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蝎镇痛活性肽AS的一个二硫键对镇痛活性的影响
目的 研究蝎镇痛活性肽AS中二硫键C12-C62对其生物活性的影响.方法 利用一步聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)分别用Ser替代蝎镇痛活性肽AS中第12位、第62位及第12位和第62位的Cys,从而构建其3个突变体.采用金属离子螯合亲和层析方法对表达突变体蛋白进行纯化.采用小鼠扭体法测定3个突变体的镇痛活性.结果 构建了3个突变体质粒,在BL21(DE3)中实现了可溶性表达.采用金属离子螯合层析方法获得了电泳纯样品.其镇痛活性明显低于Bmk AS(P<0.01).结论 3个突变体与rBmK AS镇痛活性有明显差异,二硫键C12-C62与蝎毒镇痛活性密切相关.
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109.趋化因子
自从1989年发现对中性粒细胞具有强烈趋化活性的白细胞介素-8(IL-8)之后,又发现一些与IL-8同源性虽不是很高,但具有类似结构,即有四个胱氨酸残基,分子量在10000左右的分子.这些分子是特定地对白细胞具有趋化性(chemotaxis)的细胞因子,统称为趋化因子(chemokine).其具有的第1、3和第2、4位胱氨酸残基形成二硫键结合,致使趋化因子的二硫键之间形成3列β-折叠结构和在C末端形成α-螺旋结构.趋化因子受体是G蛋白偶联受体,具有7个跨细胞膜结构.
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IgG4表达调控因素及在疾病发生与治疗中的作用
人类免疫球蛋白G4(Immunoglobulin G4,IgG4)是IgGs的亚型. IgGs在初次免疫应答中被较迟分泌,在二次免疫应答中被记忆 B 细胞大量分泌.IgGs依据重链序列、铰链区长度及链间二硫键连接位置和数目的差异,被分为 IgG1、IgG2、IgG3 和IgG4[1]. 健康个体 IgG4 血浆浓度仅为0.08 ~1.4 mg/ml,IgG4/IgG比值为0.8%~11.7%.
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脂蛋白(a)与冠状动脉粥样硬化狭窄程度的相关性分析
脂蛋白(a)(lipoprotein(a),Lp(a))是1963年被挪威遗传学家 Berg[1]首先发现且命名的,由低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)与载脂蛋白(Apo)A 通过二硫键[2]组合而成。Lp(a)是公认的心血管独立危险因素,有研究表明,随着 Lp(a)血清浓度的升高,动脉粥样硬化发病率明显的增加[3],罹患冠心病的危险性也明显增高[4,5],而且血清 Lp(a)浓度与冠心病的严重程度呈正相关[6],但也有几项研究未能证实这种相关性[7,8]。本研究主要探讨冠心病患者血清 Lp(a)水平与冠状动脉粥样硬化狭窄程度是否存在相关性。
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血清脂蛋白(a)检测在临床疾病诊断中的意义
血清脂蛋白(a)[Lipoprotein(a),Mp(a)]是1967年由挪威遗传学家Berg[1]首先发现并命名的,主要由蛋白质、类脂和糖类组成,是载脂蛋白a(Apoa)和载脂蛋白B(ApoB)两部分以二硫键共价结合的一种低密度脂蛋白(LDL).Lp (a)的升高与许多疾病密切相关.本研究首先对心脑血管疾病、肾病、2型糖尿病患者以及正常对照组个体的血清中Lp (a)含量进行测定,以探讨其在临床疾病诊断中的作用.并对冠心病(CHD)组与对照组做进一步比较,分析CHD患者的血清Lp(a)水平,旨在评价Lp (a)对CHD的诊断价值及地位.
