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健脾祛瘀法对血脂异常ApoE基因缺失小鼠视网膜RPE黑色素和脂褐素的影响
目的:观察健脾祛瘀法对血脂异常ApoE基因缺失(apolipoprotein E-deficient,ApoE-/-)小鼠视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium,RPE)黑色素和脂褐素的影响.方法:随机将60只2月龄ApoE-/-小鼠分为普食组、高脂组、高剂量治疗组、中剂量治疗组、低剂量治疗组,喂养5个月后检测其血浆总胆固醇(total plasma cholesterol,TC)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)、血浆甘油三酯(plasma triglyceride,TG)含量,银氨液浸染法和醛品红法染色后光镜下观察视网膜色素上皮细胞(RPE)形态结构,并半定量检测RPE细胞内黑色素和脂褐素含量及计算其黑色素/脂褐素比值,采用多元线性回归分析黑色素、脂褐素、黑色素/脂褐素比值与TC、LDL、TG相关性.结果:TC、TG和7月龄ApoE-/-各治疗组小鼠比7月龄ApoE-/-高脂组明显降低(P ＜0.001),LDL和7月龄ApoE-/-高、中治疗组小鼠比7月龄ApoE-/-高脂组明显降低(P ＜0.001),7月龄ApoE-/-低剂量治疗组比7月龄A poE-/-高脂组降低(P＞0.05).光镜下,7月龄ApoE-/-高脂组和7月龄ApoE-/--普食组小鼠RPE排列紊乱、细胞萎缩,7月龄ApoE-/-各治疗组小鼠视网膜RPE排列较整齐、细胞萎缩减轻.半定量检测结果,与7月龄ApoE-/-高脂组比,7月龄ApoE-/-各治疗组小鼠视网膜RPE细胞内黑色素含量明显增多(P ＜0.001),7月龄ApoE-/-各治疗组小鼠视网膜RPE细胞内脂褐素含量明显降低(P＜0.001),7月龄ApoE-/-各治疗组小鼠视网膜RPE细胞内黑色素/脂褐素比值明显增多(P ＜0.001).采用逐步引入-剔除法进行多元线性回归分析发现,黑色素含量与TC、LDL、TG呈负直线相关,回归方程为:黑色素含量=1837732.32-63225.96×胆固醇,脂褐素含量与TC、TG呈正直线相关,回归方程为:脂褐素含量=418363.52+ 139394.42×胆固醇,黑色素/脂褐素比值与TC、TG呈负直线相关,回归方程为:黑色素/脂褐素=2.057-0.127×胆固醇.结论:健脾祛瘀法可通过降低血脂异常ApoE-/-小鼠高脂血症,改善RPE形态结构,提高视网膜RPE黑色素含量,降低RPE脂褐素含量,增强视网膜抗脂质过氧化能力,对年龄相关性黄斑变性发挥治疗作用.
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碱性成纤维细胞生长因子在视网膜色素变性中的研究
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对体外培养的色素上皮细胞和感光细胞有促增殖作用，在视网膜变性的RCS鼠的视网膜下和玻璃体内分别注射bFGF，可以有效地挽救其感光细胞。把神经营养因子与基因治疗相结合，应用病毒载体携带bPGF基因转染细胞，可以达到同样的治疗效果，同时降低了蛋白注射引起的副作用。而应用其它方式如寡聚多肽、电击及基因工程都能使bPGF高效地进入细胞内。目前，大多数研究者认为bPGF的挽救作用是由于体内bFGF及其mRNA表达上调，但关于视网膜变性疾病中bFGF及其受体的表达意见不一，所以详细的机制尚不明确。各种遗传方式的视网膜色素变性都是以凋亡为共同途径，应用bFGP的抗凋亡作用延缓视网膜色素变性将对该病的治疗有普遍的实用性。
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血脂异常ApoE基因缺失小鼠视网膜及Bruch膜组织形态观察
目的 观察血脂异常ApoE基因缺失(apolipoprotein E-deficient,ApoE-/-)小鼠视网膜和Bruch膜组织形态改变.方法 采用随机数字表法根据小鼠体质量分层随机分组.将24只2月龄(ApoE-/-)小鼠分为高脂组和普食组,另用12只2月龄C57BL小鼠作为普食对照组,喂养4个月后检测血浆总胆固醇(total plasma cholesterol,TC)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL),光镜和电镜观察视网膜和Bruch膜的组织形态改变,光镜下半定量检测视网膜光感受器细胞、色素上皮细胞(retinal pigment epithelium,RPE)数量.结果 与普食对照组相比,6月龄ApoE-/-高脂组小鼠的TC、LDL明显增高(P＜0.001),同时视网膜光感受器细胞、RPE排列紊乱、萎缩、数量明显减少(P＜0.001),Bruch膜粗细不等、纤维分叉、厚度明显增厚(P＜0.001),部分小鼠视网膜下可见玻璃膜疣形成.电镜观察RPE基底膜皱褶变短且减少,胞质内线粒体肿胀,胞浆中可见大量空泡,Bruch膜明显变厚,纤维结构明显减少,弹力层断裂.结论 血脂异常ApoE-/-小鼠视网膜、Bruch膜出现的组织形态改变符合年龄相关性黄斑变性的病理改变,该动物模型可用做年龄相关性黄斑变性的研究.
