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蛋白质组学(proteomics)
蛋白质组(proteomics)系一个基因组、一种生物或一种细胞组织所表达的全套蛋白质.对蛋白质组织相关问题的研究即为蛋白质组学.由于蛋白质是体现生物功能的分子,蛋白质分子由基因所编码,故蛋白质组学研究是基因组学(特别是功能基因组学)研究的深入和延伸.蛋白质组学研究的内容大致包括以下方面:①蛋白质组作用、成分鉴定、数据库构建、新型蛋白质的发现、同源蛋白质比较、蛋白质加工和修饰分析;②基因产物识别、基因功能鉴定、基因调控机制分析;③重要生命活动的分子机制(如细胞周期、分化与发育、肿瘤发生发展、环境反应与调节等);④医药靶分子的寻找和分析(包括新药靶分子、肿瘤分子标记、人体病理介导分子、病原菌毒性成分等).
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穿心莲中1个新NADPH-细胞色素P450还原酶的克隆及功能鉴定
穿心莲内酯为传统中药穿心莲中的主要有效成分,具有多种药理活性,广泛运用于临床,但其生物合成途径尚未被解析.细胞色素P450还原酶为CYP450提供电子,在CYP450的催化过程中起重要作用.该研究通过同源比对筛选并克隆了 穿心莲CPR的编码序列,命名为ApCPR4.原核表达ApCPR4蛋白,分离纯化后进行体外酶活鉴定,发现ApCPR4能够以NADPH依赖性方式还原细胞色素c和铁氰化物.为了验证其体内功能,将ApCPR4与CYP76AH1共转化入酵母工程菌,结果表明,ApCPR4在酵母体内能够协助CYP76AH1催化生成铁锈醇.实时定量PCR结果显示,在茉莉酸甲酯(MeJA)处理的叶片中,ApCPR4的表达量逐渐增加.该表达模式与穿心莲内酯受MeJA诱导积累的趋势一致,推测ApCPR4与穿心莲内酯的生物合成相关.
关键词： 穿心莲内酯 生物合成途径 细胞色素P450还原酶 原核表达 功能鉴定 -
EHEC O157:H7志贺毒素Ⅱ型A、B亚单位的表达及功能鉴定
目的 克隆、表达肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157:H7志贺毒素(Shiga toxin,Stx)Ⅱ型A、B亚单位,并鉴定其免疫学功能.方法 从EHECO157:H7基因组中克隆编码Stx Ⅱ型A、B亚单位的基因,经测序、酶切后,导入表达载体pGEX-4T-2,转化大肠杆菌Topl0F',经诱导、纯化得到谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)-A和GST-B融合蛋白.分别用A、B亚单位融合蛋白免疫BALB/c小鼠获得高免血清,观察A、B亚单位血清对小鼠进行毒素攻击的保护作用.结果 Stx Ⅱ型A、B亚单位的GST融合蛋白获得高效表达并纯化;A、B亚单位的高免血清可以保护小鼠对致死量毒素的攻击.结论 Stx Ⅱ型A、B亚单位蛋白可以作为EHEC O157:H7疫苗的候选分子,同时针对A、B亚单位蛋白的中和单抗可以对易感人群起到紧急保护作用.
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金丝桃素合酶基因的快速克隆及功能鉴定
金丝桃素合酶能催化大黄素生成金丝桃素,根据已发表的金丝桃素合酶的基因序列,设计了6对引物,通过连续重叠PCR快速克隆得到了金丝桃素合酶基因hyp-1.构建含hyp-1基因的原核表达载体pET32ahyp,将该载体导入大肠杆菌进行诱导表达.SDS-PAGE结果表明,hyp-1基因在大肠杆菌中获得表达;Western blot结果表明,重组的Hyp-1蛋白具有特异的免疫活性,表明hyp-1基因在E.coli中得到了表达.酶促反应表明,Hyp-1确实能催化大黄素形成金丝桃素,上述结果表明,本研究克隆的hyp-1基因是金丝桃素合酶基因,具备催化大黄素形成金丝桃素的能力,从而为通过合成生物学技术制备金丝桃素奠定了物质基础.