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类胰岛素生长因子系统与内膜异位症
1类胰岛素生长因子(IGF)的生物化学IGFs是小分子量多肽,IGF-1有70个氨基酸,IGF-2有76个氨基酸[5].两种分子有62%的氨基酸同源性.它们的结构与胰岛素相似,是包括含有3个二硫键桥的多肽链.IGF-1的基因编码区位于12染色体长臂上,含6个外显子;IGF-2的基因编码区位于11染色体短臂上,与胰岛素基因毗邻[1,2].IGF主要合成部位是肝细胞,其合成受GH和营养因子的调节[3].
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不同温度对人类肽基脯氨酰顺反异构酶蛋白及突变体交联反应的影响
目的:研究不同温度对人类肽基脯氨酰顺反异构酶( hPPI)体外交联反应的影响。方法以人总 RNA为模板设计正反引物进行hPPI基因克隆,以获取的正常型表达载体为模板,利用PCR定点突变的方法将hPPI基因中两个半胱氨酸( Cys)突变为丝氨酸( Ser),经异丙基硫代半乳糖苷( IPTG)诱导表达正常型和突变型蛋白,在不同温度条件下进行蛋白交联反应,聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS-PAGE)鉴定交联现象。结论与溶菌酶表现相似,正常型hPPI蛋白交联反应随温度升高而逐渐加快,在达到蛋白变性温度时交联反应明显,出现大量二聚体和多聚体条带;将突变型hPPI蛋白置于与正常型hPPI蛋白完全相同的反应条件下,观察不到任何交联条带。结论热变性可显著改变蛋白高级结构,蛋白对热变性无明显特异性,在变性温度临界条件下表现出相同的聚合作用;二硫键可导致蛋白结构改变,从而影响交联结果。
关键词: 人类肽基脯氨酰顺反异构酶( hPPI) 蛋白质交联 定点突变 温度 二硫键 -
重组汉逊酵母表达的HBsAg P24亚基间二硫键桥联程度等生化性状分析
目的 分析重组汉逊酵母(Hansenula polymorpha,HP)表达的HBsAg(HP-HBsAg)P24亚基间二硫键桥联程度等生化性状.方法 采用蔗糖垫层离心法检测HBsAg的浮力密度,SDS-PAGE分析HBsAg P24亚基间结合程度的变化,高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)分析HBsAg VLP在硫氰酸盐处理前后百分含量的变化.以酿酒酵母(Saccharomyces cervesiae,SC)表达的HBsAg(SC-HBsAg)作为对照.结果 HP-HBsAg的浮力密度为(1.085±0.014) g/ml,与SC-HBsAg的浮力密度[(1.090±0.009) g/ml]接近.SDS-PAGE分析表明,未经硫氰酸盐处理时,HP-HBsAg不能进入分离胶,而SC-HBsAg能进入分离胶;经硫氰酸盐处理后,HP-HBsAg和SC-HBsAg均不能进入分离胶.HPLC分析表明,流动相中含SDS时,HP-HBsAg VLP的百分含量在经硫氰酸盐处理前后变化不明显,SC-HBsAg VLP的百分含量在经硫氰酸盐处理后较处理前升高;在经硫氰酸盐处理前后,HP-HBsAgVLP的百分含量均高于SC-HBsAg.结论 HP-HBsAg的浮力密度与SC-HBsAg相近,HP-HBsAg P24亚基间二硫键桥联程度较高,结合紧密,不需要经硫氰酸盐处理.
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液质联用法分析重组假丝酵母尿酸氧化酶的二硫键
目的 采用液质联用法分析重组假丝酵母尿酸氧化酶的二硫键数量及存在方式.方法 将重组假丝酵母尿酸氧化酶分别进行烷基化及变性后烷基化处理,液质联用法测定未处理及两种不同方法处理后的尿酸氧化酶的平均相对分子质量,根据测定结果判断其二硫键数量及存在方式.结果 未处理样品的平均相对分子质量为34 076.80,表明该蛋白以单体形式存在,不存在链间二硫键;直接烷基化样品平均相对分子质量为34 133.40,仅有一个游离巯基被烷基化;变性后烷基化样品的平均相对分子质量为34 304.80,4个游离巯基全被烷基化,蛋白不存在链内二硫键.结论 重组假丝酵母尿酸氧化酶中的4个半胱氨酸未形成链间及链内二硫键.