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短发夹RNA对人视网膜色素上皮细胞血管内皮生长因子表达的抑制
目的探讨针对人血管内皮生长因子(VEGF)的短发夹RNA(shRNA)在体外对视网膜色素上皮(RPE)细胞VEGF表达的影响. 方法用酶辅助显微分离法分离人RPE细胞,并用细胞角蛋白和S-100进行免疫组化鉴定.设计针对人VEGF的短发夹RNA(shRNAs,P1,P2), P3为阴性对照即不含特异性shRNA,P1、P2退火后双链DNA连接到质粒pSilencer 4.1-CMV的BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切位点.转化细菌后,提取的质粒用EcoRⅠ和 SamⅠ进行酶切鉴定.实验分5组,第1组:RPE细胞中在含有100 μmol/L CoCl2,10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中培养30 h;第2组:在常规含有10% FBS的DMEM培养基中培养30 h;第3、4、5组:分别P1、P2、P3转染细胞24 h后在含有100 μmol/L CoCl2 的10% FBS的DMEM培养基中培养30 h;用免疫印迹法检测各组细胞VEGF表达水平. 结果培养的细胞用细胞角蛋白和S-100免疫组化染色阳性.提取的质粒经酶切后片断相对分子质量分别为3300 和1600,说明质粒成功地提取和纯化.VEGF表达水平1组明显高于2、3、4组(均P<0.001).乏氧(2组与1组比)可以明显增加RPE细胞中VEGF的表达.3、4组(P1和P2)对VEGF表达抑制分别为65.9% 和 52.4%.5组与1组比差异无统计学意义(P=0.147).各组间β肌动蛋白表达量差异无统计学意义.结论针对人VEGF的特异性shRNA可以明显降低人RPE细胞VEGF的表达,为RNA干扰治疗新生血管性眼病,尤其是脉络膜新生血管奠定了基础.
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绿光笔致视网膜感光细胞缺失一例
患者男,16岁,主诉其同学用绿光笔间断照射左眼3次后,自觉眼前有白点,视力下降2 d来我院就诊.专科检查:左眼,裸眼视力0.8,不能矫正,眼压正常,常规眼前节检查未见异常.眼底镜检查可见黄斑中心反光消失(图1).光学相干断层成像(optical coherence tomography,OCT)检查可见黄斑中心感受器细胞内段(inner segment, IS)和外段(outer segment,OS),IS/OS光带不连续,色素上皮细胞光带受损,其下反光增强(图2).右眼裸眼视力1.0,专科检查未见异常改变.临床诊断:左眼视网膜光损伤.给予甲钴胺片0.5 mg,3次/d;维生素E 50 mg, 1次/d治疗.首诊后2个月复查,眼底未见明显异常,OCT检查显示IS/OS病变较首诊略局限.
