基因枪转导K-RAS反义基因对胰腺癌细胞(K-RAS P21)蛋白表达的影响

目的 观察基因枪转导K-RAS突变特异性反义基因对胰腺癌细胞K-RAS P21蛋白的影响.方法 利用基因枪技术,将反义基因转导入宿主细胞,通过免疫细胞化学和Western blot方法,观察K-RAS突变特异性反义基因转导后AsPC-1、MiaPaCa-2和BxPC-3三种人胰腺癌细胞系K-RAS P21蛋白的变化.结果 转导K-RAS突变特异性反义基因后,AsPC-1和MiaPaCa-2胰腺癌细胞的K-RAS P21蛋白表达明显降低;BxPC-3胰腺癌细胞的K-RAS P21蛋白表达无明显变化.结论 突变特异性K-RAS反义基因经基因枪有效转导后,可用于胰腺癌的治疗.

乙脑病毒prME蛋白编码基因表达分析及不同DNA免疫方法比较

将构建的含流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV) prME蛋白编码基因的重组质粒(pJME)以不同浓度(10μg、5μg以及3μg)分别转染于HepG2细胞中,Western blot法分析重组质粒表达特点,肌肉与基因枪注射方式将pJME免疫BALB/c鼠,二次免疫后3周,腹腔注射乙脑病毒JaGAr-01株,105 PFU/100μl作为病毒攻击观察21 d.

IL-2 preS DNA疫苗免疫正常小鼠和HBV转基因鼠的免疫应答研究

目的探讨IL-2 preS DNA疫苗作为预防和治疗性疫苗的可行性及作用机理. 方法应用基因重组技术,构建人白细胞介素2(hIL-2)和前表面抗原(preS)的真核表达载体,将此重组载体用基因枪分别注射正常的BALB/c小鼠和HBV转基因小鼠,通过ELISA方法检测BALB/c小鼠和HBV转基因鼠的抗-preS2、HBsAg及抗-HBs抗体水平;荧光定量PCR方法检测HBV转基因鼠血清中HBV DNA拷贝数,并用免疫病理HE染色观察小鼠肝组织炎症活动度,同时检测肝功能指标. 结果①基因枪注射真核表达质粒免疫正常小鼠后,100%小鼠能在第4、6周检测到抗preS1抗体,持续时间长达10周.②用IL-2 preS真核表达质粒基因枪肌肉注射方式优于正常肌肉注射和皮下注射的方式,且所需质粒量(10μg/只)仅为后者(100μg/只)的1/10.③在第4周高峰期检测IgG亚类,是诱导以TH1(IgG2a)细胞免疫为主的反应.④基因枪注射真核表达质粒(1μg/只)免疫转基因小鼠后,80%的小鼠产生了抗体,HBV DNA量下降,其中20%的小鼠HBsAg转阴.⑤HE肝组织染色显示:肝组织有明显的炎细胞浸润、肝细胞肿大、颗粒样变性、转氨酶升高. 结论 IL-2 preS DNA疫苗能刺激小鼠机体产生体液和细胞免疫,可部分打破小鼠机体的免疫耐受,为新型乙肝疫苗和抗HBV持续性感染的特异性免疫治疗剂的设计和构建提供理论与实践依据.

以Rev依赖性凋亡增强HIV-1gp160的抗原性

目的检测Rev(HIV的调控基因)依赖性肿瘤坏死因子受体(TNFR-1)和gp160双重表达质粒pDM128-TNFR-1(pT128)的凋亡诱导功能. 方法采用基因枪转导及流式细胞仪检测新质粒的表达功能. 结果新结构具有特异的选择性表达作用.当Rev存在时,能间接表达TNFR-1,明显诱导HeLa细胞凋亡,使绿荧光细胞百分率非常显著地低于阴性对照(P＜0.01).等质量转染时,TNFR-1表达量少于Hu p60 TNFR-1的pDC302(pT60),故间接表达不及单纯pT60的直接表达,绿荧光细胞百分率显著高于pT60转染组(P＜0.01).培养40?h,才有明显杀伤功能并接近单纯pT60,差异无显著性(P＞0.01).单纯pT128不能直接表达TNFR-1,绿荧光细胞百分率非常显著地高于单纯pT60转染组(P＜0.01),接近阴性对照,培养40?h时差异无显著性(P＞0.01).当AD8或pMD+pRnv存在并表达Rev时,pT128均能表达TNFR-1,杀伤HeLa细胞,绿荧光细胞百分率非常显著地低于阴性对照(P＜0.01).pT128与pRev或AD8转染人正常的角质生成细胞时,能表达TNFR-1,诱导细胞凋亡.培养72?h后,阴性对照和单纯pT128组的绿荧光角质生成细胞数皆显著地超过pT128+pRev和pT128+pAD8组(P＜0.01). 结论 pT128可调控的凋亡诱导保证了HIV DNA疫苗足量的抗原表达、凋亡体形成、APC表型激发及特异性抗凋亡体免疫记忆建立.单纯pT128并不对机体产生明显伤害.此结构还适用于不同类型的HIV抗原表达系统并具有HIV感染细胞杀伤功能,能够方便地在人皮肤中表达抗原,诱导凋亡体形成.可作为HIV DNA疫苗的研究策略之一.