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抗体分子内的自由巯基和三硫键修饰
IgG抗体分子由两条重链和两条轻链通过链间二硫键共价交联,重链和轻链的每个结构域还各含有1对链内二硫键.含完整二硫键的天然IgG不应含有自由巯基,但抗体分子内含少量自由巯基是一种普遍现象,而且在不同IgG分子内甚至具有相似的分布形式.在人各种IgG分子内均检测到了三硫键的存在.本文对IgG分子内的自由巯基和三硫键修饰作一综述.
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重组单抗药物的非还原电泳纯度分析
目的 对重组单抗药物的非还原电泳纯度进行分析,排除样品制备过程中形成的一些假象.方法 结合重组单抗的分子结构特征,改变常规SDS-PAGE条件,将抗体样品在不同的缓冲液及电泳条件下进行比较.结果 抗体在非还原SDS-PAGE纯度检测中出现的次带,可通过在供试品缓冲液中加入烷基化试剂封闭自由巯基而几乎全部消除;通过降低电泳过程的环境温度,可有效降低主带上方高相对分子质量带的出现.结论 单抗药物中由于含有多对二硫键引起的一些因电泳样品制备而形成的假象带,可以通过试验方法的修正而去除.
关键词: 重组单抗 非还原SDS-PAGE 纯度 二硫键 -
肝细胞生长因子与肝损伤的研究进展
肝细胞生长因子是一种具有多种生物学活性的细胞因子;主要由Ito/肝脂肪储存细胞分泌,成熟的HGF是由二硫键相连的一条重链和一条轻链所组成的杂二聚体糖蛋白,通常与肝细胞膜上HGF受体结合,传递促再生信号,对原代培养的肝细胞有很强的丝裂原作用[16].肝再生过程包括再生启动和再生停止,HGF是肝脏再生的启动子,肝再生过程得以精确完成,有赖于机体自分泌的大量细胞因子的作用.研究发现HGF具有抗肝损伤作用,对肝损伤具有保护作用.本文将近年来HGF在肝损伤方面的研究进展综述如下.
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β2-微球蛋白测定的临床应用
β2-微球蛋白(β2-MG)1968年由瑞典Berggard[1]首先从肾小管蛋白尿中分离发现,是由淋巴细胞、血小板、多形核白细胞产生的一种内源性低分子量血清蛋白质,相对分子质量为11 800,它是主要组织相容性抗原(HLA)的β链(轻链)部分(为一条单链多肽),存在于细胞的表面,由人第15号染色体的基因编码,分子内含一对二硫键,不含糖,广泛存在于血浆、尿液、脑脊液、唾液以及初乳中,含量极微.
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类风湿性关节炎治疗药阿达木单抗(adalimumab)
1商品名Humira2结构特点本品为抗人肿瘤坏死因子(TNF)的人源化单克隆抗体,是人单克隆D2E7重链和轻链经二硫键结合的二聚物.
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非肽类内皮素受体拮抗剂的临床研究进展
内皮素(endotheIin,ET)是含21个氨基酸的多肽,有2个二硫键,属于角蝰毒素(sarafo-toxin)家族.已证实内皮素有ET-1、ET-2、ET-3三种,是由内皮素原产生的大内皮素在内皮素转化酶作用下分解而产生的活性蛋白.内皮素与它的G-蛋白偶联受体相互作用,产生重要的生理、病理效应.
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生物镇痛新药--克洛曲片
克洛曲片是由上海丽珠制药有限公司与中国科学院昆明动物所毒素蛇资源开发中心共同研制的非吗啡类中重度镇痛新药.它是由纯化的眼镜蛇神经毒素、曲马多、布洛芬按1:150:300组成,三者通过不同的作用机理协同发挥镇痛作用.纯化的眼镜蛇神经毒素是由61个氨基酸残基组成的蛋白质,富含赖氨酸和精氨酸等碱性氨基酸,有4个二硫键,分子量为6940道尔顿.
