免疫学杂志
Immunological Journal 면역학잡지
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利用多种表面标志鉴别正常人外周血初始和记忆T细胞亚群
目的探索能够准确鉴别初始和记忆T细胞亚群的表面标志及其关联性.方法自正常人静脉血中分离PBMCs,同时加入9种不同标记的抗体,进行染色,利用流式细胞仪检测,并分析结果.结果CD45RA+CD4+T细胞均表达CD27、CCR7、CD28和CD62L,而在CD45RA-CD4+T细胞中,约有75%的细胞表达CD27,30%为CCR5+,90%为CCR7+,99%为CD28+,70%为CD62L+.与其相一致的是在CD62L+CD4+T细胞中,大约60%的细胞为CD45RA+,但CD62L-CD4+T细胞中,大约95%的细胞为CD45RA-.在CD8+T细胞中,大约有78%的细胞为CD45RA+,其余为CD45RA-.CD45RA+CD8+T细胞的表型与CD45RA+CD4+T细胞基本相似.结论同时检测多种T细胞表面标志,深入了解T细胞各亚群的表型特征,对疾病的诊断、治疗、预后判断以及疫苗的设计和效果评价具有重要的指导意义.
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Fucoidan选择性抑制LPS诱导巨噬细胞分泌IL-12
目的探讨配体fucoidan活化清道夫受体后能否抑制LPS刺激巨噬细胞分泌IL-12.方法不同剂量的fucoidan(以多价阴离子chondroitin为阴性对照)与RAW264.7作用10 min后,加入等量的LPS刺激,检测上清中IL-1270、IL-6和TNF-α;同时观察不同剂量fucoidan对RAW264.7贴壁的影响.结果不同剂量的fucoidan能不同程度促进LPS诱导RAW264.7分泌炎症因子IL-6和TNF-α,但却能明显地抑制IL-12的分泌;随着所加fucoidan量的增加,RAW264.7细胞的贴壁能力逐渐下降.结论Fucoidan可能通过与清道夫受体SR-A(scavenger receptor A)结合发挥其特异抑制LPS诱导巨噬细胞分泌IL-12的作用.
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ERK 1/2介导结缔组织生长因子刺激系膜细胞产生MCP-1
目的检测结缔组织生长因子(CTGF)是否刺激大鼠肾小球系膜细胞分泌单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1),并探讨其作用机制.方法应用CTGF刺激静息的培养的系膜细胞,在刺激后不同时间点应用RT-PCR方法测定MCP-1的mRNA表达,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定上清液中MCP-1,应用趋化试验测定上清液对单核细胞(THP-1)的趋化作用.应用Western blot测定CTGF对细胞外信号调节激酶(ERK)1/2磷酸化的作用.应用ERK1/2抑制剂PD98059预处理,观察CTGF对上清液中MCP-1分泌的影响.结果应用CTGF刺激后,系膜细胞的MCP-1的mRNA表达上升,上清液中分泌量增加.MCP-1抗体可部分阻止上清液对单核细胞的趋化作用.CTGF诱导ERK1/2磷酸化,而PD98059可抑制这一作用,并部分抑制CTGF诱导的上清液中MCP-1的分泌.结论CFGF可引起系膜细胞分泌MCP-1,其作用机制部分依赖于ERK1/2的磷酸化.
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激活素A对RAW264.7巨噬细胞活性的调节作用
目的探讨激活素A对参与炎症反应的小鼠巨噬细胞活性调节作用.方法以LPS刺激活化的小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞作为阳性参照,ELISA法检测激活素A及LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞系RAW264.7细胞IL-1β分泌水平,还原酶法分析NO分泌水平,RT-PCR检测IL-1β和iNOS mRNA的表达,瑞氏染色检测RAW264.7细胞吞噬活性.结果在激活素A刺激下RAW264.7细胞IL-1β和NO分泌水平均明显升高,IL-1β和iNOS mRNA表达亦增加,巨噬细胞吞噬活性增强;激活素A和LPS共刺激RAW264.7细胞时,激活素A明显抑制LPS刺激的RAW264.7细胞IL-1β和NO产生水平,以及IL-1β和iNOSmRNA表达,巨噬细胞吞噬活性也明显低于LPS单独刺激组.结论激活素对巨噬细胞的活性调节具有双重作用,这种作用与巨噬细胞的激活状态有关.