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激光联合中药治疗糖尿病黄斑水肿患者的观察及护理
黄斑水肿是黄斑区毛细血管内皮细胞或色素上皮细胞屏障功能障碍而导致的液体渗漏[1],是引起糖尿病患者视力下降或丧失的主要因素[2,3].我院2002年8月-2005年8月共治疗该类患者47例82只眼,用激光光凝联合中药治疗,经精心的观察和护理后,取得了显著的效果,现报道如下.
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氩激光光凝治疗黄斑水肿的临床观察
黄斑水肿是指黄斑区局部毛细血管内皮细胞屏障(视网膜内屏障)或/和色素上皮细胞屏障(视网膜外屏障)功能损害,导致液体渗漏的结果[1].眼底荧光血管造影将黄斑水肿区分为局限性黄斑水肿和弥散性黄斑水肿[2].用激光光凝治疗黄斑水肿,以挽救和保存患眼视力有着特别重要的作用.我院自1997年至2000年,采用氩绿激光光凝治疗黄斑水肿报告如下:
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视网膜脱离外路显微手术中色素颗粒进入玻璃体临床观察
目的 观察在视网膜脱离外路显微手术中做视网膜裂孔冷凝或定位时,色素颗粒从裂孔播散入玻璃体腔,对手术效果的影响.方法 回顾性统计分析视网膜脱离外路显微手术中有色素颗粒从裂孔涌人玻璃体腔的连续38例39只眼,均是初发裂孔性视网膜脱离患者,PVR分级为B级以下.平均每只眼裂孔数2.67个.单纯硅压11只眼,硅胶填压联合环扎28只眼.结果 随访至少6个月以上,涌入玻璃体腔内的色素颗粒逐渐减少或消失.一次手术后视网膜脱离复位38只眼(96.7%),1只眼出现新的视网膜裂孔,经玻璃体手术后视网膜复位,终视网膜脱离复位率为100%.无过度冷凝视网膜表现,没有发生严重PVR病例.结论 视网膜脱离外路显微手术中色素细胞播散进入玻璃体腔不会引起PVR发生或加重,只要裂孔被有效封闭.手术效果良好.
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糖尿病大鼠视网膜色素上皮细胞超微结构
目的:探讨糖尿病大鼠视网膜色素上皮细胞超微结构病变,为糖尿病视功能障碍提供有关的行态学依据.方法:选择清洁级SD大鼠随机分成正常对照组、糖尿病1月、3月和6月.腹腔内注射链脲佐菌素(STZ)诱导大鼠糖尿病,每组12只,取视网膜制备超薄切片,透射电镜观察.处死前每月测体重、血糖1次.结果:糖网病大鼠视网膜色素上皮细胞的微绒毛和基底部的质膜内褶随血糖的增高病情加重而逐渐稀疏、低矮直至脱落、低平.胞质内细胞器以线粒体的脱嵴、水肿和内质网的扩张为主要损害,而相邻色素上皮细胞之间的连接复合体始终存在.结论:糖网病大鼠视网膜色素上皮细胞的损害主要表现于微绒毛、质膜内褶及细胞器的损害,并无脉络膜与视网膜之间屏障功能的损害.本研究为糖网病的临床研究提供形态学依据.
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胚胎干细胞体外诱导分化为黑色素细胞的研究进展
胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESs)是从早期胚胎内细胞团(Inner cell mass,ICM)或桑椹胚中分离出的高度未分化的全能细胞.ES细胞体外诱导分化为黑色素细胞的过程能更明确皮肤黑色素细胞和视网膜黑色素上皮细胞(Retinal pigreented epithelium,RPE)的基因选择性表达程序.
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基于RCS大鼠模型的视网膜色素变性治疗
视网膜色素变性是一类以光感受器细胞及色素上皮细胞功能丧失为共同表现的疾病,具有遗传倾向性,通过选择不同的视网膜色素变性(relinitis pigmentosa,RP)动物模型可以针对不同遗传方式的RP进行研究,皇家外科学院(royal college surgeons,RCS)大鼠是常染色体隐性遗传的经典动物模型,现将基于RCS大鼠模型的RP治疗研究进展综述如下.
