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骨性关节炎表达谱芯片核心基因表达分析
目的 骨关节炎(OA)是骨科常见疾病,但其致病基因和相关通路尚不清楚.本研究的主要目的是筛查骨性关节炎发病的核心基因,以揭示其分子发病机制.方法 表达谱芯片GSE55235下载自GEO数据库,原始数据经生物信息学分析后得出差异基因.通过DAVID数据库对差异基因进行基因本体论和通路分析.通过STRING数据库对差异基因进行蛋白互作网络分析.结果 本研究中,共有10例骨性关节炎滑膜组织和10例健康对照组滑膜组织纳入分析.使用P＜0.05和| logFC |＞2作为阈值,我们从表达谱数据芯片GSE55235筛选出差异基因.通过蛋白互作网络分析我们筛选出骨性关节炎OA的核心基因IL-6和VEGFA.结论 IL-6和VEGFA基因可能是骨性关节炎的核心基因,这些基因和其相关通路可能是骨性关节炎分子诊断标志物和潜在的药物治疗靶点.
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用生物信息学分析预测绝经后骨质疏松症核心基因与互作miRNA的研究
目的 揭示参与绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMOP)生理病理过程的核心基因,并预测可能与之相互作用的微小核糖核酸(micro-ribonucleic acid,miRNA).方法 选取NCBI基因表达综合数据库基因芯片GSE57273,应用GEO2R和Morpheus分析软件获得差异基因(differentially expressed genes,DEGs),并通过DAVID(Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery)进行功能富集分析.应用STRING(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes)、Cytoscape和MCODE(Molecular Complex Detection)软件建立蛋白相互作用网络计算DEGs的各个连接度并分析网络集簇模块.由CyTargetLinker预测与核心基因互作的miRNA.结果 本研究共获得841个DEGs,其功能主要富集于基因表达过程,细胞大分子生物合成过程等.蛋白相互作用网络共包含523个节点与2026条连线.本研究列出了前3个集簇模块,同时筛选出10个核心基因:HSP90AA1、EP300、SMARCA2、RANBP2、ASH1L、EIF4E、PTEN、CNOT6L、RPL7、KRAS,并预测出37个miRNA可与其中7个核心基因靶向性相互作用.结论 核心基因与其相互作用的miRNA的发现可能有助于了解PMOP的病理机制,或为药物的开发提供治疗靶点.同时,通过对核心基因富集功能的鉴定为PMOP建立新的科学假说提供依据.
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HCV核心基因转染的胆管癌细胞中p53的表达及意义
目的探讨丙肝病毒感染在胆管癌中的致癌机理.方法通过分子克隆技术构建HCV-C基因重组质粒(PBK-HCVc),经酶切鉴定后,将其转染到胆管癌细胞(QBC939)中,经G418选择培养,免疫细胞学、Western blotting鉴定其表达;透射电镜观察细胞形态学改变.并用免疫细胞学检测p53的表达.结果构建的PBK-HCVc质粒在QBC939细胞中有稳定表达,透射电镜见胞质空泡内球型病毒颗粒,病毒颗粒直径50～80 nm,有外膜结构.HCV核心基因转染后QBC939细胞的p53表达比转染前明显增多(P<0.01).结论本实验为进一步探讨丙肝病毒感染在肝门部胆管癌中的致癌机理提供了理想的细胞株模型,HCV核心基因可诱发p53突变,可能与丙肝病毒感染的胆管细胞癌变有关.