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中药狼疮方对狼疮样BXSB小鼠肺组织CD134/CD134L和RANTES表达的影响
目的探讨中药狼疮方对狼疮样BXSB小鼠肺组织CD134/CD134L和RANTES表达的影响.方法采用BXSB小鼠模型,随机分为3组:狼疮方治疗组、强的松治疗组、未治疗组,每组6只,疗程10周.另设与BXSB小鼠同基因的正常C57BL/6小鼠6只为正常对照组.分别取小鼠肺组织,应用逆转录-荧光定量-聚合酶链反应(RT-FQ-PCR)技术定量测定小鼠肺组织CD134、CD134L和趋化因子RANFES的mRNA表达水平.结果①未治疗组小鼠肺组织CD134、CD134L mRNA和RANTESmRNA的表达水平都显著高于正常对照组(P＜0.01,P＜0.05);经强的松或中药狼疮方治疗后,BXSB小鼠肺组织CD134、CD134L及RANTES的mRNA表达都受到明显抑制,显著低于未治疗组(P＜0.01,P＜0.05);且接近正常水平,与正常对照组无显著性差异(P＞0.05).②BXSB小鼠肺组织RANTES的mRNA表达水平与CD134L的mRNA表达水平呈显著的正相关关系(r=0.793,P＜0.05),而与CD134的mRNA表达水平无显著的相关关系(r=0.412,P＞0.05).结论中药狼疮方具有与强的松类似的免疫抑制作用,可显著抑制狼疮样小鼠肺组织CD134/CD134L共刺激信号表达;并下调肺组织RANTES mRNA表达水平,具有一定的肺脏保护作用.
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内毒素刺激人脐静脉内皮细胞免疫相关分子的表达
目的了解内毒素(LPS)刺激活化人脐静脉内皮细胞(HUVEC)后,与免疫相关的膜分子和细胞因子表达及变化情况,以探讨LPS激活内皮细胞后对免疫应答可能的影响.方法胰蛋白酶法分离培养人脐静脉内皮细胞,用RT-PCR观测未刺激和用LPS刺激的内皮细胞HLA-DR,CD80、CD86、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-DC、HVEM、TR6、LTβR、LIGHT、OX40、OX40L等免疫相关分子的mRNA表达情况;用流式细胞仪技术检测CD40、CD137、ICAM-1蛋白的表达情况;ELISA检测细胞因子IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-γ的含量.结果①RT-PCR结果显示,未经刺激的人脐静脉内皮细胞表达B7-H2、B7-H3、TR6、LTβR,并在LPS刺激后表达上调;B7-DC、HUVEM虽呈组成性表达,但在LPS刺激后未见变化;B7-H1、B7-H4仅在内皮细胞上为诱导表达;而CD80、CD86、LIGHT、HLA-DR、OX40无论刺激与否均未表达.②流式细胞仪检测证实其细胞表面表达少量CD137、CD40及ICAM-1,LPS刺激后其表达水平明显提高;③ELISA检测发现,内皮细胞在未激活状态下就能够分泌IL-6、IL-8和TNF-α,且LPS刺激后提高其分泌量.结论人脐静脉内皮细胞组成性表达多种免疫相关分子,LPS激活内皮细胞可以显著上调其表达.人脐静脉内皮细胞由于缺少CD80、CD86的共刺激信号,不能活化初始T细胞而只能向活化及记忆性T细胞提供共刺激信号在调节特异性免疫应答的过程中,可能会起到负调控的作用.
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维生素D3靶控雌激素受体α表达载体的构建及其对乳腺癌作用的研究
目的构建受1α,25二羟维生素D3调控的雌激素受体α表达载体(VDRE-Tk-ERα),并观察其对雌激素受体阴性乳腺癌细胞的增殖抑制效应.方法利用PCR法得到含有4个拷贝VDRE和Tk启动子的序列并用其替换掉雌激素受体α载体的CMV启动子从而得到VDRE-Tk-ERα表达载体.利用脂质体法将其转染入雌激素受体阴性乳腺癌细胞中并利用MTT法观察其对乳腺癌细胞的抑制效应.结果一定剂量的1α,25二羟维生素D3能够通过VDRE调控下游报告基因的表达,同时在加入他莫西芬后能够显著抑制转染了VDRE-Tk-ERα表达载体的雌激素受体阴性乳腺癌细胞的增殖活性.结论通过该方法能够显著恢复和增强雌激素受体阴性乳腺癌细胞对他莫西芬和1α,25二羟维生素D3的化疗敏感性.