基因枪注射GM-CSF基因同时局部注射肿瘤提取物治疗肿瘤的初步观察

GM-CSF具有刺激树突状细胞分化成熟、诱导粒细胞和巨噬细胞系增殖分化以及调节免疫应答的作用。在已知的细胞因子中，GM-CSF是抗肿瘤免疫治疗中重要的因子之一〔1〕。以GM-CSF为基础的肿瘤免疫治疗已进行了较深入和广泛的临床实验，并展现了较好的应用前景〔2〕。为了进一步探讨高效方便的肿瘤免疫治疗新方法，我们用基因枪将含小鼠GM-CSF基因的载体注射于小鼠局部皮肤，于注射部位接种小鼠肿瘤细胞的冻融上清，观察小鼠产生抵抗肿瘤细胞攻击的能力。

基因枪介导的neu基因DNA疫苗抗肿瘤作用的实验研究

目的探讨DNA疫苗pWRG-neu的皮内免疫,对高表达neu基因的小鼠移植瘤生长和转移的抑制作用.方法向小鼠黑色素瘤B16F10细胞系转染pcDNA-neu,用有限稀释法筛选一株高表达neu基因的细胞株B16F10-neu.在基因枪介导下,向C57BL/6小鼠导入DNA疫苗pWRG-neu,通过观察免疫动物的生存期,评价DNA疫苗的抗肿瘤作用.分离免疫动物脾细胞,经自体淋巴细胞混合培养实验,分析DNA疫苗体内免疫后机体的CTL应答.结果筛选到一株高表达neu基因的B16F10-neu细胞株,转基因过程和外源基因的表达没有改变细胞系的增殖特性.用基因枪轰击,进行DNA疫苗pWRG-neu皮内免疫,对小鼠黑色素瘤B16F10-neu进行预防、治疗和抗转移的实验研究,结果表明,DNA疫苗的免疫能够明显推迟移植瘤的生长,延长小鼠生存期,获得明显的抗肿瘤效果.DNA疫苗免疫后可诱导小鼠脾淋巴细胞CTL活性.结论基因枪介导的DNA疫苗pWRG-neu经皮内免疫,能够有效的诱导机体的细胞免疫应答,预防和治疗小鼠移植瘤的发生,并有一定的预防肿瘤肺转移的作用.

TwHMGR过表达对雷公藤甲素和雷公藤红素生物合成的影响

雷公藤3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(Tripterygium wilfordii 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme-A reductase,TwHMGR,GenBank:ALU11310.1 3)是MVA途径中的第一个限速酶,是细胞质中萜类代谢途径中的重要调控位点.为探讨TwHMGR对雷公藤甲素和雷公藤红素生物合成的影响,对其进行了过表达研究.利用Gateway技术将TwHMGR的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)构建到过表达载体中,通过基因枪介导过表达载体转入雷公藤悬浮细胞.qRT-PCR结果显示TwHMGR的基因相对表达量在过表达组显著提高,是空载体组基因相对表达量的1.75倍;UPLC结果显示雷公藤甲素及雷公藤红素含量在过表达组中分别提高为空载组的163.93％和190.04％.本实验中TwHMGR在雷公藤悬浮细胞中成功过表达,表现为基因相对表达量的上升和雷公藤甲素及雷公藤红素含量的上调,证明了TwHMGR在雷公藤萜类成分生物合成途径上的正向调节作用,为雷公藤重要活性萜类成分的合成生物学研究奠定了基础.

非病毒基因递送技术研究进展

基因递送是生物学和医学研究中一项重要且常用的技术,分为病毒感染法和非病毒转染法两大类.病毒载体具有较高转染效率,但产生不良反应等缺陷限制了其应用.非病毒载体具有低细胞毒性、低免疫原性、生物相容性好、可以生物降解等优点,而且不受基因大小的限制,具有很好的应用前景,但转染效率不高是其主要的瓶颈,目前研究人员正致力于寻找和开发高效率的非病毒转染方法.文中阐述了几种主要的生化转染法(阳离子多聚物、阳离子脂质体、磷酸钙)及物理转染法(电穿孔、超声/微气泡、显微注射和基因枪)的原理、优缺点以及研究进展.