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尘肺经济损失测算
尘肺病一方面造成病人痛苦,另一方面给企业造成严重的经济损失.尘肺病确诊后要调离生产一线安排轻工作,其中Ⅰ期尘肺功能鉴定为"丙",年龄不足55岁的尘肺患者要办理退休,退休后要享受各项工伤待遇,同时高出正常职工的医疗费用,生活不能自理的要发给国家规定的等级护理费用,多支出工资补贴、工伤抚恤费等.
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全科医生小词典--个体化医疗
个体化医疗（personalized medicine）是以每个患者的信息为基础决定治疗方针，从基因组成或表达变化的差异来把握治疗效果或毒副作用等应答的个性，对每例患者进行适宜药物疗法的治疗。个体化医疗主要有两个方向，即基因组学和蛋白质组学。基因组学又包括以全基因组测序为目标的结构基因组学和以基因功能鉴定为目标的功能基因组学。而蛋白质组学集中于动态描述基因调节，对基因表达的蛋白质水平进行定量测定，鉴定疾病、药物对生命过程的影响以及解释基因表达调控的机制。
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脑内水通道蛋白-9的研究进展
1988年Agre等在对红细胞膜高通透性研究中分离出一种蛋白质,之后其又通过著名的蛙卵实验进行了功能鉴定,证实了这种蛋白就是人们长期以来推测的水通道蛋白,并将其命名为aquaporinl,AQP1.自从AQP1被发现以后,一系列AQP也陆续被发现.目前,已从哺乳动物组织内分离克隆出至少11种水通道蛋白.
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小鼠骨髓源耐受性树突细胞的分离培养及功能鉴定
目的：建立小鼠骨髓源耐受性树突状细胞（CD11b＋F4/80＋TDCs）体外培养及功能鉴定方法。方法：以重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（ rmGM-CSF ）和重组白介素4（ rmIL-4）体外诱导小鼠骨髓细胞分化为未成熟树突细胞（iDCs），收集第六天的细胞采用流式细胞术分离纯化CD11b＋F4/80＋TDCs。倒置显微镜动态观察细胞形态学变化，流式细胞术观察并分选CD11b＋F4/80＋TDCs，CD11b＋F4/80＋TDCs的耐受功能通过MHCⅡ类分子、CD83、IDO、TLR-2的表达及IL-10和TGF-β1细胞因子的产生进行评价。流式细胞术测定MHCⅡ类分子表达，免疫组化法测定CD83、IDO、TLR-2的表达，ELISA法测定IL-10和TGF-β1的水平，同时设LPS刺激诱导的成熟树突细胞（mDCs）作对照。结果：镜下可见新鲜分离的骨髓细胞呈圆形，体积小，2 d后，部分细胞形态发生改变，体积增大，细胞聚集成团，培养5～6 d，细胞集落增多，形态不规则。同时表面出现较多毛刺样突起。 CD11b＋F4/80＋TDCs 含量在23％左右，经流式分选后细胞纯度达到99％以上。与 mDCs 比较， CD11b＋F4/80＋TDCs低表达MHCⅡ和CD83，高表达IDO、TLR-2，并分泌IL-10和TGF-β1。结论：用小鼠rmGM-CSF和rmIL-4体外能成功诱导小鼠骨髓源CD11b＋F4/80＋TDCs，并且CD11b＋F4/80＋TDCs通过表达IL-10、TGF-β1、IDO和TLR-2显示耐受功能。
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人外周血巨噬细胞培养及功能鉴定