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地塞米松对体外培养视网膜色素上皮细胞生长及表达VEGF的影响
目的:观察不同浓度地塞米松对体外正常和缺氧培养的人视网膜色素上皮细胞(hRPE)生长及血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响.方法:体外正常(氧浓度95%)和缺氧(氧浓度2%～5%)下培养视网膜色素上皮细胞,分别加入不同浓度地塞米松,用四唑溴盐(MTT)和RT-PCR的方法,分别检测药物对细胞生长的影响和细胞VEGF的表达.结果:同一药物浓度下,缺氧刺激后,细胞较正常培养细胞呈现增殖状态,VEGF表达增强;1～200 μg/ml药物浓度可刺激细胞增殖,VEGF表达增强;200～400 μg/ml药物浓度逐渐出现细胞增殖率下降,VEGF表达降低趋势.各组与对照组相比差异性显著(P＜0.05).结论:对于体外正常培养或缺氧培养视网膜色素上皮细胞,地塞米松在低浓度可刺激细胞生长,高浓度可抑制细胞生长,这一过程可能与VEGF的表达有关.
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三种基因导入系统对视网膜色素上皮细胞转染效率的研究
目的:以增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)为报告基因,研究lipofectamine 2000、FuGENE6和逆转录病毒载体介导的基因导入系统对视网膜色素上皮细胞的基因转染效率,为视网膜及视网膜相关疾病的基因治疗奠定基础.方法:在体外分离培养人视网膜色素上皮细胞,构建含有EGFP基因的表达载体,分别应用阳离子脂质体lipofectamine 2000、FuGENE6和逆转录病毒三种方法将EGFP基因转染到人视网膜色素上皮细胞中,转染后于48 h在荧光显微镜下观察EGFP的表达情况.结果:三种方法介导EGFP基因在人视网膜色素上皮细胞中表达的阳性比例平均分别为52%、10%和72%.结论:在体外可通过逆转录病毒系统或阳离子脂质体lipofectamine 2000有效地将外源基因导入到人视网膜色素上皮细胞中,其中以逆转录病毒系统转染效率为高.
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我国胚胎干细胞治疗致盲性眼病取得重大突破
第三军医大学西南医院阴正勤教授团队成功开展世界首例胚胎干细胞来源的色素上皮细胞（hESC-RPE）视网膜下移植术治疗湿性年龄相关性黄斑变性（wAMD），取得了从实验室研究向临床应用的突破。首例患者术后患眼比术前能够多识别33个字母，视野遮挡消失，眼科各项检查显示移植细胞生存良好，患者视功能稳步提高！
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Bcl-2及bFGF在维拉帕米诱导人视网膜色素上皮细胞凋亡中的表达
目的探讨维拉帕米(verapamil,Ver)对体外培养的人视网膜色素上皮(retina l pigment epithelium,RPE)细胞的凋亡作用,观察凋亡过程中原癌基因蛋白质(Bcl-2 )和碱性成纤维细胞生长因子(baic fibroblast growth factor,bFGF)的表达变化. 方法应用80 mg*L-1 Ver作用于体外培养的人RPE细胞12 h、24 h 、4 8 h,吖啶橙(acridine orange,AO)荧光染色及透射电镜观察RPE细胞凋亡;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Bcl-2 mRNA和bFGF mRNA表达变化. 结果经Ver作用的体外培养的人RPE细胞具有典型的凋亡形态学特征:核染色质浓染、边集;细胞体积缩小.同时RPE细胞Bcl-2 mRNA表达下降;而bFGF mRNA表达随着作用时间延长,呈增高趋势. 结论 Ver可诱导体外培养人RPE细胞凋亡,凋亡过程中Bcl-2表达逐渐下降,而bFGF表达增强.