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HCV核心基因转染胆管癌细胞中NF-κB的表达及意义
目的探讨丙肝病毒感染在胆管癌中的致癌机理。方法 通过分子克隆技术构建HCV-C基因重组质粒（PBK-HCVc），经酶切鉴定后，将其转染到胆管癌细胞（QBC939）中，经G418选择培，免疫细胞学、Western blotting鉴定其表达；透射电镜观察细胞形态学改变。并用免疫细胞学检测NF-Κb的表达。 结果 PCR、限制性内切酶反应证明HCV-C基因质粒构建成功,构建的PBK-HCVc 质粒经免疫细胞学、Western blotting鉴定在QBC939细胞中有稳定表达。透射电镜见胞质空泡内球型病毒颗粒，病毒颗粒直径约50-80 nm,有外膜结构。HCV核心蛋白可激活NF-Κb表达。 结论 本实验为进一步探讨丙肝病毒感染在胆管癌中的致癌机理提供了理想的细胞株模型，NF-Κb可能与丙肝病毒感染的胆管癌细胞免疫逃逸及致癌有关。
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含有丙型肝炎病毒核心基因表达质粒的构建及其基因免疫
目的:研究丙型肝炎病毒(HCV)核心(C)基因免疫诱生特异性免疫应答的可行性.方法:将HCVC基因片段插入真核表达载体pcDNA3质粒CMV启动子的下游,构建真核表达载体pcDNAHCV-C,分别转染小鼠骨髓瘤细胞SP2/0和人肝癌细胞7721进行瞬时表达,用免疫荧光法和Western-blot检测表达产物;将重组质粒注射BA LB/c(H-2d)小鼠股四头肌,ELISA法检测血清中抗体产生水平.结果:24只免疫小鼠,初次免疫2w后,血清中均出现了HCV C抗体,随着免疫次数和免疫剂量的增加,抗体滴度明显提高.结论:HCV C基因免疫能够诱导机体产生特异性的体液免疫应答,从而可能进一步诱生细胞免疫应答,成为防治HCV感染的有效方法.
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丙型肝炎病毒包膜区基因DNA免疫的研究
目的:构建丙型肝炎病毒包膜区基因(E1、E2)真核表达载体,命名为PCI-neo-E1和E2.方法:将真核重组体转染NIH-3T3细胞中,利用RT-PCR方法鉴定相应的基因片段,显示获得了相应的稳定转染的细胞克隆.提取转染细胞蛋白,进行Western Blot分析.结果:HCV E1、E2基因在真核细胞中获得有效表达.将所构建的PCI-neo-E1、E2免疫Balb/C小鼠,获得特异的抗体反应.结论:通过HCV包膜区DNA免疫的研究表明能激发特异的免疫反应,为进一步进行HCV疫苗研究奠定基础.
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胰岛素抵抗的HCV转基因鼠模型的建立
目的 建立胰岛素抵抗的丙型肝炎病毒(HCV)转基因鼠模型.方法 利用携带HCV Core稳定型表达载体,应用基因重组技术和显微注射技术,制备HCV转基因小鼠,用糖耐量试验和胰岛素耐量试验鉴定HCV转基因鼠出现胰岛素抵抗.结果 RT-PCR和Western blot结果表明成功构建了携带HCV Core转基因小鼠模型.1月龄转基因小鼠胰岛素水平明显高于正常鼠,胰岛素耐量试验异常,出现胰岛索抵抗.6月龄转基因小鼠出现肝脂肪变性.结论 成功制备胰岛素抵抗的HCV转基因鼠模型,为研究HCV核心蛋白所致胰岛素抵抗发病机制奠定了基础.
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丙肝病毒核心基因真核表达载体的构建及对胆管癌细胞生长的影响
目的探讨丙肝病毒感染在胆管癌中的致癌机理.方法通过分子克隆技术构建HCV-C基因重组质粒(PBK-HCVC),将其转染到胆管癌细胞(QBC939)中,经G418选择培养筛选阳性克隆,以PCR、Western blotting、免疫细胞学鉴定其表达.光镜及透射电镜观察细胞形态学改变.同时以裸鼠为研究对象进一步观察HCV对胆管癌细胞生长的影响.结果限制性内切酶反应证明HCV-C基因质粒构建成功.构建的PBK-HCVC质粒经PCR、Western blotting、免疫细胞学鉴定在QBC939细胞中有稳定表达.透射电镜见胞质空泡内球型病毒颗粒,病毒颗粒直径约50～80nm,有外膜结构.光镜下见HCV转染的胆管癌细胞恶性程度增加,在裸鼠中的致瘤性提高.结论丙肝病毒可感染胆管癌细胞并可能与胆管癌发生有关.