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输注同种异基因凋亡淋巴细胞在受体内的分布
目的探讨供体凋亡淋巴细胞诱导移植耐受模型中转输细胞的作用.方法用荧光标记供体脾淋巴细胞,诱导凋亡后分离纯化.将标记细胞经尾静脉输入受者,于不同时间点取肝、脾、肺脏进行荧光细胞分布观察与测定.结果除初30 min内荧光标记细胞在肺脏短暂汇集,从开始到其后12 h内一直以肝脏内荧光细胞比例高.脾脏内荧光细胞比例远远低于肝脏.12 h各器官荧光细胞基本消失.结论异源供者凋亡淋巴细胞经转输后主要聚集并驻留于肝脏.鉴于肝脏本身的特殊免疫功能,初步推测肝脏为转输异源凋亡细胞发生作用的关键位点.
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雌二醇、孕酮对小鼠同种异基因移植物的影响
目的通过研究雌二醇(E2)、孕酮(P4)对小鼠同种异基因移植物存活时间的影响,探讨妊娠期间母体外周血中雌、孕激素水平对母体免疫应答能力以及对母胎免疫耐受的影响.方法雌性受体小鼠通过切除双侧卵巢去势,胃饲E2或P4,使外周血E2或P4浓度达到相当于小鼠妊娠中期水平.以腹腔注射CsA的小鼠作为对照,进行耳后同种异基因半心移植,观察各组移植物存活时间,并取移植部位组织进行石蜡切片HE染色.结果同基因移植组心肌长期存活(＞300 d),异基因移植对照组心肌平均存活时间为(12.8±0.8)d.与异基因移植对照组比较,CsA组心肌存活时间显著延长(＞20d),P＜0.01;E2组移植心肌存活时间显著缩短(9.7±0.5)d,P＜0.01;P4组心肌存活时间与对照组比较无显著差异,平均(12±0.6)d,P＞0.05.结论妊娠期母体外周血中E2和P4水平对母体的系统性免疫应答无明显抑制作用,不是维持非胎盘部位母胎免疫耐受的主导性因素.
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抑制Blimp-1表达导致浆细胞去分化
目的探讨转录因子Blimp-1在浆细胞发育中的作用.方法应用慢病毒载体稳定表达针对Blimp-1的siR-NA,抑制骨髓瘤细胞J558L中Blimp-1的表达.采用免疫荧光及流式细胞技术观察Blimp-1抑制前后细胞的免疫表型变化,半定量RT-PCR检测XBP-1、J-chain、c-myc、BCMA的变化.结果Blimp-1抑制后,浆细胞表面标志CD138表达显著下降,B淋巴细胞免疫标志CD19表达增加.同时,与浆细胞功能及存活密切相关的XBP-1、J-chain、BCMA基因表达下降,而促进B淋巴细胞增殖发育的c-myc表达上升.结论浆细胞中Blimp-1被抑制后,浆细胞发育程序出现再编程,发生了去分化现象,返回到更早期的发育阶段,提示Blimp-1特异性shRNA有可能用于浆细胞相关疾病的治疗.
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血管活性肠肽对leydig细胞分泌的IL-1、IL-6和TGF-β的影响
目的研究血管活性肠肽(VIP)对感染时的leydig细胞分泌的细胞因子IL-1、IL-6和TGF-β的影响.方法SD大鼠的睾丸经Ⅱ型胶原酶消化、过滤及Percoll分离获得高纯度、高活率的leydig细胞,经不同剂量的VIP作用后,再感染溶脲脲原体(UU),观察在UU感染时,不同剂量VIP对leydig细胞分泌的IL-1(MTT法)、IL-6、TGF-β(ELISA法)的影响.结果UU感染时,VIP对leydig细胞分泌的细胞因子有明显的影响:能促进leydig细胞分泌IL-1(活性)、抑制IL-6(含量)分泌;同时既能促进(高剂量VIP)又能抑制(低剂量VIP)TGF-β分泌.结论在UU感染时,VIP能改变大鼠leydig细胞细胞因子的分泌格局,表明VIP在抗感染免疫中具有一定的免疫调节作用.