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氧化还原调控的甲氧基聚乙二醇-二硫键-聚乙烯亚胺非病毒基因载体的研制
合成了氧化还原调控的甲氧基聚乙二醇-二硫键-聚乙烯亚胺[methoxy poly (ethylene glycol)-SS-polyethylenimine,mPEG-SS-PEI].采用薄层色谱验证了该聚合物中二硫键的存在.琼脂糖凝胶电泳结果显示,mPEG-SS-PEI-pEGFP复合物在含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液中稳定.透射电镜观察表明,不含二硫键的mPEG-PEI及mPEG-SS-PEI 与pEGFP复合物的粒径均约为200 nm.体外转染试验中,荧光显微镜定性及流式细胞定量结果均表明,与mPEG-PEIpEGFP相比,mPEG-SS-PEI-pEGFP能显著提高对U87细胞的转染效率.原因是mPEG-SS-PEI-pEGFP复合物进入细胞后能在较高浓度谷胱甘肽的还原下脱去PEG,从而恢复PEI的质子泵效应.并且,聚合物中加入二硫键未显著增加PEG化PEI的体外细胞毒性.
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脱苏氨醇奥曲肽的微波辅助合成
利用自制100ml微波反应管通过微波辅助固相肽合成技术制得奥曲肽原料药中关键有关物质脱苏氨醇奥曲肽(1).采用Fmoc策略以2-Cl-Trt-树脂为固相载体,经上载、缩合、脱保护、裂解等操作合成还原型脱苏氨醇奥曲肽,再用空气氧化法并加入活性炭快速氧化得到1,总收率62.9%,单批次产量达3.5 g,中间体及终产物经高分辨质谱及氨基酸分析确证,并通过圆二色谱法研究了环合前后多肽构象的变化.该方法比传统固相合成方法快捷,为研究奥曲肽的关键有关物质提供了可行的合成方法.
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可卡因-苯丙胺调节转录肽(CART)及其突变体的表达纯化及生物活性观察
目的:表达纯化可卡因-苯丙胺调节转录肽(CART)及其突变体,观察其对大鼠进食行为的影响.方法:PCR扩增CART活性片段CART55-102 cDNA,构建表达CART55-102原核表达载体,并对其68位和94位半胱氨酸残基突变,构建表达CART55-102(Cys68Ser)和CART55-102(Cys94Ser)原核表达菌株,经IPTG诱导表达后,亲和层析纯化3种小肽;行为学技术检测原核表达小肽对大鼠进食行为的影响.结果:获得的重组CART55-102及其突变体的纯度在95%以上,产物得率约75%;CART55-102可显著抑制饥饿大鼠的进食行为,而68和94位突变体对饥饿大鼠的进食行为无明显影响.结论:原核表达系统可以成功制备高纯度CART活性小肽和突变体,68位和94位突变导致CART抑制进食的作用消失.
关键词: 可卡因-苯丙胺调节转录肽 突变体 基因表达 纯化 二硫键 -
胰岛素样生长因子-Ⅰ受体蛋白在瘢痕疙瘩中的表达
研究发现胰岛素样生长因子(IGF)-Ⅰ能降低烧伤后增生性瘢痕中成纤维细胞合成胶原酶mRNA的水平和胶原酶的活性[1].IGF-Ⅰ的功能主要靠与IGF-Ⅰ受体(IGF-Ⅰ R)结合来介导完成.成熟的IGF-Ⅰ R由4个亚基(α2β2)组成.位于细胞外的α链具有配体结合部位,通过二硫键与β链共价连接.β链有跨膜和胞内部分,具有酪氨酸激酶活性部位.本研究主要观察正常成纤维细胞和瘢痕疙瘩成纤维细胞中IGF-Ⅰ Rα亚单位的表达,以进一步探讨IGF-Ⅰ和IGF-Ⅰ R通路在瘢痕疙瘩形成中的作用.