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糖尿病肾病芯片数据挖掘及生物信息学分析
目的 通过生物信息学分析方法,在分子水平探讨糖尿病肾病的发病机制,为研究糖尿病肾病提供新思路.方法 在公共数据库GEO中下载糖尿病肾病相关的芯片数据,利用在线GEO2R工具筛选出实验组与对照组之间的差异基因,用DAVID、STRING、cytoscape对差异基因进行下一步的分析.结果 通过生物信息学查询方法筛选出了差异比较大的基因98个,其中包括表达下调的12个,上调的86个和核心基因9个.差异表达基因主要涉及炎症反应、细胞黏附反应、PI3K/Akt信号通路等生物学过程.结论 通过生物信息学方法分析得出的核心基因和信号通路可为分子生物学研究提供新方向.
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乙型肝炎病毒X基因-丙型肝炎病毒C基因共表达对肝癌细胞胰岛素样生长因子-2表达的影响
目的 建立HBV X-HCV C共表达蛋白细胞表达模型,并探讨其对细胞胰岛素样生长因子-2(IGF-2)的影响.方法 双酶切质粒pXT1-X,得到完整的HBV X基因片段后,将其插入到质粒PBK-CMV和PBK-HCV C的相应酶切位点,得到重组质粒PBK-X和PBK-X-C;再将质粒PBK-CMV、PBK-X、PBK-HCV C和PBK-X-C分别导人肝癌细胞株HepG2中,G418筛选,RT-PCR、蛋白印迹鉴定HBV X和HCV C蛋白表达.流式细胞仪、蛋白印迹检测IGF-2蛋白表达.结果 质粒PBK-CMV、PBK-X、PBK-HCV C和PBK-X-C在HepG2细胞中有稳定表达.表达共表达蛋白的细胞的胰岛素样生长因子-2活性较转染空载体的细胞及单独表达HBV X-HCVC蛋白的细胞明显升高.结论 HBV X-HCV C共表达蛋白能显著上调胰岛素样生长因子-2活性,提示HBV、HCV可能具有协同致癌作用.
关键词： 乙型肝炎病毒 丙性肝炎病毒 X基因 核心基因 胰岛素样生长因子-2 -
肠致病性大肠埃希菌EPECDeng致病岛基因进化特点
目的：分析肠致病性大肠埃希菌（EPEC）致病岛（PAIs）基因进化特点。方法 EPEC Deng 分离自我国婴幼儿腹泻患者粪便标本，鉴定该菌株血清型并进行药敏试验；采用 Illumina 2000仪器对菌株进行全基因序列测序，PHAST 软件定位菌株原噬菌体（prophages，PPs）在染色体中的位置，MUMmer 软件进行共线性分析，构建系统发育树，了解同源基因进化规律。应用 PAI finder 软件对基因组进行 PAIs 预测，了解 PAIs 核心区域（LEE）和核心基因同源进化规律，并进行遗传多态性分析。结果 EPEC Deng 菌株归属 O119∶H6，药敏结果显示该菌株对环丙沙星、左氧氟沙星及氨苄西林耐药，对其余的抗菌药物均敏感。基因组（染色体）序列大小为5025482 bp （GC 含量为50．52％），质粒序列大小为207564 bp（GC 含量为49．50％）。共找到17个 PPs，系统发育树分析发现，EPEC Deng 株基因组与 O26∶H11、O111∶H 同源性较高；EPEC Deng 株 PAIs 和核心基因均与 RDEC-1和O26∶H413／89-1株具有高同源性；遗传多样性分析结果显示，紧密素（eae ）及其受体（tir）多态性丰富，π值均＞0．10，Ⅲ型分泌系统（TTSS）分泌蛋白相对稳定。结论此研究明确了 EPEC Deng 株基因组及 PAIs 的进化特点，有助于了解了本土分离的 EPEC 基因特点。
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丙型肝炎病毒核心基因靶向性M1GS核酶的构建及鉴定
目的 构建一种具有丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)靶向性的M1GS核酶,为进一步研究引导序列(guide sequence,GS)引导核酶P在RNA水平阻断HCV核心基因(core gene,C)的表达作前期基础.方法 选择HCV基因组中序列相对保守且在病毒复制过程中起关键作用的核心基因作为靶基因,针对该基因mRNA中的潜在切割位点(第52位),设计相应的引导序列及桥序列(bridge sequence).以PCR扩增M1GS,将其插入pGEM-3Z克隆载体;重组的克隆载体经EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切、测序及体外转录鉴定.结果 M1GS-HCV/C52克隆载体经双酶切、琼脂糖凝胶电泳证明插入片段与M1RNA片段大小相符;体外转录产生的M1GS-HCV/C52核酶在体外切割实验中将HCV核心基因RNA切割成2个片段,片段大小符合预期.结论 成功构建出具有体外靶向切割活性的HCV核心基因靶向性M1GS核酶.