DNA疫苗的研究现状

DNA疫苗的概念提出已有十几年的时间,其间针对DNA疫苗的研究工作取得了很大进展,其有效性已在动物体内得到了验证,而且部分疫苗已进入临床试验阶段,但在取得进展的同时也遇到了许多制约其发展的难题.本文对DNA疫苗发展现状,遇到的问题,采取的策略及可能引起的副反应加以综述.

基因枪转人碱性成纤维细胞生长因子基因促进深Ⅱ度烧伤创面的愈合

背景:大量的体内和体外实验已证实,碱性成纤维细胞生长因子对不同组织和细胞具有广泛作用,可加快创面愈合进程.目的:观察基因枪转人碱性成纤维细胞生长因子基因促进深Ⅱ度烧伤创面愈合的效果和可行性.设计、时间及地点:完全随机设计,观察实验,于2007-12/2008-10在解放军第二军医大学长海医院全军烧伤中心实验室完成.材料:SD清洁级大鼠,体质量200-250 g,雌雄不拘.方法:将天然人碱性成纤维细胞生长因子基因重组优化,以pCI-neo为载体构建重组人碱性成纤维细胞生长因子基因高效真核表达载体pCI-neo-bFGF,并转染人胚肾细胞293T细胞,转染后以dot blot和western blot检测碱性成纤维细胞生长因子的表达.利用基因枪技术对SD大鼠深Ⅱ度烧伤创面模型进行转基因,以转染pCI-neo-bFGF为实验组,以转染空载体pCI-neo为对照组.主要观察指标:记录创面愈合时间,在转基因后24 h,48 h,96 h,7d,10d和14d测定创面组织羟脯氨酸和胶原酶Ⅰ水平,评价创面愈合情况.结果:重组构建的pCI-neo-bFGF经转染人胚肾细胞293T细胞,dot blot和western blot 检测结果显示,构建的pCI-neo-bFGF表达载体可表达人碱性成纤维细胞生长因子,荧光显微镜下合成基因的表达水平明显高于天然基因表达;基因枪转基因实验结果显示,实验组创面愈合时间为(13.00±1.31)d,对照组为(14.75±1.28)d,两组相比较差异有显著性意义(P＜0.05):两组羟脯氨酸及胶原酶Ⅰ水平均于基因枪转染后48h即伤后第5天达到高峰,随后逐渐下降至一定水平后维持,实验组各时间点羟脯氨酸水平均高于对照组(P＜0.05,P＜0.01);实验组转基因后48 h和96 h胶原酶Ⅰ水平明显高于对照组(P＜0.01).结论:基因枪转人碱性成纤维细胞生长因子基因可以缩短创面愈合时间.增加创面愈合期间组织羟脯氪酸和胶原酶Ⅰ水平,加快深Ⅱ度烧伤创面愈合进程.

IL-2-preS融合蛋白表达质粒的基因枪DNA免疫研究

目的:观察基因枪肌肉注射IL-2-preS融合蛋白表达质粒(pCWIIP)的基因免疫效率,为乙型肝炎基因免疫研究提供基础.方法: 设基因枪肌肉注射组和正常肌肉注射组,分别用pCWIIP质粒及对照质粒pCIIP-2和pCI免疫Bal b/c小鼠,免疫后第4天,取肌肉组织通过免疫组化观察IL-2-preS在肌肉中的表达;另设基因枪、正常肌肉、皮下注射组分别免疫pCWIIP及对照质粒,在2、4、6、8 w眼后腔取血, 通过间接ELISA方法检测血清中抗preS的IgG抗体水平.结果:免疫组化结果显示:基因枪肌肉注射组其IL-2-preS在肌肉中的表达明显高于正常肌肉组.间接ELI SA检测结果表明:抗preS的IgG抗体水平为基因枪＞正常肌肉组＞皮下注射组. 结论:在IL-2-preS融合蛋白表达质粒的基因免疫中,基因枪肌肉注射的方式优于肌肉和皮下注射的方式,具有快速、经济和安全的特性,将为今后的临床广泛应用提供依据.