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NF-κB p65亚基DNA结合域相互作用多肽的筛选及功能鉴定
目的以NF-κB p65亚基DNA结合域为诱饵蛋白,筛选能够与其发生相互作用的多肽,并鉴定这些多肽对NF-κB DNA结合活性的抑制效应.方法首先利用PCR搭桥扩增方法获取NF-κB p65亚基DNA结合域的基因片段,后将其克隆到酵母双杂交pGBKT7 DNA-BD载体上,与GAL4 DNA-BD融合,形成GAL4 DNA-BD/p65BD融合蛋白;再以GAL4 DNA-BD/p65BD融合蛋白为诱饵蛋白行酵母双杂交实验,自16肽随机肽库中筛选与NF-κB p65亚基DNA结合域相互作用的多肽;后选择性人工合成筛选获得的多肽,并进行EMSA实验检测相互作用多肽对NF-κB DNA结合活性的抑制效应.结果扩增获得了NF-κB p65亚基DNA结合域的基因片段,并成功构建pGBKT7 DNA-BD/p65BD载体.自1.28×107个酵母转化子中终筛选获得5个阳性克隆,测序结果和同源氨基酸序列比对表明5个阳性多肽为p65BD新型相互作用多肽,其中4条多肽拥有一个共同的基序.EMSA实验结果表明合成的两条多肽对NF-κB的DNA结合活性均具有一定的抑制效应.结论经初筛、复选和假阳性鉴定,自16肽库中获得5个能与NF-κB p65亚基发生相互作用的新型多肽,并已证实其中两条多肽对NF-κB的DNA结合活性具有抑制效应.
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利用乳糖化羧甲基壳聚糖构建小鼠OX40转基因细胞株
目的利用乳糖化羧甲基壳聚糖(Lac-CMCS)构建小鼠OX40转基因细胞株,探讨Lac-CMCS在HepG2细胞定向转染中的可行性.方法从Con A活化的小鼠脾淋巴细胞中提取总RNA,应用RT-PCR方法,扩增获得编码小鼠OX40分子的cDNA,并将其克隆到pUCm-T载体,测序证实后构建pIRES2-EGFP-OX40重组真核表达载体,利用Lac-CMCS与载体偶联靶向性转染HepG2细胞,G418筛选,RT-PCR法鉴定获得表达OX40分子的阳性细胞株.结果pUCm-T-OX40和pIRES2-EGFP-OX40经PCR、酶切和测序分析,证实插入的目的片段与GenBank记载的小鼠OX40 cDNA序列完全一致.利用Lac-CMCS能将小鼠OX40靶向转染HepG2细胞并获得表达;经G418筛选后获得稳定表达小鼠OX40的细胞株.结论利用Lac-CMCS能够成功将OX40靶向转染入HepG2细胞中.
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骨髓瘤抗原Sp17 HLA-A*0201限制性CTL表位预测及初步鉴定
目的鉴定骨髓瘤抗原Sp17的HLA-A*0201限制性CTL表位.方法采用超基序和量化基序法预测Sp17的HLA-A*0201限制性CTL表位;用T2细胞亲和力实验和稳定性实验对该表位进行初步鉴定.结果超基序和量化基序法预测得出Sp17抗原的4个CTL表位(LLEGLTREI(19-27)、ILREQPDNI(27-35)、SLLEKREKT(45-53)、KEKEEVAAV(111-119)),亲和力实验结果表明LLEGLTREI(19-27)、ILREQPDNI(27-35)、SLLEKREKT(45-53)有较高亲和力,而KEKEEVAAV(111-119)肽亲和力较低;稳定性实验表明ILREQPDNI(27-35)、SLLEKREKT(45-53)与HLA-A*0201分子结合稳定性较好.结论ILREQPDNI(27-35)、SLLEKREKT(45-53)有可能是骨髓瘤抗原Sp17 HLA-A*0201限制性CTL表位.
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慢性乙型肝炎患者HBV特异性CTLs的KIR表达研究
目的检测慢性乙型肝炎患者外周血中HBV特异性CTL细胞表面杀伤细胞抑制性受体(KIR)的表达情况.方法利用MHC-Ⅰ-肽-五聚体(pentamer)技术结合流式三色分析技术,直接离体情况下检测(direct ex vivo)慢性乙型肝炎患者不同HBV特异性CTL细胞表面KIR的表达情况.结果在慢性乙型肝炎患者,KIR阳性的CD8+T细胞明显增加;KIR阳性的HBcAg(18-27)特异性CTL、HBeAg(335-343)特异性CTL、HBp(575-583)特异性CTL的百分比分别为12%、20%、35%.结论慢性乙型肝炎患者不同HBV特异性CTL表达KIR,这可能与慢性乙型肝炎患者HBV特异性CTL功能低下密切相关.