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丙型肝炎病毒Core基因重组表达载体Pet32a-Core的构建
目的 扩增丙型肝炎病毒核心区(HCV-Core)基因,并构建HCV-Core基因的重组表达载体. 方法 设计合成HCV Core基因全长引物,提取丙型肝炎患者血清中的HCV RNA,应用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)扩增C区基因片段,用限制性内切酶BamHl和SaL1双酶切后,连接到Pet32a表达载体中,并转化到BL21大肠杆菌中;然后PCR和双酶切鉴定转化茵落. 结果 扩增得到目的 基因长度约600bp,经测序证实为HCV-Core基因,表明HCV-Core基因重组表达载体Pet32a-Core构建成功. 结论 成功构建HCV-Core基因表达载体Pet32a-Core,为下一步Core蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备奠定基础.
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乙型肝炎病毒X基因-丙型肝炎病毒C基因融合表达蛋白对肝癌细胞端粒酶活性的影响
目的建立HBV X-HCV C融合蛋白细胞表达模型,并探讨其对细胞端粒酶活性的影响.方法双酶切质粒pXT1-X,得到完整的HBV X基因片段后,将其插入到质粒PBK-CMV和PBK-HCV C的相应酶切位点,得到重组质粒PBK-X和PBK-X-C;再将质粒PBK-CMV、PBK-X、PBK-HCV C和PBK-X-C分别导入肝癌细胞株HepG2中,G418筛选,RT-PCR、蛋白印迹鉴定HBV X和HCV C蛋白表达.PCR-ELISA法检测端粒酶活性.结果质粒PBK-CMV、PBK-X、PBK-HCV C和PBK-X-C在HepG2细胞中有稳定表达.表达融合蛋白的细胞的端粒酶活性较转染空载体的细胞及单独表达HBV X、HCV C蛋白的细胞明显升高.结论HBV X-HCV C融合蛋白能显著上调端粒酶活性,提示HBV、HCV可能具有协同致癌作用.
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丙型肝炎病毒核心基因重组腺病毒的构建、鉴定与表达
目的构建HCV C基因重组腺病毒,以期用于HCV C蛋白的功能研究.方法以含有丙肝病毒1b亚型核心基因的质粒pcDNA3.1/HCV-C为模板,PCR扩增HCV C基因,PCR产物双酶切后亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,与骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌内同源重组,获得重组腺病毒质粒pAd-C,PacⅠ酶切线性化后脂质体法转染293细胞进行包装,获得重组腺病毒Ad-C,继之在293细胞内扩增,利用报告基因GFP监测病毒滴度和感染效率,Western blot检测HCV C蛋白的表达.结果PCR及Western blot结果均证实重组腺病毒Ad-C构建成功.结论成功构建了重组腺病毒Ad-C,为进一步研究核心蛋白的生物学功能奠定了基础.
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脂质转染剂增强基因疫苗诱导的免疫应答效力
目的研究脂质转染剂(LipofectAMINE)提高丙型肝炎病毒(HCV)核心(C)基因疫苗的抗病毒免疫应答效力. 方法人工构建包含HCV C基因片段的真核表达载体pcDNAHCV-C,在证实其可以在真核细胞中表达之后,将其用脂质转染剂包裹,形成LipofectAMINE-pcDNAHCV-C脂质混合物,将该混合物或单纯pcDNAHCV-C直接注射BALB/c小鼠股四头肌,以空载体pcDNA3做对照,ELISA法检测血清中抗体产生水平. 结果 12只实验组小鼠,初次免疫2 wk后,血清中均出现了HCV C抗体,而LipofectAMINE-pcDNAHCV-C混合物免疫组,抗体表达值明显高于单纯pcDNAHCV-C免疫组(P<0.05). 结论脂质转染剂可以促进基因疫苗的摄取并增强其诱导的抗病毒免疫应答的效力.