sH-2K~d-HBc四聚体的构建及其初步的检测应用

目的:sH-2K~d-HBc复合物四聚体的构建与检测,为进一步检测抗原特异性T细胞,探讨免疫发病机制奠定基础.方法:将四个生物素化的可溶性复合物单体与荧光标记的亲和素结合形成四聚体.采用HBcAg真核表达质粒(pcDNA3-C)通过不同的途径免疫小鼠,获得针对核心抗原的特异性CTL,与制备的四聚体共孵育,结合流式细胞仪术进行检测.结果:三种免疫方法所得到的细胞中,抗原特异性CTL频数较对照组都有明显提高(0.24%,0.26%,0.36% vs 0.07%,P≤0.05).显示制备的四聚体能与抗原特异性T细胞结合,具有检测功能.三种不同的免疫途径所引起的抗原特异性的体液免疫应答和细胞免疫应答强度各有不同.与传统的肌肉注射组相比,基因枪免疫组的体液免疫应答水平较弱而细胞免疫应答水平较强.高压水注射(HDI)组的体液免疫应答和细胞免疫应答水平都要明显高于肌肉注射组结论:获得了功能性的sH-2K~d-HBc复合物四聚体,为进一步检测抗原特异性T细胞奠定基础.

基因枪注射BALB/c小鼠制备Graves病模型

目的:探讨基因枪注射和普通质粒肌肉注射两种不同方法对甲亢动物模型的差异.方法:将45只小鼠随机分成4组,分别用基因枪金颗粒包裹质粒免疫、普通质粒肌肉注射免疫.加强免疫后第4周后处死小鼠,RIA法测定血清FT3、FT4、TSH水平.RIA法测定血清与hTSHR-CHO孵育后上清cAMP浓度以计算TRAb活性,RIA法测定脾脏培养后IL-4的浓度,ELISA法测定血清TSAb浓度,取甲状腺做石蜡HE切片观察组织学变化.结果:基因枪免疫组(GGI)动物4周后血清FT4(0.34±0.11)pg/ml高于质粒肌肉注射组(PLS)(0.21±0.06)pg/ml和基因枪免疫空质粒组(GG0)(0.17±0.08)pg/ml(F=14.34,P=0.002).GGI组TRAb活性(167.27±117.37)%高于PLS组(113.81±65.50)%和GG0组(98.27±14.80)%(Hc=35.198,P＝0.007).GGI组脾脏培养上清液IL-4产量(0.244±0.092)pmol/L明显高于PLS组(0.173±0.039)pmol/L和GG0组(0.151±0.041)pmol/L(F=7.040 3,P＝0.005).GGI组TRAb浓度(29.3±1.2)U/L明显高于GG0组(13.3±0.2)U/L(F=9.02,P<0.001),但和PLS组(24.3±0.9)U/L比无显著性差异(q＝-1.32,P＝0.423).HE切片观察造模成功小鼠甲状腺滤泡细胞高柱状排列,未出现甲状腺细胞破坏甲状腺炎的嗜酸性变.结论:基因枪免疫雌性BALB/c鼠是一种可行的复制Graves动物模型,在免疫第2～4周可以观察到FT4升高和自身抗体改变等理想的免疫效果.

可诱导共刺激分子配体上调Graves病动物免疫应答

目的：研究可诱导共刺激分子及配体（ICOS／ICOSL）在Graves 病（以下简称甲亢，GD）中的病理生理机制。方法：45只远交系BALB／c 小鼠随机分成三组各15只，用基因枪将不同质粒注射。A 组采用表达pCDNA3．0－mICOSL 和pCDNA3．0－hTSHR 的质粒免疫；B 组用表达pCDNA3．0－hTSHR 的质粒免疫，C 组采用空质粒pcDNA3．0免疫作为对照组。放免法测定小鼠血清游离甲状腺素（FT4）、脾脏细胞上清液IFN－γ度，ELISA 法血清促甲状腺素受体抗体（TRAb），小鼠血清和转染人hTSHR－CHO 细胞共同孵育后检测cAMP 浓度判断TRAb 自身抗体活性。结果：质粒注射后A 组小鼠血清FT4水平（0．49±0．25）pg／ml 高于C 组（q＝6．571，P ＝0．023）；成模达标率（10／15例）高于B、C 两组（χ2＝14．47，P ＝0．005）。A 组小鼠脾脏原代培养上清液IFN－γ的产量（1．88±0．41）pmol／L 明显高于B、C 两组（F ＝17．85，P ＝0．003）。A 组小鼠血清TRAb 活性188．3（179．7～260．2）％高于B、C 组（P ＝0．027）。结论：外源性导入pCDNA3．0－mICOSL 到GD 小鼠，能刺激其脾脏淋巴细胞分泌IFN－γ，增加自身抗体TRAb 活性，从而上调GD 动物体内免疫应答。