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TCR Vβ2、Vβ5和Vβ17-Dβ1 sjTRECs在正常人胸腺、脐血和外周血中的检测情况
目的建立检测TCR Vβ2、Vβ5和Vβ17-Dβ1 sjTRECs的方法,分析其在胸腺细胞、脐血和正常人外周血T细胞中的存在情况,从而了解近期胸腺输出相应的TCR Vβ亚家族naive T细胞的情况.方法利用半巢式PCR分别扩增3例正常胸腺细胞、10例脐血和10例正常人外周血单个核细胞DNA中的Vβ2、Vβ5和Vβ17与Dβ21基因片段重排时产生的sjTRECs.结果在正常胸腺细胞、脐血和正常人外周血单个核细胞中均可检测到Vβ2、Vβ5和Vβ17与Dβ1片段形成的sjTRECs,其中胸腺细胞和脐血单个核细胞DNA中3种删除环的检出率均为100%,正常人外周血3种删除环的检出率分别为50%、70%和40%.结论成功地建立检测3种Vβ-Dβ1 sjTRECs的方法,并提供了Vβ2、Vβ5和Vβ17亚家族sjTRECs在胸腺、脐血和外周血中的检测情况.
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中枢神经系统损伤与自身免疫神经保护的遗传特性
目的研究中枢神经系统(central nervous system,CNS)损伤时,不同品系大鼠的表现,探索自身免疫神经保护的遗传特性.方法Sprague-Dawley(SD)大鼠、Wister大鼠各30只.髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)免疫后分别制备实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)和脊髓损伤动物模型,并进行EAE评分,损伤模型的行为学和组织学分析.结果Wister大鼠较SD大鼠EAE发病早、症状重、时间长;脊髓损伤后神经功能恢复结果亦差.结论对EAE敏感的Wister大鼠,体内缺乏自身免疫保护机制.不同品系大鼠在CNS损伤时,其遗传基因决定了终的康复效果.
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CDH1基因启动子甲基化在上皮性卵巢癌转移方面的研究
目的探讨CDH1基因启动子甲基化对上皮性卵巢癌转移的影响.方法采用免疫组织化学方法检测38例正常卵巢上皮和80例上皮性卵巢癌组织中E-钙黏附素(E-cadherin)表达;应用甲基化特异的PCR(MSP)检测上述组织中CDH1基因启动子区甲基化;应用5-氮-2′-脱氧胞苷(5-aza-CdR)使SKOV3细胞去甲基化,观察SKOV3细胞体外侵袭性的改变,并通过RT-PCR检测CDH1基因的改变.结果E-cadherin在正常卵巢组织中表达明显高于上皮性卵巢癌(P＜0.05).34例CDH1基因启动子区甲基化全部出现在卵巢癌组织中,有淋巴结转移组织中甲基化明显高于无淋巴结转移者(P＜0.05),而CDH1基因启动子区有甲基化的卵巢癌组织中E-cadherin表达明显降低(P＜0.05).经5-Aza-CdR处理后的SKOV3细胞体外侵袭性降低(P＜0.01),CDH1基因的表达明显上调(P＜0.01).结论E-cadherin表达降低与上皮性卵巢癌转移关系密切,CDH1基因启动子区甲基化可能是导致E-cadherin蛋白表达减低的重要原因之一,因此启动子区甲基化与上皮性卵巢癌转移有关.
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山东沿海地区碘营养状况和HLA等位基因DQA1*0501、DQA1*0201对AITDs发病的影响
目的探讨山东沿海地区自身免疫性甲状腺病(AITDs)与HLA等位基因DQA1*0501、DQA1*0201及碘营养状况对AITDs发病的影响.方法HLA等位基因测定采用PCR-SSP技术,尿碘浓度测定采用砷铈催化分光光度法.结果①DQA1*0501等位基因为AITDs易感基因(GD和HT的OR值=2.14、2.5);而DQA1*0201为女性AITDs保护基因(GD和HT的OR值=0.33、0.27).②AITDs组尿碘浓度高于300 μg/L患者分布频率均显著高于对照组(P＜0.05),且DQA1*0501(+)发生AITDs的OR值为2.7,DQA1*0201(+)的OR值为0.42;AITDs组碘正常组DQA1*0501(+)OR值为5.12,DQA1*0201(+)的OR值为0.21.③logistic回归分析发现尿碘浓度对数、DQA1*0501为AITDs的易感因素,DQA1*0201为保护因素.结论HLA-DQA1*0501等位基因与该地区AITDs的发病易感性相关,而DQA1*0201与女性患者的保护性相关.碘和HLA等位基因DQA1*0501、DQA1*0201共同影响GD、HT的发病.