目的：从人外周血单个核细胞（ PBMC）中分离单核细胞，诱导分化成巨噬细胞并鉴定其功能。方法：应用免疫磁珠法从人外周血单个核细胞中分选CD14＋单核细胞，分离后的细胞用流式细胞仪检测其纯度，用含有10％人AB血清和10 ng／ml人M－CSF的IMDM培养基体外培养CD14＋单核细胞，诱导分化成巨噬细胞，并进行形态特征和吞噬功能鉴定。结果：免疫磁珠法能从外周血中分离到高纯度的CD14＋单核细胞，分选前CD14阳性率为10％，分选后CD14阳性率为85．8％。诱导培养7天后巨噬细胞的直径大可达40～45μm，大部分细胞呈煎蛋状，能有效地吞噬淋巴瘤Raji细胞。结论：从外周血中分离了高纯度的CD14＋单核细胞，诱导形成的巨噬细胞具有吞噬淋巴瘤细胞的功能。
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炎症性肠病小鼠体内树突细胞的免疫功能研究
目的 探讨2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的炎症性肠病(IBD)小鼠体内树突状细胞(DC)表型和功能的变化,以深入了解IBD的发病机制,为该病诊治提供新靶点.方法 采用TNBS制备小鼠IBD模型.HE染色,光镜下观察小鼠肠组织病理变化;流式细胞术检测小鼠脾脏DC上CD80、CD83和MHCII的表达;MTT法检测DC刺激T淋巴细胞增殖的能力;流式细胞术检测DC摄取抗原能力;ELISA法检测DC分泌IL-12水平.结果 光镜下可见IBD组小鼠肠黏膜弥漫性充血红肿,上皮脱落、坏死,溃疡形成,黏膜、黏膜下层有淋巴细胞浸润,提示造模成功;与正常对照组相比,IBD组小鼠DC上CD80、CD83和MHCII表达显著增加,刺激T细胞增殖的功能显著增强,摄取抗原能力明显下降,分泌IL-12能力显著增强.结论 TNBS诱导的IBD小鼠体内DC的表型和功能发生了变化,即表面共刺激分子表达增加、免疫功能亢进,免疫异常,可能为导致IBD发生发展的重要机制之一.
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CD40单克隆抗体的制备、筛选及功能鉴定
CD40是肿瘤坏死因子受体超家族成员之一,属于Ⅰ型跨膜糖蛋白,其自然配体是CD40L.CD40-CD40L信号通路在许多重要的生理和病理过程中都起到关键的调节作用.基于其在激活免疫应答中的重要作用,在肿瘤免疫治疗中,具有激活CD40-CD40L信号的CD40激动剂抗体可用于提高抗肿瘤免疫应答;在移植排斥和炎症反应中,CD40-CD40L信号也起重要作用,阻断CD40信号通路是目前治疗风湿性关节炎、肠炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化和糖尿病的一个重要靶点.制备CD40阻断性抗体或激动剂抗体不仅可用于检测CD40分子表达,还可以开发用于炎症性疾病或肿瘤治疗的免疫疗法.本研究表达CD40胞外段蛋白,通过免疫制备14株CD40单克隆抗体,筛选发现全部可作为western blotting检测CD40蛋白表达的抗体,9株CD40抗体可作为一抗用于流式细胞术检测人CD40表达,1株CD40抗体能阻断人CD40L和CD40相互作用.有意义的是,8株CD40抗体能激活人CD40分子信号通路,另外有10株能激活小鼠脾脏细胞CD40下游基因的表达,7株能上调小鼠脾脏B细胞表面共刺激分子CD86的表达.本研究制备一系列CD40抗体,可用于CD40检测、CD40信号的阻断或激活.