基因枪转导K-ras突变反义基因对人胰腺癌细胞生长曲线的影响

目的 探讨基因枪转导K-ras突变反义基因对胰腺癌细胞生长的影响.方法 利用基因枪技术,将反义基因转导入宿主细胞,通过活细胞计数试剂盒Cell Counting Kit-8和Thermo Multiskan Ascant酶标仪观察K-raa突变特异性反义基因转导后对AsPC-1、MiaPaCa-2和BxPC-3三种人胰腺癌细胞的生长曲线变化情况.结果 转导K-ras突变特异性反义基因后,突变型AsPC-1和MiaPaCa-2胰腺癌细胞的生长曲线明显向右下移动.结论 转导K-ras突变特异性反义基因后,具有突变型K-ras基因的胰腺癌细胞系的生长都受到明显抑制.

基因枪在RNA干扰中的应用研究进展

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指双链RNA(double-strand RNA,dsRNA)特异性降解同源mRNA,从而引发基因转录后水平沉默的现象,是一种高效、高特异性抑制基因表达的途径.自1998年Fire等发现RNA干扰现象以来.其特异性降解目的基因的优势吸引了众多研究者的目光.本文在简要综述RNAi技术在基因功能研究、抗病毒治疗,肿瘤基因治疗等领域的应用后,重点归纳了基因枪技术在RNAi研究即siRNA导入细胞中的应用,并简单分析其优势与意义.

基因枪接种乙型肝炎表面抗原促进DNA疫苗诱生的免疫应答转换

目的为了克服基因枪接种乙型肝炎表面抗原(HBsAg)DNA疫苗诱生的免疫应答以Th2为主的缺点,在基因枪接种质粒HBsAg DNA疫苗的同时共导入或共表达乙型肝炎病毒壳(HBV core)基因作为佐剂,以促进其所诱生的HBsAg特异性的Th2型免疫应答向Th1型转换.方法构建可单独或共同表达HBsAg或核心抗原(HBcAg)的DNA免疫用载体pIRES/core、pIRES/C149、pIRKS/S、pIRES/S/Core和pIRES/S/C149,并在真核细胞进行表达验证.对BALB/c雌鼠进行免疫并检测小鼠免疫后的特异性体液免疫和细胞免疫指标.结果共导入或共表达HBV core基因能增强基因枪接种HBsAg DNA疫苗诱生的Th1型免疫应答水平,包括HBsAg特异的IgG2a应答、CTL活性、IFN-γ产生能力等.结论以HBV core基因为佐剂能促进基因枪接种HBsAg DNA疫苗诱生的Th2型免疫应答向Th1型免疫应答转换.

067 基因枪接种质粒DNA诱导的免疫应答重复性优于肌肉注射

hPH-20 DNA 疫苗对雌性小鼠生育的影响

目的:观察 pcDNA3.1(+)-hPH-20 基因疫苗经基因枪介导肌肉接种后在小鼠体内的表达及对小鼠受孕率的影响.方法:以小鼠为实验材料,将实验组经后腿股内侧肌以基因枪多点注射重组质粒 pcDNA3.1(+)-hPH-20 5μg,空载体对照组注射 pcDNA3.1(+)5μg,空白对照组注射生理盐水 200μl,于接种后取股内侧肌检测 hPH-20 mRNA 和蛋白的表达.采集抗血清做人精子穿去透明带仓鼠卵细胞实验,动物合笼观察受孕情况,持续 4 个月后进行基因疫苗的安全性检测.结果:注射部佗肌肉检测到目的条带;原位杂交在肌细胞膜、胞质和部分肌细胞核可见到蓝紫色颗粒;免疫组织化学显色在肌细胞膜和胞质可见到棕褐色颗粒;实验组小鼠受孕率和对照组相比下降77.78%,同时用鼠抗 hPH-20 血清能明显降低精子穿卵率;外源性基因没有整合至宿主染色体.结论:hPH-20 基因疫苗经基因枪介导肌内接种有一定的免疫避孕效果.

不同方式接种DNA疫苗免疫效果的比较

DNA疫苗经基因枪和肌肉注射两种接种方式免疫小鼠,免疫组化检测gD抗原表达情况.全自动图像分析系统分析表达量,ELISA检测抗体滴度,病毒攻击考察保护效应,比较不同方式接种DNA疫苗的免疫效果.重组质粒pVAX-gD经基因枪接种与肌肉接种均能实现gD基因在肌肉细胞的表达,激发免疫动物体内的高滴度抗体,保护免疫动物免于HSV-2感染.研究表明基因枪接种要求的DNA疫苗剂量小,基因枪介导的免疫重复性高、效果好,更适合DNA疫苗接种.