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抗血管紧张素Ⅱ1型受体抗体对自发性高血压大鼠血压和肾脏的影响
目的观察血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1受体)胞外不同肽段主动免疫对自发性高血压大鼠(SHR)血压和肾脏的影响.方法人工合成的AT1受体胞外肽段主动免疫SHR.动态监测SHR血压变化,观察肾脏组织病理变化,RT-PCR法检测肾脏组织原癌基因表达水平.结果ATR12181组血压为(179.0±13.6)mmHg较对照组(188.0±9.9)mmHg下降(P＜0.05).ATR12181组相比对照组肾脏病理变化减轻,ATR11188组相比对照组病变加重.ATR12181组c-fos、c-jun表达水平明显低于对照组(P＜0.05),ATR11188组则明显高于对照组(P＜0.05).结论不同肽段免疫产生的不同抗体对SHR血压和肾脏可产生不同的影响.
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Pokemon基因siRNA逆转录病毒重组表达质粒的构建及鉴定
目的针对Pokemon基因对于许多肿瘤抑制基因和原癌基因上游的作用,将其作为RNAi的靶基因,构建表达这些siRNA的重组逆转录病毒表达质粒.方法利用Ambion公司的网上设计工具设计针对Pokemon肿瘤基因的4条siRNA序列,并化学合成4对互补的siRNA的DNA片段.将此双链DNA片段克隆到pSilencer 5.1-H1 Retro vector的BamHⅠ和HindⅢ位点,构建其逆转录病毒重组表达质粒.结果表达人类Pokemon基因的siRNA逆转录病毒重组表达质粒构建成功.结论我们成功构建了人类Pokemon基因的重组逆转录病毒重组表达质粒,为下一步Pokemon基因的RNA干扰提供了实验依据,并且开辟了肿瘤基因治疗的新思路.
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表达pCDR1 Th表位减毒鼠伤寒沙门菌株的构建
目的构建表达pCDR1 Th表位的可口服减毒鼠伤寒沙门菌株.方法全基因合成pCDR1两条核苷酸链,在C端加上6-His标签,退火互补后插入原核表达载体pYA3149中,构建重组质粒pR1,将该重组质粒转入鼠沙门菌终宿主菌株X4550,获得杂合菌株X4550(pR1).体外诱导表达后斑点印迹鉴定表位肽的表达.结果酶切鉴定和基因序列测定显示重组质粒构建成功.体外诱导后6 h细菌裂解上清液中,检测到表位肽的表达,该蛋白能与鼠抗His单克隆抗体特异结合.重组菌株在体外营养选择压力下,可较稳定地携带重组质粒传代繁殖.结论成功构建了能稳定表达pCDR1 Th表位的可口服减毒鼠伤寒沙门菌株.
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丙型肝炎病毒核心基因重组腺病毒的构建、鉴定与表达
目的构建HCV C基因重组腺病毒,以期用于HCV C蛋白的功能研究.方法以含有丙肝病毒1b亚型核心基因的质粒pcDNA3.1/HCV-C为模板,PCR扩增HCV C基因,PCR产物双酶切后亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,与骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌内同源重组,获得重组腺病毒质粒pAd-C,PacⅠ酶切线性化后脂质体法转染293细胞进行包装,获得重组腺病毒Ad-C,继之在293细胞内扩增,利用报告基因GFP监测病毒滴度和感染效率,Western blot检测HCV C蛋白的表达.结果PCR及Western blot结果均证实重组腺病毒Ad-C构建成功.结论成功构建了重组腺病毒Ad-C,为进一步研究核心蛋白的生物学功能奠定了基础.
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汉滩病毒G1S0.7嵌合基因重组腺病毒的构建及鉴定
目的在本室前期工作的基础上构建汉滩病毒M基因G1片段与S基因0.7kb片段嵌合基因的重组腺病毒.方法构建含有汉滩病毒G1S0.7嵌合基因的转移载体pShuttle-G1S0.7,然后通过特异性的酶切将嵌合基因与腺病毒DNA相连,电转化E.coli JM109,获得重组腺病毒Adeno-G1S0.7 DNA,转染HEK293细胞得到重组腺病毒.进一步对重组腺病毒的滴度和表达产物进行鉴定.结果构建的含G1S0.7嵌合基因的重组腺病毒,滴度可达1013～1015PFU/L;该重组腺病毒感染Vero-E6细胞后,表达出可被抗汉滩病毒核蛋白及糖蛋白G1的特异性单抗(mAb)所识别的融合蛋白.结论利用腺病毒表达系统,成功地表达同时具有核蛋白及糖蛋白G1生物学活性的融合蛋白,为进一步研究其免疫学特性奠定了基础.