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发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒非结构蛋白 NSs的原核表达及初步鉴定
目的：克隆、表达发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒（SFTSV）非结构蛋白 NSs，对其功能初步鉴定。方法采用 PCR 法扩增经密码子优化后的 SFTSV NSs 基因，并克隆至 PGEX-4T-2载体中，构建原核表达载体 PGEX-4T-2-NSs，经酶切、测序鉴定后转化表达菌 BL21（DE3），再经诱导、纯化得到谷胱甘肽 S-转移酶（GST）-NSs 融合蛋白，用 Western Blot 验证融合蛋白 GST-NSs 的抗原性。结果成功构建了 GST-NSs 融合蛋白原核表达载体，并在 BL21细菌中获得高效表达；纯化后的融合蛋白具有良好的抗原性。结论实现了 SFTSV 重组 NSs 蛋白的原核高效表达，为进一步深入研究其结构与功能奠定了基础。
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水通道蛋白与放射性损伤
长期以来,人们普遍认为细胞内外的水分子是以简单的跨膜扩散方式来通过脂质双层膜,但某些细胞如红细胞、肾近曲小管上皮细胞对渗透压引起的水通透性很高,很难单纯以简单扩散来解释.Agre(1991年)在研究红细胞膜上人类RH抗原时时意外发现水通道蛋白(Aquaporins, AQPs) , Preston( 1992年)等[1]先后完成对AQPI DNA分子结构和功能鉴定,证明了该蛋白就是人们苦苦寻找的水通道蛋白,二者因此获得了2003年的诺贝尔化学奖.近年来,有关AQPs的研究取得了较为深人的进展.大量研究显示:水通道蛋白在人类疾病方面起了重要作用.但有关AQPs与放射性损伤研究极少,本文就此作一综述.
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关注乳腺癌早期诊断和治疗的进展
乳腺癌是妇女常见的恶性肿瘤之一,近年来其发病率不断上升.根据美国2010年发布的数据,2009年全美女性新发乳腺癌病例以207090例高居榜首,大大超过第2位消化系统肿瘤125 790例,死亡共39 840例;而男性也有1970例新发病例.随着工业化发展,我国乳腺癌发病率、死亡率在不断上升,并呈现出年轻化的趋势.另一方面,随着乳腺癌早期诊断和治疗实验研究的进一步发展,以基因工程、蛋白质组学、生物芯片技术为代表的高通量、自动化筛选技术的发展与广泛应用,人们对恶性肿瘤的认识逐步深入;各种细胞周期调控因子、信号传导通路、肿瘤相关基因的发现与功能鉴定,使阐明细胞恶性转化机制成为可能.目前围绕乳腺癌的实验研究的热点主要有以下几个方面.
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尘肺患者肺功能鉴定分析
尘肺病是严重危害粉尘作业工人身体健康的主要职业病之一.尘肺病患者的诊断与肺功能情况,是直接关系到尘肺患者的身心健康及寿命的一件大事.为探讨尘肺病患者的肺功能,进一步加强尘肺患者的诊断管理工作,我们于1998年3月对我市某钢铁厂323例尘肺病患者进行了肺功能鉴定,现将结果报告如下.
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癌胚抗原单链抗体-链亲和素融和蛋白的功能鉴定
目的: 用pET21原核表达系统表达癌胚抗原单链抗体-链亲和素融合蛋白.方法: 融合表达载体转化大肠杆菌菌株HMS174(DE3),用1mmol/L的IPTG诱导表达,表达产物行亲和印迹及免疫斑点分析.结果: SDS-PAGE表明,融合蛋白分子质量约57ku,亲和印迹及免疫斑点证实融合蛋白具有结合CEA与生物素的双特异性.结论: 原核表达系统可以表达具有双特异性的融合蛋白,该融合蛋白利用生物素标记的辣根过氧化物酶可直接检测抗原.
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手功能障碍法医学鉴定1例
笔者受理1例手功能障碍的损伤鉴定,参阅了近几年这方面的文章,发现关于手功能评定的讲述不够透彻,引自外国文献的量表、术语的理解方面也存在一些误差.而随着新标准的颁布,损伤手功能障碍已作了明确的量化,法医如何进行手功能丧失百分率的计算,尤其是拇指功能障碍的计算.笔者针对案例作一些分析.
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四肢大关节功能鉴定的认识误区与防范
关节活动度的测量结果直接关系到相应损伤程度、伤残等级的评定。鉴定人在使用鉴定标准中四肢大关节功能的量化条款进行具体操作时，往往不知不觉地走进一些认识的误区，以致造成错案。故正确认识四肢大关节功能的有关基本概念，并采取适当的措施，能有效地避免发生下述认识性错误，保证法医学鉴定的准确性、科学性。