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视网膜下液对培养的人眼视网膜色素上皮细胞和成纤维细胞增殖作用的影响
目的了解不同程度增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的视网膜下液(SRF)对视网膜色素上皮细胞(RPE)、成纤维细胞(FB)增殖的影响。方法用溴标法和MTT法测定不同程度PVR的SRF对RPE和FB增殖的促进作用。结果几乎所有的SRF都具有促进细胞增殖的作用，用1∶10比例稀释，PVR程度为PVR＜C1，PVR C1，PVR＞C1 3组。SRF作用24 h后RPE的增殖率分别为对照组的128.5%，139.8%，156.8%，FB的增殖率分别为对照组的126.3%，143.1%及172.3%。结论SRF液促进细胞增殖的作用随着PVR程度的加重而增强。
关键词： 增生性玻璃体视网膜病变 视网膜下液 色素上皮细胞 成纤维细胞 -
Long Evans和Wistar大鼠视网膜神经节细胞电生理学及形态学特性比较研究
目的比较Long Evans大鼠和Wistar大鼠睁眼前后视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells, RGCs)电生理学特性及形态学特征上的差异.方法取出生后0～31 d Long Evans和Wistar大鼠,各按睁眼时间分为两组,制备视网膜片,行膜片钳全细胞记录,同时行组织切片和细胞内染色,观察形态特征.结果比较22只Long Evans大鼠和24只Wistar大鼠被动膜学特性和动作电位(action potential, AP)幅度及阈值无显著差异,形态学上除两者视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium, RPE)含或不含色素颗粒外未见明显区别.结论 Long Evans大鼠因其RPE含色素颗粒,以及在视觉和神经系统等方面的优点,可取代Wistar等白化鼠而作为一种良好的视觉和神经科学研究的实验动物模型.
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TGF-β2与增生性玻璃体视网膜病变的关系
增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)是一种眼内创伤过度的损伤修复过程,主要是RPE(视网膜色素上皮细胞)发生迁移、增生并表型变化,及神经胶质细胞的增生和收缩,形成可以收缩的增生膜,造成牵拉性视网膜脱离的病变,有许多细胞因子和生长因子参与了这个过程,其中转化生长因子β(transforming growth factorβ,TCF-β)是其中的一个重要因子.
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地塞米松对视网膜色素上皮细胞IL-6表达的抑制作用
目的观察视网膜色素上皮(RPE)细胞中,IL-6的表达及地塞米松对IL-6表达的抑制作用.方法培养的人RPE经IL-1β(10 μg/L)刺激及地塞米松作用后,采用ELASA、免疫组化和原位杂交等方法,检测培养的人RPEIL-6 mRNA及其蛋白的表达.结果用IL-1β刺激后8 h,RPE细胞表达的IL-6约为2 000 ng/L@106细胞;地塞米松可明显抑制IL-6蛋白的产生(200 ng/L@106细胞),与对照组相比较差异显著(P＜0.01).免疫组化染色显示,表达的IL-6在RPE细胞胞浆中呈浓淡不一的棕黄色,地塞米松作用组染色较浅.原位杂交表明,IL-6 mRNA在RPE细胞胞浆中的表达呈浓淡不一的紫蓝色,地塞米松作用组染色与对照组相同.图像分析显示,二者的吸光度(A)值无明显差别(P＞0.05).结论在IL-1β刺激下,人RPE细胞可表达IL-6的mRNA及其蛋白,地塞米松能有效地抑制RPE细胞中IL-6蛋白的表达.
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血脂异常对ApoE基因缺失小鼠视网膜及Bruch膜的影响
目的:研究血脂异常对ApoE基因缺失(apolipoprotein E-deficient,ApoE-/-)小鼠视网膜及Bruch膜的影响.方法:随机将24只2月龄(ApoE-/-)小鼠和24只C57BL/6J小鼠分别分为高脂组和普食组,每组动物12只,喂养4mo后检测其体质量、血浆总胆固醇,视网膜及Bruch膜行光镜和电镜检查.结果:6月龄ApoE-/-高脂组的血浆总胆固醇均显著性高于对照组(P<0.05);6月龄ApoE-/-高脂组外核层厚度、色素上皮细胞层厚度显著低于对照组(P<0.05),而其Bruch膜厚度则显著大于对照组(P<0.05).结论:血脂异常使ApoE-/-动物的视网膜光感受器细胞、色素上皮细胞及Bruch膜发生病理改变,其改变相似于早期年龄相关性黄斑变性的改变.