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沙鼠IgG兔抗血清的制备及其在IgG抗体检测中的应用
目的用纯化的蒙古沙鼠血清IgG制备相应兔抗血清,并用于幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)疫苗免疫后沙鼠血清中抗原特异性IgG的检测.方法采用饱和硫酸铵沉淀法和Q sepharose high performance阴离子交换层析法纯化蒙古沙鼠血清IgG,免疫日本大白耳兔制备兔抗沙鼠IgG抗血清并进行rProteinA亲和纯化,建立间接ELISA方法用于检测Hp疫苗注射免疫蒙古沙鼠后血清抗原特异性IgG水平.结果以纯化的蒙古沙鼠血清IgG(纯度大于98%)免疫日本大白耳兔获得相应兔抗血清,经亲和层析后其纯度大于90%,回收率约为85%,双扩效价为1:16,ELISA效价为1:320000;ELISA检测结果显示Hp疫苗注射免疫蒙古沙鼠于第2次免疫后产生高水平IgG,第4次免疫后第7天IgG水平达到高峰,随后几周仍然保持高水平.结论所制备的兔抗沙鼠IgG抗体可以用于蒙古沙鼠血清中抗原特异性IgG的检测.
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粉尘螨Ⅱ类变应原的克隆表达、纯化及其免疫学特性
目的获得大量具有良好的IgE结合活性的DerfⅡ重组变应原,以促进粉尘螨变态反应性疾病的特异性诊断及治疗的研究.方法挑取经纯培养的粉尘螨,提取总RNA,采用RT-PCR的方法扩增Der fⅡ片段,产物连接进入T载体(pMD18).经扩增后,用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后将目的片段连接到pET-24a表达载体上,得到重组质粒pET-Derf2,工程菌经IPTG诱导培养,明显表达出Der fⅡ蛋白,表达产物经固定化金属配体亲和层析纯化,用Western blot检测免疫学活性.结果成功提取粉尘螨的总RNA,扩增出编码129个氨基酸的长度为387个碱基对的核苷酸片段.序列分析结果和Genebank上的基因序列(D10448)同源性98%,其中有6个碱基不同.使用高效表达的原核载体pET,所得产物的5′端含有抗原性极小的6个组氨酸标签.表达质粒在E.coli BL21 star中得到高效表达,表达产物主要以包涵体形式存在,目的蛋白具有良好的变应原性.结论成功构建了粉尘螨Ⅱ类变应原的原核表达载体,并纯化了具有免疫特性的重组蛋白,为进一步开展DerfⅡ蛋白和重组疫苗研究奠定了基础.
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抗SARS抗体独特型单链抗体的筛选及鉴定
目的从人源噬菌体抗体库中筛选抗SARS独特型抗体为SARS的诊断及疫苗的研究奠定基础.方法以混合SARS病人恢复期血清免疫球蛋白(Ig)作为筛选分子,从噬菌体抗体库中筛选出能与病人血清IgG(IgM)结合的抗体,并通过与混合正常人血清Ig作负性筛选,从而获得抗SARS病毒的独特型抗体(Ald).通过4轮"吸附-洗涤-扩增",从后一轮所得单克隆菌株中分别通过ELISA筛选出能和SARS病人恢复期血清Ig结合的菌株,提取质粒DNA,并对PCR扩增产物进行DNA序列测定,后用所筛选的克隆通过与不同人群血清反应,证实其特异性.结果随机挑选经第4轮筛选后的200个单克隆菌落,其中有10个与SARS病人恢复期血清Ig结合的OD值明显高于其与正常人Ig结合的OD值;以上10个克隆经PCR扩增,其中有6个克隆于1 000bp处有电泳条带;其DNA序列经与BLASF数据库和IMGT/QUEST软件比对有5个均与人的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)高度同源,且与其同源性高的人Ig的VH属VHI亚群,VL属k链,属VKⅡ亚群;后确认有3个克隆其噬菌体抗体和SARS病人血清Ig结合的OD值均明显高于与正常人血清Ig结合的OD值.结论利用抗体库技术可不经免疫制备特异性抗SARS抗体独特型抗体,为SARS诊断及疫苗的研制奠定基础.
