角质生成细胞数皆显著地超过pT128+pRev和pT128+pAD8组(P＜0.01). 结论 pT128可调控的凋亡诱导保证了HIV DNA疫苗足量的抗原表达、凋亡体形成、APC表型激发及特异性抗凋亡体免疫记忆建立.单纯pT128并不对机体产生明显伤害.此结构还适用于不同类型的HIV抗原表达系统并具有HIV感染细胞杀伤功能,能够方便地在人皮肤中表达抗原,诱导凋亡体形成.可作为HIV DNA疫苗的研究策略之一.
关键词： RNA结合蛋白 Rev反应区 肿瘤坏死因子受体-1 基因枪 流式细胞仪 -
CRTH2在特发性血小板减少性紫癜T细胞亚群表达的检测
目的研究CRTH2在特发性血小板减少性紫癜(ITP)患儿外周血T淋巴细胞亚群的表达及其意义. 方法收集ITP患儿及健康儿童外周抗凝静脉血,分离纯化T细胞,以PE标记的抗CRTH2单抗和Cy5标记的抗CD4、CD8单抗作双色流式细胞术,分析CRTH2在ITP患儿CD4+、CD8+ T细胞表达的水平. 结果 ITP患儿外周血T细胞与健康儿童相比,CD4+细胞百分率及CD4+/CD8+比例明显下降(P＜0.05),CD8+细胞百分率无明显变化(P＞0.05);CD4+CRTH2-及CD4+CRTH2+细胞百分率明显下降(P＜0.05),CD8+CRTH2-及CD8+CRTH2+细胞百分率无明显变化(P＞0.05),CD4+CRTH2-/CD4+CRTH2+及CD8+CRTH2-/CD8+CRTH2+比例明显升高(P＜0.05). 结论 ITP患儿外周血存在T细胞亚群比例失衡,呈明显TH1类细胞优势,T细胞亚群比例失衡与该病的免疫发病机制有关.
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结肠癌患者肿瘤浸润淋巴细胞CD28表达的检测及临床意义
共刺激分子CD28主要表达于T淋巴细胞上,与活化B淋巴细胞上的B7相互作用后产生的"第二信号"才能使T细胞活化,形成免疫应答.肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)是主要存在于肿瘤间质内的T细胞为主的一个异质性淋巴细胞群体,研究发现,淋巴细胞浸入到肿瘤组织内是体内免疫系统对肿瘤的抵抗现象,肿瘤部位的淋巴细胞浸润程度愈高,患者预后愈好[1].为研究肿瘤组织TIL中T淋巴细胞变化与疾病的关系,我们采用流式细胞仪对48例结肠癌患者肿瘤组织中TIL细胞CD28的表达进行了检测,以探讨其变化及临床意义.
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功能性TCR Vβ分布的简便快速检测方法的建立
研究T细胞受体基因库(TCR)的分布及其可能抗肿瘤、抗病毒的细胞免疫机制具有重要的理论意义和潜在的临床运用价值.为简便、快速地检测机体TCR基因库的变化,采用流式细胞仪的三标记(PE-,FITC-,PECy5-)直接检测技术,利用不同标记的21种特异性Vβ单抗,科学地分为7组,建立了简便、快速检测人功能性TCR库的试剂盒,该试剂盒可以覆盖60% TCRαβ基因库.tube 1- tube 7在CD3-PECy5窗口下较好地检测了Vβ的分布. 该分组在同一标本中反复检测10次,其检测Vβ值的变异系数CV<0.02.同时,用单抗阻断实验证实了其检测的特异性,即在各组中分别加入(20-50)μg/ml纯化Vβ单抗, 可以分别阻断相应的标记Vβ单抗.
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川崎病患者淋巴细胞P53基因的检测及临床意义
为探讨急性期川崎病(KD)患者外周血淋巴细胞凋亡延迟的机理,我们采用斑点杂交(Dot-blot)和流式细胞仪(FCM)分别检测KD患者淋巴细胞P53基因mRNA及蛋白质表达水平.
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NKG2D配体在鼻咽癌细胞的表达及其对NK细胞杀伤活性的影响
NK细胞对靶细胞的杀伤活性与其细胞表面的受体和靶细胞表面的配体密切相关,NKG2D为NK细胞活化性受体,表达于所有的NK细胞表面,是介导NK细胞识别和溶解肿瘤细胞的主要活化性受体.NKG2D配体为MHC Ⅰ类链相关基因产物(MICA、MICB)及ULBPS(人巨细胞病毒UL16蛋白的结合蛋白ULBP1、ULBP2、ULBP3),NKG2D的配体在多种肿瘤细胞表达,其在鼻咽癌细胞的表达尚未见报道.本文通过流式细胞仪技术探讨其在鼻咽癌细胞CNE2的表达情况,并进一步分析其在NK细胞杀伤CNE2细胞中的作用.