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MUC1黏蛋白模拟表位的筛选和鉴定
目的从噬菌体表面展示的随机12肽库中筛选出MUC1抗原的模拟表位.方法通过生物淘洗,获得阳性噬菌体克隆,通过基因测序,推导氨基酸序列,同MUC1核心序列比较,选出2个模拟表位,进行抗原表位预测和竞争抑制实验.结果筛选到的两个模拟表位与MUC1单克隆抗体的亲和力均较强,能特异性抑制MUC1的抗原抗体结合,且包含有与某些MHCⅠ类分子较好结合的位点.结论从噬菌体12肽库中筛选出两个MUC1的模拟表位可以作为靶向MUC1肿瘤疫苗的候选肽.
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重组人CD40胞外结构域在大肠杆菌中的表达和纯化鉴定
目的构建人CD40胞外结构域(exCD40)的原核表达载体,获得可溶性产物.方法以RT-PCR方法从人白细胞总RNA中扩增编码CD40胞外区的cDNA,构建羧基端融合His6标签的exCD40的原核表达载体,在大肠杆菌中表达,并对表达产物进行复性、纯化和鉴定.结果构建了exCD40的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得高表达,M,为23 000,与理论大小相符,表达产物主要存在于包涵体中,经Ni2+-NTA柱上复性和纯化获得纯度达95%的可溶性exCD40蛋白,该蛋白能与细胞上的CD40L结合.结论从大肠杆菌中成功获得具有配基结合活性的可溶性exCD40蛋白.
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人mBAFF在原核系统的可溶性表达及功能鉴定
目的利用含重组质粒pQE80L-mBAFF的DH5α大肠杆菌,优化表达B细胞活化因子的突变蛋白(mBAFF).方法研究mBAFF的体外诱导条件,包括诱导时间、IPTG浓度、诱导温度对表达量的影响.对表达条件进行优化后进行大量表达,经Ni2+NTA亲和层析和SepharcryL S200凝胶过滤层析纯化.流式检测突变蛋白与细胞结合的能力以及MTT检测突变蛋白的生物学活性.结果佳表达条件是诱导时间4 h,诱导温度37℃,IPTG终浓度0.2 mmol/L.mBAFF占菌体总蛋白的35%,蛋白纯度达98%以上,所获突变蛋白能与淋巴细胞表面受体结合,但不能刺激淋巴细胞增殖.结论优化可溶性表达后能提高mBAFF蛋白质在DH5α大肠杆菌表达,并经Ni+NTA亲和层析和SepharcrylS200凝胶过滤层析得到纯度高的表达产物,所获结果为进一步研究创造了条件.
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结核病Mtb8.4基因疫苗免疫原性的研究
由于艾滋病流行、耐药结核病及流动人口增多,有效预防和控制结核病显得极其重要[1].卡介苗(BCG)是人类预防结核病的唯一疫苗,但该疫苗存在着不足,保护效率差异大,研制新型、有效、安全的预防结核病的疫苗已成为国内外学者共同关注的一个重要课题.本研究将Mtb8.4基因疫苗肌肉注射免疫小鼠,检测其免疫原性.
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MHCⅡ类反式激活因子与病毒感染的关系
MHCⅡ类反式激活因子(ClassⅡtransactivator,CⅡTA)通过调控细胞是否表达MHCⅡ类分子及其水平而决定宿主是否对外来病毒感染产生免疫应答及其程度,从而影响病毒感染的发生、发展与转归.本文介绍了CⅡTA的结构与功能、IFNγ诱导MHCⅡ类基因表达的机制及CⅡTA分子与病毒间的相互作用.
| 年 | 期数 |
| 2018 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 12 |
| 2017 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2016 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2015 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2014 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2013 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2012 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2011 | 01 02 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2010 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2009 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2008 | 01 02 03 04 |
| 2007 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2006 | 01 02 03 04 05 06 z1 |
| 2005 | 01 02 03 04 05 06 z1 |
| 2004 | 01 02 03 04 05 06 z1 |
| 2003 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2002 | 01 02 03 04 05 06 z1 |
| 2001 | 01 02 03 04 05 06 z1 |
| 2000 | 01 02 03 04 05 06 Z1 |
| 1999 | 01 02 03 04 |
